Биомаркеры воспаления и их ассоциации с уровнем индекса ω-3 полиненасыщенных жирных кислот в крови мужчин с коронарным атеросклерозом

За последние 20 лет интерес к полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК) не только не ослабевает, а все больше возрастает. Это обусловлено тем, что ПНЖК принимают участие во многих жизненно важных процессах организма [1]. Существует два типа незаменимых жирных кислот (ЖК), которые принадлежат к семействам омега-3 (ω-3) и омега-6 (ω-6) ПНЖК [2]. В организме ω-3 ПНЖК в основном присутствуют в виде эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой (ДГК) кислот, и в меньшей степени — в виде докозапентаеновой кислоты (ДПК) [3]. ЭПК и ДГК синтезируются из α-линоленовой кислоты (АЛК) in vivo. Являясь наиболее важными ω-3 ПНЖК, модифицирующими экспрессию генов и противовоспалительные процессы, они играют существенную роль в предотвращении атеросклероза [3, 4]. Что касается ω-6 ЖК, то эти ПНЖК менее изучены, чем ω-3 ПНЖК.

Интересно, что между ω-6 и ω-3 ЖК возникает конкуренция за ферменты десатурации. Как десатураза-5, так и десатураза-6 ЖК предпочитают АЛК линоленовой кислоте [5, 6]. Однако высокое содержание ω-6 ПНЖК начинает препятствовать десатурации и удлинению АЛК, при этом увеличивая синтез арахидоновой кислоты (АРК) из линолевой. При употреблении рыбы или рыбьего жира, ЭПК и ДГК частично заменяют ω-6 ПНЖК, особенно АРК в мембранах, вероятно, всех клеток [7].

Большое количество исследований показало, что избыток жира в организме в зрелом возрасте связан с неблагоприятными уровнями адипокинов и маркеров воспаления, таких как адипонектин, лептин, С-реактивный белок (СРБ) и интерлейкин 6 (ИЛ-6) [8—10]. Более того, чем дольше человек страдает ожирением в подростковом и зрелом возрасте, тем наиболее неблагоприятный уровень адипокинов и маркеров воспаления наблюдается в возрасте 60 лет [9, 10]. В некоторых исследованиях сообщается, что потеря массы тела с помощью диеты связана со снижением содержания ИЛ-6, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), СРБ и других маркеров воспаления в крови независимо от возраста, пола и индекса массы тела [11, 12]. Точно так же уменьшение массы тела, наблюдаемое при изменении рациона питания, показывает снижение уровней СРБ и ИЛ-6 [13].

Исследования по влиянию ω-3 ПНЖК на организм человека показывают, что ω-3 ПНЖК напрямую не способствуют снижению массы тела, но они могут предупреждать ее увеличение и метаболические изменения, связанные с ожирением, включая регуляцию выработки адипокинов [14].

Цель исследования — изучить влияние дефицита ω-3 ПНЖК на уровни маркеров воспаления, адипокинов и показателей системы свертывания крови у пациентов с коронарным атеросклерозом.

Дизайн исследования — одномоментное обсервационное исследование. Исследование проведено в рамках совместных научных исследований НИИТПМ — филиала ИЦГ СО РАН и ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России. Исследование одобрено локальными этическими комитетами обоих учреждений. Собраны данные и получены образцы крови после оформления письменного информированного добровольного согласия всеми участниками исследования.

В исследование включены 60 мужчин в возрасте 40—70 лет с атеросклерозом коронарных артерий, верифицированным по данным коронароангиографии, без острого коронарного синдрома (ОКС), со стабильной стенокардией напряжения II—III функционального класса, госпитализированных в клинику ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России для проведения коронарного шунтирования.

Критерии включения на этапе предварительного отбора пациентов: мужской пол; диагноз ишемическая болезнь сердца (ИБС), верифицированная по данным коронароангиографии; наличие в анамнезе перенесенного инфаркта миокарда (ИМ) или эпизодов стабильной стенокардии напряжения, подтвержденных описанием клинической картины заболевания, результатами электрокардиографии и биохимических анализов крови.

