Введение

Несмотря на многочисленные исследования эндометриоза и соответствующие публикации, в мировой научной практике причина, а, следовательно, и лечение остаются не установленными. К числу важных и неизученных направлений при эндометриозе следует отнести оценку роли убиквитина и убиквитинирование. С момента открытия убиквитина в 1975 г. G. Goldstein и соавт. возник большой интерес к этому небольшому, но широко распространенному белку в эукариотических клетках [1]. Главная роль убиквитина заключается в ковалентной маркировке внутриклеточных белков, особенно короткоживущих регуляторных белков для протеолиза. После ковалентного связывания убиквитина с белком (убиквитинирование), белки расщепляются в протеасоме 26S. Убиквитинирование белков заключается в образовании изопептидной связи между карбоксильной группой глицина С-конца убиквитина и е-аминогруппой боковой цепи лизина в целевом белке.

Избирательная деградация многих короткоживущих белков в эукариотических клетках осуществляется убиквитиновой системой. На этом пути белки нацелены на деградацию путем ковалентного лигирования убиквитином как высококонсервативного белка с малой молекулярной массой. Опосредованная убиквитином деградация регуляторных белков играет важную роль в контроле множества процессов, включая развитие клеточного цикла, передачу сигналов, регуляцию транскрипции, подавление рецепторов и эндоцитоз. Система убиквитина участвует в иммунном ответе, развитии и запрограммированной гибели клеток. Нарушения в процессах, опосредованных убиквитином и связанных с патологическими состояниями, включают злокачественную трансформацию. Избирательность деградации белков определяется в основном на этапе привязки белка к убиквитину, поэтому особое внимание уделяется тому, что мы знаем и хотели бы знать о механизме действия системы лигирования убиквитином белка и о сигналах в белках, распознаваемых этими системами [2]. Кроме этого, известно множество аспектов регуляции митохондриального гомеостаза с участием убиквитин-протеосомальной системы (УПС). Это касается как путей контроля качества митохондрий, так и регулирования их конкретных функций. УПС можно сравнить со швейцарским ножом, без которого митохондрии просто не смогли бы сохранить свою целостность в клетках [3].

Кроме того, установлено, что в экспериментах на крысах рецептор эстрогена матки убиквитинирован в ответ на эстрадиол. Следовательно, убиквитинирование может контролировать таргетинг белков для различных проявлений функциональной активности в клетке, например, рецепторы к эстрадиолу [4].

Изучение распределения убиквитина в срезах эндометрия и децидуальной оболочки человека показало наличие иммунореактивности к убиквитину в эндометрии, особенно в железистых эпителиальных клетках. Эта активность активируется в стромальных клетках эндометрия, которые децидуализируются в начале беременности. Использование вестерн-блоттинг анализа установило, что изученная иммунореактивность в первую очередь связана с присутствием неконъюгированного убиквитина и убиквитина, конъюгированного с другими белками [5].

Исследований, посвященных одновременному изучению в эутопическом и эктопическом эндометрии экспрессии неконъюгированного и конъюгированного убиквитина по данным вестерн-блоттинг анализа у больных с эндометриозом, в доступной литературе мы не нашли. Кроме этого, не проведена оценка экспрессии гена убиквитина с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, иммугистохимического анализа, иммуноферментного анализа в крови и перитонеальной жидкости. На основании данных литературы можно заключить, что до настоящего времени эти результаты исследований никогда не сопоставлялись с наличием хронической тазовой боли.

Цель исследования — изучить роль конъюгированного и неконъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза с использованием метода вестерн-блоттинга, иммуногистохимического анализа, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, иммуноферментного анализа в крови и перитонеальной жидкости и сопоставить эти данные с наличием хронической тазовой боли.

Материал и методы

Основная группа. В основную группу рекрутированы 65 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза I—III стадии согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины (rASRM), подтвержденного во время проведения лапароскопии, как это описано нами ранее [6]. После тщательного клинико-лабораторного обследования больные составили две группы: без признаков хронической тазовой боли (32 пациентки) и с признаками хронической тазовой боли (33 пациентки).

Контрольная группа — 29 пациенток, которым произведена стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз у пациенток этой группы исключали после тщательного исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов, как это описано ранее [6].

