Введение

Рак молочной железы (РМЖ) — наиболее часто встречающаяся онкологическая патология у женщин в Российской Федерации. В 2020 г. зарегистрирован 64 951 случай заболевания РМЖ, что составило 21,7% от количества всех злокачественных заболеваний у женщин [1]. В настоящее время стандартом лечения РМЖ является комбинация хирургического вмешательства, лучевой и медикаментозной терапии. Благодаря достижениям в области ранней диагностики, а также в лечении данного заболевания 5-летняя выживаемость пациентов значительно увеличилась. Терапевтические подходы в настоящее время в большей степени основаны на клинических и патологических особенностях данного заболевания, дополненных статусом гормональных рецепторов и генов семейства эпидермального фактора роста (HER2-related genes), а также генов, определяющих пролиферативную активность опухолевых клеток. Идентификация молекулярно-генетических и иммуногистохимических особенностей опухоли позволяет направлять терапию, выявляя пациентов групп риска, которым требуется дополнительное лечение или более тщательное наблюдение [2]. Однако даже самые передовые методы лечения не могут полностью устранить риск рецидива и метастазирования РМЖ, что связано с действием множества молекулярных факторов в опухоли, биологическую роль которых еще предстоит изучить.

Биобанкирование играет большую роль в изучении рака, поскольку создание специализированных биобанков позволяет не только облегчить процесс набора образцов, но и получить аннотированные данные, что важно для проведения крупномасштабных исследований. Дополнительным преимуществом является то, что образцы собираются единообразно в соответствии со стандартными операционными процедурами (СОП), а работа биобанков регулируется этическими комитетами.

На территории Российской Федерации с 2018 г. функционирует Национальная ассоциация биобанков и специалистов по биобанкированию, которая объединяет 27 биобанков. В настоящее время на территории нашей страны нет биобанка, который был бы ориентирован исключительно на создание коллекции образцов, полученных от больных РМЖ. Вместе с тем в Северной и Южной Америке, Европе, Азии, Австралии создан целый ряд специализированных биобанков РМЖ, которые работают не только как отдельные биобанки, но и в составе консорциумов. Одним из старейших биобанков РМЖ является Банк опухолей молочной железы NCIC-Manitoba в Канаде, который создан в январе 1993 г. для поддержки исследований РМЖ [3].

В качестве примера работы биобанка можно привести австралийский банк тканей РМЖ (ABCTB), основанный в 2005 г. как некоммерческая организация с открытым доступом, который предоставляет биологические образцы не только для национальных, но и для международных исследовательских проектов по изучению РМЖ. Так, с использованием образцов геномной ДНК, предоставленных биобанком, а также Поморским медицинским университетом (Республика Польша), исследована распространенность мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у пациентов с тройным негативным РМЖ. Показано, что примерно 10% пациентов с данной патологией имеют мутацию в гене BRCA1 или BRCA2, что подчеркивает важность генетического тестирования вне зависимости от возраста и семейного анамнеза. На основании полученных результатов авторы рекомендовали проведение дополнительного генетического тестирования, позволяющего выявить членов семьи, которым может понадобиться профилактическое вмешательство, а также помогающего в выборе тактики лечения больных РМЖ [4].

Одним из примеров использования коллекции замороженных образцов является создание препарата Герцептин. В 80-е годы прошлого века в результате анализа 200 замороженных образцов тканей выявлено, что амплификация гена HER-2 коррелирует с неблагоприятным прогнозом развития опухоли, что в конечном итоге привело к разработке моноклонального антитела (Герцептин), направленного на противодействие опухолевым клеткам с усиленной экспрессией гена HER-2 [5].

В настоящее время общепризнана важность доступа к биологическим образцам высокого качества для трансляционных исследований. С этой целью в 2015 г. на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России (Ростов-на-Дону) основан биобанк. С 2019 г. биобанк является членом Национальной ассоциации биобанков и специалистов по биобанкированию (НАСБИО). Коллекции биобанка бесперебойно пополнялись с момента его основания и формировались в зависимости от задач и проектов ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России [6].

Цель исследования — создать коллекцию образцов опухолевых и условно-здоровых тканей больных РМЖ для изучения молекулярных механизмов, которые потенциально могут вызывать резистентность к выбранной терапии, а также для более глубокого изучения молекулярной гетерогенности метастазирующего РМЖ.