Критерии исключения на этапе предварительного отбора пациентов: женский пол; наличие ОКС давностью менее 6 мес до поступления (нестабильная стенокардия или ИМ); клинически значимая тяжелая сопутствующая патология в острой или стадии обострения (хронические инфекционно-воспалительные заболевания, почечная недостаточность, дыхательная недостаточность, печеночная недостаточность); известные активные онкологические заболевания; гиперпаратиреоз; токсическое поражение тяжелыми металлами.

Перед операцией выполняли забор биологического материала (кровь). Биохимические исследования проводили в лаборатории клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний НИИТПМ — филиал ИЦиГ СО РАН.

У пациентов с верифицированным коронарным атеросклерозом (КА) изучали уровни маркеров воспаления (СРБ, ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8), адипокинов (лептин, адипонектин, резистин) и антитромбина III. Концентрацию общего холестерина (ОХС), триглицеридов и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяли энзиматическими методами с использованием наборов «Thermo Fisher Scientific» на биохимическом анализаторе «Konelab Prime 30i» («Thermo Fisher Scientific», Финляндия). Уровни липопротеинов низкой плотности ЛПНП рассчитаны с использованием формулы Фридвальда. Методами иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартных тест-систем ELISA на ИФА-анализаторе MultiscanEX («Thermo Labsystem», Финляндия) определяли биомаркеры воспаления (ФНО-α), ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 («Bender Medsystems», Австрия), СРБ («Biomerica», США); резистин («Mediagnost», Германия), адипонектин («Mediagnost», Германия), лептин («Diagnostic Biochem Canada Inc.», Канада). В плазме крови определяли уровень антитромбина III (тест-системы AssayPro).

Определение качественного и количественного состава ЖК проводили в лаборатории экологических исследований и хроматографического анализа ФГБУН Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН. Во всех образцах после экстракции и метанолиза изучали состав ЖК методами высокоэффективной капиллярной газожидкостной хроматографии на хроматографе AT 6890N («Agilent Technologies», США) с пламенно-ионизационным детектором и хромато-масс-спектрометрии на хроматографе АТ 6890N с масс-селективным детектором АТ 5975N. Кроме того, определяли индекс ω-3 ПНЖК как суммарное содержание ЭПК и ДГК.

В ходе изучения жирно-кислотного состава крови у пациентов с КА выявлено снижение относительного содержания ω-3 ПНЖК [15], уровень индекса ω-3 составлял ПНЖК ≤4%. В зависимости от значений индекса ω-3 ПНЖК пациенты с КА разделены на группы: 1-я группа — 26 человек с индексом ω-3 ПНЖК от 2% до 4%, средний возраст составил 59,38±6,96 года; 2-я группа — 34 человека с индексом ω-3 ПНЖК менее 2%, средний возраст — 59,47±7,79 года. В табл. 1 представлены начальные характеристики пациентов в зависимости от уровня индекса ω-3 ПНЖК.

Таблица 1. Характеристика пациентов в зависимости от уровня индекса ω-3 полиненасыщенных жирных кислот

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения M±SD, а также в виде относительных (%) частот. ИМ — инфаркт миокарда; ОХС — общий холестерин; ЛПВП — липопротеины высокой плотности; ЛПНП — липопротеины низкой плотности.

Полученные результаты статистически обработаны с использованием программного пакета SPSS 16.0. Для оценки характера распределения признаков применен тест Колмогорова—Смирнова. Сравнительное исследование клинико-анамнестических характеристик в группах проводили с помощью t-критерия Стьюдента. В тексте данные характеристики признаков представлены в виде средней арифметической величины (M) и стандартного отклонения (SD). При нормальном распределении расчеты проводили с использованием теста ANOVA. В случае ненормального распределения применяли непараметрический U-критерий Манна—Уитни (для двух независимых групп) и критерий Краскела—Уоллиса. Для анализа зависимости количественных признаков выборочных данных из совокупностей использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (r_s), в случае номинальной и порядковой шкалы данных — перекрестные таблицы данных и критерий χ² Пирсона с поправкой на вероятность (для расчета ORs). Уровень значимости установлен на уровне p<0,05.