Дизайн исследования. На основании решения этического комитета ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России проведено ретроспективное одномоментное исследование. Рекрутинг и рандомизацию больных осуществляли совместно с д.м.н., проф. А.С. Гаспаровым, д.м.н. Н.И. Волковым, д.м.н., проф. Т.Е. Самойловой, д.м.н., проф. Л.Н. Кузьмичевым, д.м.н. Е.Д. Дубинской, д.м.н. Е.А. Межевитиновой, д.м.н. А.В. Лединой, к.м.н. М.А. Шороховой, к.м.н. М.Ф. Дорфманом, к.м.н. Н.С. Щетининой, к.м.н. А.С. Онищенко, врачом О.М. Векилян, врачом К.Р. Набиевой. Клиническая характеристика больных и дизайн исследования представлены нами ранее [7—10].

Характеристика образцов ткани, сыворотки крови и перитонеальной жидкости. Образцы эутопического и эктопического эндометрия, перитонеальной жидкости получены во время лапароскопии, как это описано нами ранее [6]. Верификацию гистологических диагнозов в эутопическом и эктопическом эндометрии осуществляли в Академической больнице г. Уппсала, Швеция (Akademiska sjukhuset i Uppsala). Все экспериментальные исследования проведены совместно с Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden, на территории Rudbeck laboratory, Uppsala, Sweden и в тесном контакте с The Human Protein Atlas, Uppsala, Sweden.

Обозначение обследованных групп для исследования тканей: ЭУК/Б— — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью.

Обозначение обследованных групп для исследования крови и перитонеальной жидкости: К/Б– — контрольная группа, без боли, Э/Б– — эндометриоз, без боли, Э/Б+ — эндометриоз, с болью.

Вестерн-блоттинг анализ (Western blotting, WB) для неконъюгированного и конъюгированного убиквитина. Проведение вестерн-блоттинг анализа проводили, как это описано нами ранее [6]. Использовали антитела к человеческому убиквитину, антиген аффинно очищенный, поликлональный кроличий IgG, А-100 (R&D, «Boston Biochem», США), для actin β (C4) мышиные моноклональные антитела (sc-47778, «Santa Cruz Biotechnology», США), для контроля использовали лизат клеточной линии A549 эпителиальной аденокарциномы легких человека (Cell line: A549, human lung adenocarcinoma epithelial, lysate A549 whole cell lysate ab 7910, «Abcam», Великобритания) или Ubiquitin (h) 293T lysate sc-111402, представляющей собой лизат трансфицированного убиквитина человека из 293T клеток («Santa Cruz Biotechnology», США). Исследование проведено В.А. Бурлевым, E. Davey.

Извлечение матричной РНК и проведение количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (Real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR) для убиквитина. Проведение количественной ПЦР в реальном времени осуществляли, как это описано нами ранее [6]. Использовали праймеры «Thermo Fisher Scientific» (США) для убиквитина Hs00704312_s1 (Gene Symbol: UBE2D3, Gene Name: ubiquitin conjugating enzyme E2 D3); для человеческого β-актина, ACTB, 4326315E. Относительные изменения экспрессии генов анализированы с использованием метода 2-ΔΔT. Исследование проведено В.А. Бурлевым, E. Davey, Th. Kunovac Kallak.

Иммуногистохимический анализ (Immunohistochemistry, IHC). Экспрессия убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии. Проведение иммуногистохимического анализа осуществлялось, как это описано нами ранее [11]. Для визуализации применяли первичные моноклональные мышиные антитела (antiHuman Ubiquitin/Ubiquitin+1 Antibody, MAB701, R&D). В работе использован микроскоп высокого разрешения ZEISS Axio Observer z1 («Carl Zeiss», Германия) с программным обеспечением ZEN 3.0 (blue edition). Исследование проведено В.А. Бурлевым, Н.А. Ильясовой.

Анализ сыворотки крови и перитонеальной жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА). Анализ содержания убиквитина в сыворотке крови и перитонеальной жидкости проведен с помощью ИФА и применением стандартных наборов для убиквитина ELISA Kit: Ubiquitin, Human, ELISA Kit E01U0007 («Shanghai Blue Gene Biotech CO., Ltd.», Китай). Проведение реакции и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях согласно рекомендациям производителя. Исследование выполнено В.А. Бурлевым, Н.А. Ильясовой.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как среднее значение и стандартное отклонение (M±SD). В зависимости от конкретных условий применяли: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни, критерий Круаскала—Уоллиса. Различия между группами считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Описание больных основной группы. У всех пациенток проведен анализ анамнестических и клинических данных, которые показали наличие характерных признаков эндометриоза: бесплодие, хронические тазовые боли, метроррагии, диспареунию. При лапароскопии на брюшине наблюдались гетеротопии различной локализации. Хроническая тазовая боль статистически значимо наблюдалась у больных с болью (0,0 и 5,2 по визуальной аналоговой шкале (ВАШ). Клиническая характеристика больных соответствовала ранее представленным данным [7—10].

