Введение

Основной причиной смерти от сердечно-сосудистых заболеваний является ишемическая болезнь сердца. При этом сопутствующий инфаркту миокарда и инсульту атеротромбоз возникает при наличии субстрата для его развития — атеросклеротической бляшки (АСБ) в соответствующем сосудистом бассейне [1]. Триггерами формирования АСБ, развивающейся в том числе внутри стентированного сосуда [2], признаны воспаление и другие факторы риска — дислипидемия, гипертония, сахарный диабет и эндотелиальная дисфункция, ассоциированная с нарушением биодоступности основного вазодилататора — оксида азота (NO) [3, 4]. Однако исследование роли в атерогенезе белков кадгеринов, обеспечивающих кальций-зависимую межклеточную адгезию, добавляет новые аспекты в понимании механизмов нарушения барьерной функции эндотелия. Ранее показано, что повышенные уровни кадгеринов P, E, H в сыворотке крови связаны с коронарным атеросклерозом и нелетальными сердечно-сосудистыми событиями в течение 3-летнего наблюдения у пациентов с ишемической болезнью сердца [5—7]. Нарушение функции и экспрессии кадгеринов относительно хорошо изучено для различных видов рака [8—12]. Для нормально протекающего морфогенеза тканей требуются динамические подстройки межклеточных контактов [13]. Эти контакты важны для формирования стенки артерий, включая слой гладкомышечных клеток (ГМК). Напряжение сдвига инициирует миогенную регуляцию сосудистого тонуса, обеспечивающую оптимальный кровоток и защищающую сосуды от механических повреждений [13, 14]. Фенотип и функции ГМК контролируются экспрессией кадгеринов, которая нарушается при сосудистых заболеваниях. Изменение фенотипа ГМК обычно связано с патологическими процессами, приводящими к повреждению сосудов [14]. О роли кадгеринов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний известно очень немного.

Цель исследования — оценить взаимосвязь кадгеринов P, E и H с атеросклерозом периферических артерий.

Материалы и методы

Когорта пациентов

В исследуемою группу включали пациентов обоих полов, находящихся на лечении в ФГБУ НМИЦ ТПМ Минздрава России, которым выполнена процедура коронарографии в соответствии с рекомендациями Европейского общества кардиологов [15]. Показаниями к проведению коронарографии были положительная проба с физической нагрузкой, положительная стресс-эхокардиография, аритмия, стенокардия, патологические изменения на электрокардиограмме с физической невозможностью выполнения проб с физической нагрузкой или стресс-тестами или высокий индекс Дьюка. Обследование пациентов проводили, как описано ранее [16].

Диагностику атеросклероза брахиоцефальных (БЦА) и бедренных (БА) артерий выполняли с помощью дуплексного сканирования на аппарате Vivid-7 в B-режиме («GE Vingmed Ultrasound AS», Норвегия). Определяли толщину комплекса интима—медиа (ТИМ), оценивали наличие и количество АСБ, а также степень стеноза периферических артерий (%).

По степени поражения БЦА пациентов распределяли на 3 группы: БЦА-1 — атеросклеротических поражений нет (интактные БЦА); БЦА-2 — степень стеноза <60% (субклинический, или умеренно выраженный атеросклероз); БЦА-3 — степень стеноза ≥60% (выраженный атеросклероз) [17].

В зависимости от поражения БА пациентов также разделяли на 3 группы: БА-1 — АСБ нет (интактные БА); БА-2 — степень стеноза <70% (субклинический, или умеренно выраженный атеросклероз); БА-3 — степень стеноза ≥70% (выраженный атеросклероз) [18]. Градация пациентов на группы при диагностике атеросклероза БЦА и БА обоснована действующими клиническими рекомендациями Европейского общества кардиологов по ведению пациентов с заболеваниями периферических артерий (2017) [17, 18].

Критерии исключения: инфаркт миокарда в течение 6 мес до госпитализации; любое острое воспалительное заболевание; хроническая почечная недостаточность III стадии и выше со скоростью клубочковой фильтрации <60 мл/мин/1,73 м²; декомпенсированный сахарный диабет 1 или 2 типа с уровнем гликированного гемоглобина >7,5%; фракция выброса левого желудочка <40%; любое онкологическое заболевание; семейная гиперхолестеринемия; любое гематологическое заболевание; а также иммунные и аутоиммунные заболевания.

Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании, а также на сбор и биобанкирование крови. Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен независимым этическим комитетом ФГБУ НМИЦ ТПМ Минздрава России (№09-05/19).

Определение содержания кадгеринов E и H в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа

Содержание кадгерина E в сыворотке крови анализировали с использованием коммерческого набора Human E-Cadherin Quantikine ELISA («Bio-Techne Corporation R&D Systems», США) с аналитической чувствительностью (лимитом детекции) 0,056 нг/мл в соответствии с инструкцией производителя. Содержание кадгерина H в сыворотке крови анализировали с использованием коммерческих наборов Human H-Cadherin (H-Cad/CDH13) ELISA Kit («MyBioSource Inc.», Нидерланды) с аналитической чувствительностью (лимитом детекции) 0,312 нг/мл в соответствии с инструкциями производителя.

Определение содержания кадгерина P в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа

Образцы сыворотки крови приводили к одинаковой концентрации по белку и анализировали методом непрямого иммуноферментного анализа, как описано ранее [5, 6], с использованием кроличьих поликлональных антител против кадгерина P (100 мкл; 0,5 мкг/мл; «Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.», КНР) и антикроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена («Invitrogen Corporation» (США); «Thermo Fisher Scientific Inc.» (США), 100 мкл разведения 1:300 000). Поглощение измеряли при 450 нм с помощью анализатора Infinite 200 PRO («Tecan Austria GmbH», Австрия) при референсной волне 620 нм. Для построения калибровочной кривой использовали рекомбинантный человеческий кадгерин P («Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.», КНР) в концентрациях от 0,5 до 40 пг/мл. Концентрации рассчитывали по калибровочной кривой с использованием программного обеспечения Magellan («Tecan Group Ltd.», Швейцария).

Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения IBM SPSS 23.0 («IBM Corporation», США). Размер выборки оценивали с применением онлайн-калькулятора Sampsize https://sampsize.sourceforge.net/iface/s2.html#nm (доступ от 10 сентября 2022 г.).

Нормальность распределения проверяли критерием Колмогорова—Смирнова. Данные отображали в виде среднего и стандартного отклонения (M±SD). Группы сравнивали с применением двустороннего дисперсионного анализа ANOVA, критерия Бонферрони. С целью статистического изучения связи между переменными использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена, который применяли в случае, если одна из двух переменных имела порядковую шкалу либо не являлась нормально распределенной. Значимость многомерной логистической регрессии измеряли с использованием критерия Вальда (χ²). Значения p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

В исследуемую группу включено 218 пациентов (возраст 63±10,9 года, 54% мужчин), из них у 124 наблюдались атеросклеротические поражения БА (стеноз <70% n=63; стеноз ≥70, n=61); у 94 человек не было поражений БА. Количество АСБ в БА варьировало от 1 до 12; 1—2 АСБ выявлены у 54 пациентов, 3—6 АСБ — у 37, 7—12 АСБ — у 33.

Атеросклеротические поражения БЦА отмечены у 177 (стеноз <60% n=163; стеноз ≥60, n=14) человек; у 41 — не было поражений БЦА. Для анализа различий в концентрации кадгеринов между группами, дифференцированными по степени атеросклеротического повреждения БА и БЦА, проведен однофакторный дисперсионный анализ (табл. 1—4).

Таблица 1. Анализ различий в уровне кадгеринов в сыворотке крови между группами пациентов в зависимости от стеноза бедренных артерий (ANOVA)

Примечание. Здесь и в табл. 3, 5: БА — бедренные артерии.

Таблица 2. Анализ различий в уровне кадгеринов в сыворотке крови между группами пациентов в зависимости от стеноза брахиоцефальных артерий (ANOVA)

Примечание. Здесь и в табл. 4, 6: БЦА — брахиоцефальные артерии.

Таблица 3. Анализ взаимосвязи между уровнем кадгеринов в сыворотке крови и характеристикой атеросклеротических поражений бедренных артерий с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена

Таблица 4. Анализ взаимосвязи между уровнем кадгеринов в сыворотке крови и характеристикой атеросклеротических поражений брахиоцефальных артерий с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена

Из табл. 1 видно, что концентрация кадгерина E выше у пациентов с атеросклеротическим повреждением БА более 30 и 70% по сравнению с группами пациентов, у которых атеросклеротические повреждения БА были менее 30 и 70%. Между концентрациями кадгеринов P и H в указанных группах пациентов различий не наблюдалось.