В табл. 2 представлено распределение уровней окислительных и воспалительных медиаторов в крови пациентов, отличавшихся по значению индекса ω-3 ПНЖК. Установлено, что у пациентов 2-й группы по сравнению с пациентами 1-й группы содержание лептина было выше в 2,5 раза, ИЛ-6 — в 4,7 раза и ИЛ-8 — в 3,4 раза. Кроме того, выявлено снижение уровня СРБ в 4,5 раза и антитромбина III в 1,4 раза.

Таблица 2. Содержание окислительных и воспалительных медиаторов в крови пациентов в зависимости от уровня индекса ω-3 полиненасыщенных жирных кислот

Примечание. СРБ — С-реактивный белок; ФНО-α — фактор некроза опухоли-α; ИЛ — интерлейкин.

Для оценки взаимосвязи изменений биохимических показателей в зависимости от уровня ω-3 ПНЖК (АЛК, ДГК, ДКП, ЭКП) проведен попарный корреляционный анализ. Наиболее выраженные обратные корреляционные связи установлены между содержанием ДКП и ДГК с уровнем лептина, ИЛ-6, а прямая связь — с уровнем антитромбина III. Содержание ЭКП прямо корреллировало с уровнем антитромбина III. Содержание АЛК обратно коррелировало только с уровнем ИЛ-8.

Для оценки вероятности низкого уровня индекса ω-3 ПНЖК в зависимости от содержания показателей окисления и воспаления использовали логистический регрессионный анализ (табл. 3). В качестве зависимой переменной применяли индекс ω-3 ПНЖК ≤4% по отношению к индексу ω-3 ПНЖК >4%. Все изученные нами показатели использовались в качестве независимых переменных.

Таблица 3. Логистический регрессионный анализ вероятности низкого содержания ω-3 полиненасыщенных жирных кислот в зависимости от изучаемых параметров

Результаты показали, что увеличение содержания лептина, ИЛ-8 и снижение уровня антитромбина III в крови связаны с относительным риском низкого содержания ω-3 ПНЖК в крови.

Индекс ω-3 ПНЖК является объективным показателем эндогенных уровней ω-3 ПНЖК, особенно для ЭПК и ДГК. На основании эпидемиологических и экспериментальных данных предложено интерпретировать значение индекса ω-3 ПНЖК выше 8% как оптимальное, ассоциированное с низким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, уровень ниже 4% — как нежелательный, в качестве индикатора повышенного риска развития ИБС [16]. В настоящее время его можно использовать не только для оценки исходного уровня ω-3 ПНЖК или ответа на терапию ω-3 ПНЖК, но и как клиническую цель для снижения риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, а при постоянном использовании в клинических испытаниях — облегчить интерпретацию и сопоставимость будущих исследований [1].

Для пациентов с ИБС и КА характерен низкий уровень ПНЖК, а, следовательно, низкий индекс ω-3 ПНЖК [17]. Наши результаты согласуются с данными литературы. Так, A. Alfaddagh и соавт. установили, что чем ниже индекс ω-3 ПНЖК (<3,43%), тем выше риск прогрессирования коронарных бляшек, несмотря на терапию статинами [18]. Согласно данным J. Song и соавт., пропорции ω-3 ПНЖК, особенно ДГК в сывороточных фосфолипидах, значительно ниже у пациентов с ИБС и особенно у пациентов с метаболическим синдромом [19].