Материал и методы

При создании коллекции образцов РМЖ сотрудники биобанка руководствовались СОП. В проект включены пациенты, получавшие лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России по поводу РМЖ в период с января 2021 г. по март 2022 г., подписавшие информированное добровольное согласие на передачу биологического материала в Биобанк, а также соответствующие следующим критериям:

1) возраст старше 18 лет;

2) наличие гистологической верификации опухолевого процесса;

3) отсутствие неоадъювантного химиолучевого лечения в анамнезе;

4) отсутствие инфекций, передающихся через кровь (ВИЧ, сифилис, гепатиты).

Выборка сформирована путем серийного отбора пациентов. Получение образцов производилось в течение ряда периодов длительностью 10—15 дней от всех пациентов, которым проводили операцию по удалению опухоли молочной железы. Забор материала производил врач-хирург в операционном блоке в ходе операции по резекции органа. Операционный материал на сухом льду, а также сопроводительная документация (информированное добровольное согласие пациента и выписка из истории болезни) транспортировались дежурной медицинской сестрой в патолого-анатомическое отделение не позднее, чем через 10—20 мин после резекции органа.

Врач-патологоанатом производил вырезку двух образцов опухолевой ткани, а также двух — условно-здоровой ткани, находящихся на максимальном удалении от опухолевой, размер каждого 0,5×0,5×0,5 см. Образцы ткани помещали в криопробирки, содержащие уникальный штрих-код на боковой поверхности пробирки и 2D-штрих-код на дне. Криопробирки помещали в сосуд Дьюара с жидким азотом, после чего транспортировали в Биобанк для долгосрочного хранения в парах жидкого азота при температуре от –150 до –196 °C.

Последовательность действий при криоконсервации тканей представлена на рис. 1 на цв. вклейке.

Рис. 1. Последовательность процесса криоконсервации тканей.

Учет и паспортизацию образцов производили с использованием специализированного программного обеспечения FreezerPRO (RuRo), которое представляет собой визуальную базу данных, а также таблиц Excel, что позволит использовать имеющиеся данные для последующего анализа (рис. 2 на цв. вклейке).

Рис. 2. Аннотированное описание образца в программе FreezerPro.

Для криоконсервации биообразцов использовали оборудование «Custom BioGenic Systems, Inc.» (США), которое предназначено для хранения образцов в парах жидкого азота при температуре до –196 °C.

Результаты

Работа по составлению коллекции образцов тканей больных РМЖ продолжается. По состоянию на март 2022 г. в коллекцию биоматериала больных РМЖ депонированы и верифицированы свежезамороженные образцы опухолевой и условно-здоровой ткани от 350 пациентов. Средний возраст пациентов, образцы которых включены в коллекцию, составил 58,7±0,62 года (рис. 3).

Рис. 3. Распределение пациенток по возрастным группам согласно рекомендациям ВОЗ.

В нашей выборке присутствовали только женщины, поскольку частота выявления данной патологии у мужчин составляет <1% всех случаев РМЖ [7]. Согласно опросу, а также визуальному осмотру, абсолютное большинство пациенток определяли свою принадлежность к европеоидному типу (рис. 4).

Рис. 4. Распределение пациенток в зависимости от национальной принадлежности.

При этом подавляющее большинство (69,7%) пациенток прибыли на лечение из Ростовской области, в 9,5 раз меньшее число (7,1%) — из Республики Дагестан, Ставропольского края (5,1%). Кроме того, в центре получали лечение жители Чеченской Республики (2,6%), Краснодарского края (4,0%), Кабардино-Балкарской Республики (2,9%), Республики Северная Осетия — Алания (2,6%), Карачаево-Черкесской Республики (2,0%), Республики Калмыкия (1,7%), из Челябинской, Амурской областей, из Республики Крым, Республики Армения, Республики Ингушетия (по 0,3%), а также Калининградской (0,3%), Московской (0,6%) и Амурской (0,3%) областей (рис. 5).

Рис. 5. Распределение пациенток в зависимости от региона проживания.

В коллекции образцов, представленной в нашем биобанке, превалирующее количество получено от пациенток со II стадией заболевания (80,9%), РМЖ I стадии диагностировали в 10,9% случаев, III стадии — в 8%, IV стадии — в 0,3% (рис. 6).

Рис. 6. Распределение пациенток в зависимости от стадии заболевания.

Для определения гистологической формы опухоли руководствовались международной гистологической классификацией, разработанной Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2019 г. [8]. Распределение пациенток согласно гистологической классификации представлено в таблице: наглядно продемонстрировано преобладание (80,6%) инвазивной неспецифицированной карциномы у пациентов с диагностированным РМЖ.