Анализ различий в уровне кадгеринов в сыворотке крови между группами пациентов в зависимости от стеноза БЦА представлен в табл. 2. Статистически значимые различия в концентрации кадгеринов затронули только кадгерин E, уровень которого был статистически значимо выше у пациентов с поражением БЦА ≥30%. Других различий между группами в концентрации кадгеринов не было.

С помощью корреляционного анализа Спирмена подтверждены взаимосвязи между уровнем кадгерина E и атеросклеротическим поражением БА (см. табл. 3). Выявлена отрицательная корреляция между уровнем кадгерина P и ТИМ БА. Других взаимосвязей между атеросклеротическими поражениями БА и содержанием кадгеринов не было. Подтверждены ассоциации между уровнем кадгерина E и атеросклеротическим поражением БЦА, выявлены слабые, но статистически значимые отрицательные корреляции между уровнем кадгерина H и характеристиками, отражающими наиболее выраженные атеросклеротические поражения БЦА (см. табл. 4).

С помощью множественной логистической регрессии показано, что уровень кадгерина E вносит независимый вклад в атеросклеротические поражения БА разной степени выраженности (табл. 5). Тем же методом показано, что уровень кадгерина E вносит независимый вклад в умеренные атеросклеротические поражения БЦА, в то время как вклад в выраженные поражения БЦА, очевидно, не являлся независимым (табл. 6).

Таблица 5. Множественная логистическая регрессия для анализа взаимосвязей между уровнем кадгеринов (независимая переменная) и степенью атеросклеротического поражения бедренных артерий (бинарная переменная)

Таблица 6. Множественная логистическая регрессия для анализа взаимосвязей между уровнем кадгеринов (независимая переменная) и степенью атеросклеротического поражения брахиоцефальных артерий (бинарная переменная)

Таким образом, в ходе настоящего исследования показано, что, в отличие от кадгеринов P и H, кадгерин E напрямую связан со степенью поражения периферических артерий. С помощью статистического анализа подтверждено, что взаимосвязь кадгерина E с периферическим атеросклерозом носит независимый от других анализируемых кадгеринов характер. При этом обнаружены отрицательные корреляции кадгерина P с начальной стадией атеросклеротических повреждений БА, выраженной средней величиной ТИМ и кадгерина H с атеросклеротическими поражениями БЦА >60%, а также с величиной максимального стеноза БЦА (%).

Обсуждение

Кадгерины, кальцийзависимые гомофильные межклеточные адгезивные белки, обеспечивают структурную целостность эпителиального монослоя и тканей, участвуют в распознавании клеток и регуляции силы межклеточного контакта. В этом аспекте наиболее изучены свойства кадгерина VE [19—21]. Эндотелиальный монослой выстилает просвет сосудов и действует как селективный барьер между кровью и тканями организма. Нарушение регуляции проницаемости монослоя эндотелиальных клеток может повлечь разные патологические состояния, такие как рак, атеросклероз [22—24], воспалительные заболевания дыхательных путей, астма [25] или отек, поскольку сила адгезивных контактов между эндотелиальными клетками модулирует проникновение воды, ионов натрия, хлора, электролитов и других водорастворимых веществ массой до 20 кДа [26].

При нарушении кровотока, приводящем к изменению напряжения сдвига, происходит трансформация эндотелиальных клеток в мезенхимальные (эндотелиально-мезенхимальный переход — EMT), что приводит к ослаблению межклеточной адгезии [27]. Сообщается, что EMT связан с такими заболеваниями, как атеросклероз, диабетическая нефропатия, и играет ключевую роль в сосудистой патологии [28], поскольку, кроме всего, EMT усиливает отложение внеклеточного матрикса коллагена I, коллагена III, ламинина и фибронектина, тем самым способствуя фиброзу сосудов и образованию АСБ [29]. Участие кадгерина E в регуляции EMT убедительно доказано [30, 31]. Эти данные согласуются с результатами исследования, в котором показано, что кадгерины E и P напрямую ассоциированы со степенью атеросклеротического повреждения коронарных артерий и нежелательными сердечно-сосудистыми событиями в течение 3-летнего наблюдения [5, 6]. Кроме того, эти данные согласуются с результатами настоящего исследования, в котором показано, что кадгерин E подтвердил ассоциацию с периферическим атеросклерозом. Результаты настоящего исследования косвенно свидетельствуют о том, что высокие концентрации кадгерина E при периферическом атеросклерозе могли бы быть связаны с повреждением барьерной функции сосудистого эндотелия, обусловленной нарушением регуляции EMT, в результате которой эндотелиальные клетки трансформируются в мезенхимальные, что приводит к ослаблению межклеточной адгезии, пролиферации и миграции, вызывая повреждение сосудов [32].