Основной задачей настоящего исследования было сопоставление индекса ω-3 ПНЖК с уже известными предикторами сердечно-сосудистых заболеваний. ПНЖК, в частности ДГК и ЭПК, значительно снижают ключевые регуляторы транскрипции цитокинов из циркулирующих иммунных клеток, тем самым ослабляя выработку воспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-6 [20]. ЭПК и ДГК в исследовании in vitro показали влияние на модуляцию ИЛ-6 и ФНО-α в макрофагах, обработанных липополисахаридами. Секреция ИЛ-6 была ослаблена в клетках, обработанных ДГК, по сравнению с клетками, обработанными ЭПК, тогда как клетки, обработанные ЭПК, секретировали значительно меньше ФНО-α по сравнению с контрольными и обработанными ДГК клетками. Эти данные свидетельствуют о том, что ДГК более эффективна, чем ЭПК, в снижении секреции ИЛ-6, тогда как ЭПК, по-видимому, оказывает большее влияние на модуляцию ФНО-α [21].

В другом исследовании in vitro изучено влияние ПНЖК на секрецию адипонектина и лептина в адипоцитах [22]. Адипоциты инкубировали в течение 24 часов с ЭПК, ДГК или АРК в сочетании с ДГК в различных концентрациях. ω-3 ПНЖК, ЭПК и ДГК увеличивали секрецию адипонектина после 24 ч инкубации, тогда как они не оказывали какого-либо существенного влияния на секрецию лептина.

Однако только ДГК в отдельности и в сочетании с АРК оказывали мощное противовоспалительное действие в физиологических условиях, что выражалось в снижении уровня ФНО-α [22]. Эти результаты подтвердили предыдущие наблюдения, полученные в адипоцитах, демонстрирующих противовоспалительные свойства ω-3 ПНЖК в жировой ткани [23]. В исследовании определено дифференциальное влияние ЭПК на экспрессию и секрецию ИЛ-6. Повышение уровня ЭПК значительно снижало уровень ИЛ-6 и других адипокинов. Проверено, участвует ли провоспалительный фактор транскрипции — ядерный фактор-KB (ЯФ-KB) в регуляции адипокинов ПНЖК. ЭПК значительно ингибировал активацию ЯФ-KB по сравнению с контролем. Более того, ЭПК ослаблял ФНО-α и дополнительно снижал его секрецию в присутствии ингибитора ЯФ-KB. В исследовании E.J. Baker и соавт. ЭПК и ДГК значительно снижали выработку моноцитарного хемоаттрактантного белка 1, ИЛ-6 и ИЛ-8 [24]. Эти исследования подтвердили прямое противовоспалительное действие ω-3 ПНЖК и благотворное влияние на воспаление адипоцитов и нарушение обмена веществ, такие как метаболический синдром. Данные согласуются с полученными нами результатами о более высоких уровнях ИЛ-6, ИЛ-8, а также лептина у пациентов с дефицитом ω-3 ПНЖК.

Все эти наблюдения подчеркивают важность богатой ПНЖК диеты для значительного снижения факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома. Кроме того, различные исследования на людях продемонстрировали благотворное влияние приема ПНЖК на противовоспалительные процессы.

В некоторых исследованиях показано снижение уровня СРБ при приеме добавок с ω-3 ПНЖК [25, 26]. Однако в исследовании с участием пациентов после перенесенного ИМ выявлено, что длительное добавление умеренных доз ЭПК и ДГК не влияло на их уровень [27]. В дизайне поперечного сечения M.A. Micallef и соавт. пациенты с самыми высокими концентрациями высокочувствительного СРБ (≥3,0 мг/л) имели более низкие концентрации ω-3 ПНЖК [28]. Уровень СРБ положительно связан с курением, диабетом, низкой физической активностью, гипертонией и ожирением. Метаанализ с использованием менделевского метода рандомизации не выявил доказательств причинно-следственной связи между генетически повышенным уровнем СРБ и сердечно-сосудистой смертностью среди почти 200 000 участников [29]. Скорее всего, повышенный уровень СРБ отражает лежащее в основе атеросклероза низкоинтенсивное воспаление. Результат настоящего исследования (высокие уровни СРБ у пациентов с индексом ω-3 ПНЖК от 2 до 4%) может быть объяснен относительно низкими базальными уровнями СРБ в нашей исследуемой популяции из-за применения современных методов коррекции факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, сопутствующей статинотерапии.