Распределение пациенток в зависимости от гистологической классификации опухоли

Распределение пациентов в зависимости от классификации TNM представлено на рис. 7. Наибольшее число пациенток пришлось на T2N0 и 1M0, составив 182 (52%) и 82 (23,4%) случая.

Рис. 7. Диаграмма распределения пациенток в зависимости от TNM классификации опухоли.

Основываясь на результатах об уровне экспрессии эстрогеновых и прогестореновых рецепторов, HER2/neu, маркера клеточной пролиферации Ki67, а также степени злокачественности, выделяют 5 типов РМЖ: Люминальный A, Люминальный B (HER2-положительный), Люминальный B (HER2-отрицательный), Нелюминальный HER2-положительный, а также Базальноподобный (трижды негативный). Распределение пациентов согласно подтипам РМЖ представлено на рис. 8.

Рис. 8. Диаграмма распределения пациенток в зависимости от молекулярно-биологических подтипов рака молочной железы.

Представленная диаграмма наглядно демонстрирует преобладание Люминального A (43%) подтипа РМЖ, 35% пациентов имели HER2-отрицательный Люминальный B подтип. Реже встречаются Базальноподобный (11%), Люминальный B HER2-положительный (8%), а также Нелюминальный HER2-положительный (3%) подтипы РМЖ.

Обсуждение

РМЖ является наиболее часто диагностируемым видом рака (примерно 2,3 млн новых случаев ежегодно) и основной причиной смерти от рака среди женщин во всем мире. Самые высокие показатели заболеваемости отмечаются в Австралии, Новой Зеландии, Западной и Северной Европе, Северной Америке, тогда так самые низкие — в Центральной Америке, Восточной и средней Африке, Южной и Центральной Азии. Считается, что это связано с более высокой распространенностью репродуктивных и гормональных факторов риска (например, более поздний возраст наступления менопаузы), факторов риска, связанных с образом жизни (например, употребление алкоголя, избыточная масса тела, отсутствие физической активности), а также с распространенностью маммографического скрининга. Важное место в риске возникновения РМЖ занимают предрасполагающие наследственные генетические мутации [9].

Согласно данным Московского научно-исследовательского института им. П.А. Герцена — филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России, по состоянию на 2020 г. среди больных в России с впервые установленным диагнозом РМЖ I стадии выявлен в 26,9% случаев; II стадии — в 44,7%; III стадии — в 19,6%; запущенный опухолевый процесс (IV стадия) определен в 8,1% случаев [10]. В результате нерандомизированного отбора биологического материала в биобанк получено сходное распределение по стадиям заболевания: РМЖ выявлен преимущественно на II стадии заболевания.

Q. Wang и соавт. (2022) в своем исследовании, участницами которого стали 492 женщины с впервые установленным диагнозом РМЖ, показали, что в 36% случаев данная патология выявлена у женщин 60—69 лет, в 27% — 50—59 лет, в 19,1% — младше 50 лет и в 17,9% — старше 70 лет [11], что также согласуется с нашими данными. Многие авторы акцентируют внимание на важности возраста пациенток на момент установления диагноза [12], что в первую очередь связано с их гормональным статусом. Так, О.И. Кит и соавт. (2014) при изучении гетерогенности люминального РМЖ у женщин с различным репродуктивным статусом показали, что интенсивность опухолевого процесса связана с увеличением содержания более «агрессивного» 16-ОН эстрона по сравнению с «физиологическим» 2ОН-эстрогеном у молодых пациенток [13]. Различия в уровне половых гормонов, вероятно, также являются причиной преобладания люминального B-подтипа с положительными гормональными рецепторами в младших возрастных группах по сравнению с женщинами в менопаузе [14]. В.М. Перельмутер и соавт. (2008) выявили генетические и клинико-морфологические различия карцином молочной железы, возникающих в пре- и менопаузальном периодах. Показано, что у больных в менопаузе фенотипический дрейф морфологического строения обусловлен процессами, происходящими в периоде развития опухоли, в то время как в пременопаузальном периоде морфологическое строение не связано с периодом роста опухоли и, вероятно, обусловлено генетическими изменениями, которые происходят в процессе онкогенеза или существуют в геноме пациентки изначально [15].

