Введение

Вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) принадлежит к семейству герпесвирусов и считается одним из самых распространенных у человека инфекционных агентов. По данным эпидемиологических исследований, инфицировано ВЭБ 90—95% населения Земли. Этот вирус вовлечен в патогенез ряда злокачественных новообразований человека, включая лимфому Ходжкина, лимфому Беркитта, назофарингеальную карциному, рак желудка (РЖ) и др. Согласно современным данным, с ВЭБ ассоциировано около 1% злокачественнных новообразований по всему миру [1, 2].

ВЭБ-ассоциированный РЖ (ВЭБасРЖ) в разных странах составляет примерно 1—9% от всех РЖ и в настоящее время выделен в отдельный гистологический и молекулярный подтип, обладающий рядом клинико-морфологических особенностей [3—5]. Показано, что ВЭБасРЖ чаще обнаруживается у мужчин (соотношение мужчин и женщин 2:1), с большей частотой диагностируется у молодых пациентов и примерно в 2 раза чаще встречается в кардиальном отделе и теле желудка, чем в антральном [6, 7]. Для ВЭБасРЖ более характерен кишечный гистологический тип, нежели диффузный [6]. ВЭБ-положительными являются 90% лимфоэпителиоидных карцином желудка (рак с лимфоидной инфильтрацией стромы) [6]. Пациенты с ВЭБасРЖ при равной стадии заболевания имеют более благоприятный прогноз, чем с ВЭБ-негативным РЖ [8].

Морфологически ВЭБасРЖ характеризуется лимфоидной инфильтрацией с высоким содержанием натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов [9]. ВЭБасРЖ обладает и рядом молекулярно-генетических особенностей: гиперметилированием промоторов генов-супрессоров опухоли — p14, p16, E-кадгерина и АРС, мутациями генов PI3KCA, ARID1A (55%) и BCOR (23%), амплификацией генов JAK2 и ERBB2, а также гиперэкспрессией гена PDL1/2 [5, 7, 10, 11]. ВЭБ при ВЭБасРЖ характеризуется латентностью I типа с экспрессией малых вирусных РНК EBER, BART и ядерного антигена EBNA1 [4]. Гибридизация in situ подтверждает наличие EBER в гистологических образцах ВЭБасРЖ в 80% случаев [5].

Одной из особенностей ВЭБасРЖ является моноклональная пролиферация клеток эпителия слизистой оболочки желудка, латентно инфицированных ВЭБ, что свидетельствует о наличии вируса на самых ранних стадиях канцерогенеза [12]. Элементы генома ВЭБ обнаруживаются как в клетках РЖ, так и в примыкающих к ним диспластических элементах эпителия, но не в окружающих лимфоцитах, стромальных клетках и нормальном эпителии, что свидетельствует о ключевой роли вируса в патогенезе РЖ [3].

Цель настоящего исследования — идентификация серологически позитивных случаев ВЭБасРЖ в российской популяции и характеристика их клинико-морфологических особенностей.

Материал и методы

Количественное определение вирусной нагрузки ВЭБ в плазме крови было выполнено у 83 пациентов (54 мужчин и 29 женщин) с подтвержденным диагнозом РЖ, проходивших обследование и лечение в ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России в 2018—2019 гг. В тех случаях, когда в плазме крови пациентов была обнаружена ДНК ВЭБ, в гистологических опухолевых образцах (операционном материале) дополнительно определяли наличие вирусного белка LMP (латентного мембранного протеина) и коротких РНК EBER. Кроме того, у ВЭБ-положительных пациентов с РЖ анализ ВЭБ повторяли через 3 мес после операции.

Средний возраст больных составил 62,6 года (от 32 до 80 лет). Среди пациентов преобладали мужчины (65,1%); женщины составили около трети обследуемых (34,9%).

В таблице представлено распределение больных РЖ по стадиям заболевания и гистологическим типам опухоли. В обследованной когорте преобладали пациенты с III—IV стадиями опухолевого процесса. Наиболее распространенными гистологическими типами были низкодифференцированная аденокарцинома и перстневидноклеточный рак.

Таблица. Характеристика больных раком желудка, включенных в исследование

Образцы венозной крови больных РЖ перед началом лечения собирали в ЭДТА-содержащие пробирки. После взятия кровь выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 15 мин при 3000 g для отделения плазмы. Полученные образцы хранили при температуре –20°C до выполнения анализа.

Выделение ДНК из плазмы пациентов осуществляли с помощью наборов реактивов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия). Количественное определение ДНК ВЭБ выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с использованием наборов реагентов «АмплиСенс EBV-скрин/монитор-FL» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии», Россия).

Вирусный белок LMP1 в гистологических образцах РЖ определяли иммуногистохимическим методом при помощи моноклональных мышиных антител Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP, Clone CS 1-4 (Dako Omnis, США).

Гибридизацию in situ для выявления EBER выполняли на срезах опухолевой ткани, приготовленных по стандартной методике. Окрашивание проводили в автоматическом иммуногистостейнере Leica Bond III с использованием предустановленных настроек и стандартных реагентов производства Leica Biosystems (Германия). Первичные антитела к EBER (PB0589; Leica Biosystems, Германия) применяли в соответствии с рекомендациями производителя. Для детекции результатов использовали систему Bond Polymer Refine Detection (Leica Microsystems, Германия). Оценку проводили в 5 полях зрения при увеличении ×40. Данный анализ был осуществлен д.б.н. К.В. Смирновой (ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России).

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США).