Отрицательная взаимосвязь кадгерина H с периферическим атеросклерозом согласуется с таковой при коронарном атеросклерозе [5], что может свидетельствовать о протективных функциях атипичного кадгерина H в отношении формирования АСБ. Протективная функция кадгерина H может быть обусловлена активностью сигнального пути «инсулиновый рецептор/Akt», где Akt — это семейство из трех серин-треониновых киназ, Akt1, Akt2 и Akt3. Данная взаимосвязь показана в работе, в которой сообщается, что под действием инсулина наблюдали снижение секреции растворимого кадгерина H из эндотелиальных клеток человека примерно на 20% [33]. Подобное снижение не наблюдалось при ингибировании сигнального пути «инсулиновый рецептор/Akt», но не Erk [33]. Напомним, Erk (Extracellular signal-regulated kinases, внеклеточные сигнальные киназы) — это семейство протеинкиназ, принадлежащих семейству митоген-активируемых протеинкиназ MAPK, играющих важную роль в регуляции клеточного роста, пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Однако показано, что при ингибировании сигнальной регуляции PI3K/AKT/mTOR отмечали подавление образования АСБ (PI3K — фосфоинозитид-3-киназа; mTOR — mammalian Target of Rapamycin, мишень рапамицина млекопитающих) [34]. По всей видимости, снижение уровня растворимого кадгерина H, связанное с активацией сигнального пути «инсулиновый рецептор/Akt», напротив, ассоциировано с формированием АСБ. Снижение уровня растворимого кадгерина H под действием инсулина косвенно подтверждается обратной корреляцией кадгерина H и уровня глюкозы в крови [5]. При этом, согласно полученным данным, уровень глюкозы напрямую коррелировал с уровнем инсулина (коэффициент корреляции Спирмена r=0,406, p=0,0001). «Инсулиновый рецептор/Akt» — это универсальный внутриклеточный сигнальный путь PI3K/Akt/mTOR, который опосредует сигналы от множества рецепторов, включая рецепторы инсулина, цитокинов, адипокинов и других гормонов, регулирующих фенотип макрофагов, их выживание, миграцию и пролиферацию [35—37]. Эти наблюдения указывают на ценность пути PI3K/Akt как терапевтической мишени.

Таким образом, прямая взаимосвязь между уровнем кадгерина E и периферическим атеросклерозом может быть обусловлена нарушением регуляции EMT, приводящей к ослаблению межклеточной адгезии, клеточной пролиферации и миграции, что в свою очередь вызывает повреждение сосудов и образование АСБ. При этом взаимосвязь между сниженным уровнем кадгерина H и периферическим атеросклерозом может быть обусловлена активацией сигнального пути «инсулиновый рецептор/Akt», ассоциированного с формированием АСБ.

Заключение

В результате исследования показано, что кадгерин E напрямую связан с периферическим атеросклерозом. Обратная взаимосвязь с периферическим атеросклерозом показана для кадгерина H и в единичном случае для кадгерина P. Изучение механизмов, контролирующих сосудистую проницаемость, необходимо для разработки терапевтических стратегий лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Гуманова Н.Г.; сбор и обработка материала — Васильев Д.К., Богданова Н.Л.; статистический анализ данных — Гуманова Н.Г.; написание текста — Гуманова Н.Г., Васильев Д.К., Богданова Н.Л.; научное редактирование — Гуманова Н.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: study design and concept — Gumanova N.G.; data collection and processing — Vasilyev D.K., Bogdanova N.L.; statistical analysis — Gumanova N.G.; text writing — Gumanova N.G., Vasilyev D.K., Bogdanova N.L.; scientific editing — Gumanova N.G.