Антитромбин III — поливалентный ингибитор сериновых протеиназ (тромбин, факторы Xa, IXa, XIa, XIIIa и калликреин) каскадно-ферментной системы свертывания крови и фибринолиза. При умеренном снижении антитромбина III (55—70% от нормы) тромбообразование наблюдается редко, но существенно возрастает риск развития тромбов и инфаркта при наличии предрасполагающих факторов — гиперлипидемии, ожирения, диабета, сердечной недостаточности и прочее. Здоровый эндотелий предотвращает активацию каскада коагуляции за счет экспрессии тромбомодулина (активирует белок C) и гепаринсульфата (индуцирует антитромбин III), которые снижают выработку тромбина (основной индуктор фибрина и мощный активатор тромбоцитов) [30]. Исследования связи между антитромбином и артериальным тромбозом показали противоречивые результаты. В исследовании K. Vanschoonbeek и соавт. оценен вклад плазменных (анти)коагулянтных факторов и различия в генерации тромбина на фоне приема ω-3 ПНЖК. Сравнение значений до вмешательства у испытуемых показало, что уровни протромбина и антитромбина служили основными детерминантами эндогенного потенциала тромбина [31]. В нашем исследовании уровни антитромбина III были в 1,4 раза ниже у пациентов с индексом ω-3 ПНЖК менее 2% на фоне ИБС. Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что индекс ω-3 ПНЖК можно использовать в качестве индикатора терапевтических заболеваний воспалительного генеза и повышенного риска развития ИБС.

В настоящем исследовании не учитывалось количество поступления в организм ω-3 полиненасыщенных жирных кислот с пищей. Поэтому исследования должны быть продолжены в более крупном формате с учетом различных ковариат питания (например, потребление рыбы), что позволит включить эти данные в модель.

Таким образом, у мужчин с атеросклерозом коронарных артерий выявлено снижение общего содержания ω-3 полиненасыщенных жирных кислот и уровня индекса ω-3 полиненасыщенных жирных кислот <4%, ассоциированное с маркерами воспаления (ИЛ-6, ИЛ-8, C-реактивный белок), а также с показателями свертывающей системы крови (антитромбин III). Кроме того, чем ниже индекс ω-3 полиненасыщенных жирных кислот, тем выше относительный риск увеличения содержания лептина, ИЛ-8 и снижения уровня антитромбина III. Наши результаты подчеркивают потенциальную важность измерения уровней ω-3 жирных кислот, в частности индекса ω-3 полиненасыщенных жирных кислот, в крови в рутинной клинической практике.

Мужчинам с ишемической болезнью сердца необходимо проводить комплекс мероприятий для увеличения и сохранения индекса ω-3 полиненасыщенных жирных кислот ≥4%, что, вероятно, позволит снизить риск развития осложнений коронарного атеросклероза.

Финансирование: Рег. №122031700094-5 «Эпидемиологический мониторинг состояния здоровья населения и изучение молекулярно-генетических и молекулярно-биологических механизмов развития распространенных терапевтических заболеваний в Сибири для совершенствования подходов к их диагностике, профилактике и лечению».

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Е.В. Стрюкова, В.С. Шрамко; сбор и обработка материала — Я.В. Полонская, Е.В. Каштанова, В.С. Шрамко; статистический анализ данных— Е.М. Стахнева, Е.В. Стрюкова; написание текста — В.С. Шрамко, Е.В. Стрюкова; редактирование — Ю.И. Рагино, Е.В. Каштанова.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.