ВОЗ классифицирует эпителиальные опухоли молочной железы на несколько гистологических подтипов, которые первоначально определялись их уникальными цитологическими и архитектурными особенностями. Среди них наиболее распространенным гистологическим типом РМЖ является инвазивная карцинома молочной железы неспецифицированная, также известная как инвазивная протоковая карцинома, на долю которой приходится порядка 70—80% всех случаев РМЖ [12], что также фиксируется в ряде исследований. Так, в исследовании В.Е. Плотниковой и соавт. (2013), посвященном изучению факторов риска метастатического поражения головного мозга при РМЖ, отмечали, что в 80% случаев у пациентов диагностировали инфильтрующий протоковый гистологический тип рака (в исследовании приняли участие 134 пациента) [16]. В нашем исследовании подавляющее количество случаев также приходилось на инвазивные карциномы: инвазивная неспецифицированная карцинома диагностирована в 80,6% случаев.

По мере развития онкологии с внедрением молекулярно-генетических методов в диагностику РМЖ гистологическая классификация дополнена молекулярно-генетической, которая позволила существенно улучшить прогнозирование течения заболевания и подбирать более эффективную тактику лечения. В настоящее время для выявления пациентов групп риска, нуждающихся в дополнительном лечении, и оценки чувствительности к определенным видам лечения, помимо стандартного гистологического исследования, в образцах опухоли определяют уровень экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, рецептора HER2/neu, а также индекс пролиферативной активности по экспрессии Ki-67 [17]. В частности, в работе Е.Ю. Златник и соавт. (2020) показана прогностическая значимость ИГХ-маркеров для оценки выживаемости пациентов с люминальным B HER-отрицательным РМЖ в постменопаузе [18]. Лечение метастатического гормонозависимого HER2-отрицательного РМЖ в большинстве случаев предполагает применение различных линий эндокринотерапии, что позволяет увеличить показатели общей и безрецидивной выживаемости пациентов при сохранении высокого качества жизни. Так, Л.Ю. Владимирова и соавт. (2020) описывают клинический случай гормонпозитивного HER2-отрицательного РМЖ. У пациентки после комплексного лечения выявлено прогрессирование заболевания с множественным метастатическим поражением печени. Прогрессирование заболевания может быть связано с развитием вторичной резистентности, обусловленной как мутациями в рецепторах к стероидным гормонам, так и активацией других сигнальных путей. В связи с этим показано, что оптимальным вариантом терапии пациентов с метастатическим гормонпозитивным HER2-отрицательным РМЖ является применение ингибиторов циклинзависимых киназ [19]. Анализ источников литературы показал, что полученное в нашем исследовании распределение случаев РМЖ по молекулярно-генетическим подтипам в целом соответствует данным других авторов. Так, в работе Ю.А. Дергуновой и соавт. (2020), посвященной изучению корреляции молекулярно-биологического подтипа первичной опухоли и региональных метастазов, на выборке из 100 пациенток установлено, что наиболее часто диагностируемыми подтипами стали люминальный A и люминальный B HER2-отрицательный подтипы, они диагностированы в 54 и 22% случаев соответственно. Базальноподобный подтип диагностирован в 9% случаев, тогда как люминальный B HER2-положительный и нелюминальный HER2-положительные подтипы выявлены в 7 и 8% случаев соответственно [20].

Заключение

Онкологические биобанки — неотъемлемая часть развития исследований в данной области, поскольку способны обеспечить исследователей необходимым количеством образцов, что позволяет более детально изучить распространенность, распределение, структуру заболевания, а также возможные причины возникновения резистентности к выбранной терапии. Высокий уровень смертности от РМЖ объясняется его способностью к метастазированию в жизненно важные органы. Проведение систематических и углубленных исследований молекулярной гетерогенности метастатического РМЖ, который является возможной причиной значительного количества терапевтических неудач, позволит улучшить стратификацию риска для пациентов и обеспечить максимально вероятную пользу и наименьшую токсичность от конкретного метода лечения.

Характеристика образцов, собранных в биобанк РМЖ в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, по составу и структуре соответствует публичным имеющимся статистическим данным. В центре получают лечение жители более чем 15 регионов и различных национальностей, что делает материал, собранный биобанком данного учреждения, уникальным ресурсом для проведения потенциальных фундаментальных исследований.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — И.А. Новикова, О.И. Кит, А.О. Ситковская, Л.Н. Ващенко, Т.О. Лаптева; сбор и обработка материала — Н.В. Гненная, Т.В. Шамова, И.В. Межевова, С.М. Бакулина, С.М. Бабиева, М.В. Волошин, И.А. Сухарь, М.А. Кузнецова; написание текста — Н.В. Гненная, С.Ю. Филиппова, С.В. Тимофеева; редактирование — Е.М. Непомнящая, А.Ю. Арджа, В.Н. Касьяненко.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.