Результаты

ВЭБ в плазме крови был обнаружен лишь у 2 (2,4%) из 83 пациентов. Оба ВЭБ-положительных больных были мужского пола, старше 60 лет (63 года и 71 год), их вирусная нагрузка являлась относительно невысокой (в сравнении с больными назофарингеальной карциномой) и составила соответственно 1010 и 979 копий ВЭБ/мл плазмы. По данным патоморфологического исследования, в обоих случаях была выявлена низкодифференцированная аденокарцинома желудка (в одном наблюдении на препаратах отмечено наличие перстневидных клеток и фокусов лимфоваскулярной инвазии) IIIb стадии (pT4aN2M0) с поражением кардиального отдела и тела желудка. У обоих пациентов опухоль инфильтрировала все слои стенки желудка, врастая в жировую ткань малого сальника.

Иммуногистохимическое исследование не выявило наличия вирусного белка LMP1 в гистологических образцах РЖ у обоих больных. Однако с помощью метода флюоресцентной гибридизации было показано присутствие коротких вирусных РНК EBER в обоих образцах, причем EBER-положительными были практически все опухолевые клетки (см. рисунок).

Рис. Экспрессия EBER в гистологических образцах ВЭБ-положительных пациентов с РЖ (ув. ×40).

Через 3 мес после выполнения операции исходно ВЭБ-положительным пациентам выполнили контрольное определение ВЭБ, при этом вирусная ДНК в плазме крови обоих больных не обнаруживалась.

Обсуждение

ВЭБасРЖ впервые был описан в 1990 г. A. Burke и соавт. [13] и в дальнейшем выделен в отдельный гистологический и молекулярный подтип опухоли. Частота ВЭБасРЖ варьирует от 1,9—4,0% в Пакистане и Перу до 9,2—9,9% в Европе и Северной Америке [1, 14, 15]. В ряде африканских стран доля ВЭБ-позитивных РЖ превышает 20%, а в разных провинциях Китая варьирует от 2 до 30% (в зонах, эндемичных по назофарингеальной карциноме) [1, 16, 17].

Такие различия в заболеваемости могут быть связаны с тем, что в разных географических регионах преобладают штаммы вируса, отличающиеся по ряду генетических полиморфизмов [18, 19]. В частности, P. Ordonez и соавт. [20] предположили, что возможной причиной низкой частоты ВЭБасРЖ в перуанской популяции может служить низкая распространенность штамма ВЭБ с полиморфизмами i/XhoI+. По данным J. Chen и соавт. [17], наиболее часто при ВЭБасРЖ встречается вирус штамма А, прототипа F, I типа, с наличием полиморфизмов mut-W1/I1, XhoI− и del-LMP1.

В России в наиболее крупном исследовании в этой области [21] с помощью выявления на гистологических препаратах коротких вирусных РНК гена EBER1 методом гибридизации in situ была установлена частота ВЭБасРЖ 9,2% (17 из 187 случаев).

В настоящем исследовании использовали другой подход — оценивали наличие ДНК ВЭБ методом ПЦР в плазме крови 83 больных РЖ до оперативного вмешательства, при этом было выявлено лишь 2 ВЭБ-положительных случая (2,4%). Для них методом флюоресцентной гибридизации in situ на срезах с парафиновых блоков было показано наличие практически во всех опухолевых клетках вирусных РНК, кодируемых геном EBER1. Можно предположить несколько причин подобного различия частоты выявления ВЭБасРЖ в этих двух исследованиях. Во-первых, не все ВЭБасРЖ могут быть серологически позитивными по ДНК ВЭБ. Однако для назофарингеальных карцином доказана строгая корреляция между выявлением и количеством копий ДНК ВЭБ в плазме крови и клиническим статусом новообразования в мониторинге консервативной терапии. Во-вторых, доля случаев РЖ с высокой лимфоидной инфильтрацией в исследовании коллег могла быть выше, чем в выборке настоящего исследования. И наконец, нельзя исключить, что за последние 20 лет удельный вес ВЭБасРЖ в России снизился за счет усиления роли в развитии РЖ других экологических и пищевых неблагоприятных факторов.

Оба случая ВЭБасРЖ, выявленные в настоящем исследовании, были «типичными» — низкодифференцированные аденокарциномы с лимфоидной инфильтрацией стромы, локализующиеся в кардиальном отделе и теле желудка у мужчин старшей возрастной группы. Моноклональный характер возникновения этих опухолей подтверждается тем, что практически все опухолевые клетки были ВЭБ-положительными в отличие от стромальных и лимфоидных элементов, а также окружающего опухоль эпителия слизистой оболочки с предраковыми изменениями. Через 3 мес после условно радикального удаления опухоли ВЭБ в крови двух этих пациентов не выявлялся. Данный факт в сочетании с выявлением РНК EBER в препаратах опухоли свидетельствует о том, что источником ВЭБ в крови у этих пациентов были именно клетки аденокарциномы желудка.

Заключение

Частота ВЭБ-положительных больных РЖ в обследованной когорте больных РЖ (2,4%) оказалась значительно ниже среднемировой. Выявленные случаи ВЭБасРЖ характеризовались низкой степенью дифференцировки и преимущественным поражением кардиального отдела и тела желудка. Через 3 мес после хирургического вмешательства ДНК ВЭБ в плазме крови у этих больных не выявлялась.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Н.С. Сергеева, В.Ю. Скоропад, В.М. Хомяков, С.С. Пирогов, А.Д. Каприн; сбор и обработка материала — А.В. Чайка, В.Ю. Скоропад, В.М. Хомяков, С.С. Пирогов, Н.В. Северская; статистическая обработка данных — И.И. Алентов, А.В. Чайка; написание текста — И.И. Алентов, Н.С. Сергеева, Н.В. Маршутина; редактирование — Н.С. Сергеева, Н.Н. Волченко, А.Д. Каприн, И.И. Алентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.