Раздел 1.1. Описание экспрессии неконъюгированного с белком убиквитина (свободный убиквитин, 8,5 kDa) по данным вестерн-блоттинга анализа у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии. Как следует из приведенных данных (рис. 1), экспрессия белка неконъюгированного убиквитина в эутопическом эндометрии больных группы ЭУЭ/Б– статистически значимо снижена по сравнению с показателями у женщин группы ЭУК/Б– (0,17±0,07 и 0,21±0,14 убиквитин/бета-актин соответственно) и группы ЭКЭ/Б+ (0,17±0,07 и 0,49±0,09 убиквитин/бета-актин соответственно). Наблюдалось статистически значимое различие между группой ЭУК/Б– и группой ЭУЭ/Б+ (0,21±0,14 и 0,49±0,09 убиквитин/бета-актин соответственно). Следовательно, в ткани эутопического эндометрия у женщин с эндометриозом и болью накапливается неконъюгированный убиквитин. В эктопическом эндометрии пациенток группы ЭКЭ/Б+ значения не конъюгированного убиквитина были статистически значимо максимальны по отношению к другим группам. У исследуемых группы ЭКЭ/Б– уровень убиквитина был меньше в 1,6 раза, чем у женщин группы ЭКЭ/Б+ (0,67±0,31 и 1,12±0,23 убиквитин/бета-актин соответственно). Экспрессия неконъюгированного убиквитина у пациенток группы ЭКЭ/Б+ была в 5,3 раза выше, чем у больных группы ЭУК/Б– (1,12±0,23 и 0,21±0,14 убиквитин/бета-актин соответственно). Эти данные убедительно доказывают увеличение содержания неконъюгированного убиквитина в ткани эутопического и эктопического эндометрия при наличии боли.

Рис. 1. Экспрессия неконъюгированного белка убиквитина по данным вестерн-блоттинга у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии.

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Различия определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Убиквитин — не конъюгированный с белком убиквитин с молекулярной массой 8,5 kDa, бета-актин — белок бета-актин, ЭУК/Б— — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; вестерн-блоттинг (WB) — экспрессия белков.

Раздел 1.2. Описание экспрессии конъюгированного с белком убиквитина (более 21 kDa) по данным вестерн-блоттинг анализа у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии. Как следует из приведенных данных (рис. 2), наиболее статистически значимые низкие показатели экспрессии установлены в тканях женщин группы ЭУК/Б– (68,2±38,7 убиквитин/бета-актин). В тканях женщин группы ЭУЭ/Б– этот показатель составил 128,6±21,5 убиквитин/бета-актин, что в 1,8 раза больше, чем у женщин контрольной группы — 68,2±38,7 убиквитин/бета-актин. В тканях больных группы ЭУЭ/Б+ экспрессия конъюгированного с белком убиквитина возрастает в 3,5 раза по сравнению с показателями у пациенток группы ЭУЭ/Б– (454,2±29,6 и 128,6±21,5 убиквитин/бета-актин соответственно) и в 6,6 раза больше, чем у женщин группы контроля ЭУК/Б– (454,2±29,6 и 68,2±38,7 убиквитин/бета-актин соответственно). Эти данные свидетельствуют о значительном накоплении конъюгированного с белком убиквитина по отношению к неконъюгированному убиквитину. Так, если содержание неконъюгированного убиквитина в тканях больных группы ЭУЭ/Б+ по отношению к показателям в тканях пациенток группы ЭУК/Б– было больше в 2,3 раза, то конъюгированного с белком убиквитина — в 6,6 раза. В эктопическом эндометрии показатели конъюгированного убиквитина у женщин групп ЭКЭ/Б– и ЭКЭ/Б+ (57,9±21,2 и 133,1±12,7 убиквитин/бета-актин соответственно) были снижены по отношению к содержанию в эутопическом эндометрии. Однако в тканях пациенток группы ЭКЭ/Б+ этот показатель статистически значимо выше, чем у женщин группы ЭКЭ/Б– (133,1±12,7 и 57,9±21,2 убиквитин/бета-актин соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о нарастании экспрессии конъюгированного с белком убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом и тазовой болью.

Рис. 2. Экспрессия конъюгированного с белком убиквитина по данным вестерн-блоттинга у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии.

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Различия определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Убиквитин — конъюгированный с белком убиквитин с молекулярной массой более 21 kDa, бета-актин — белок бета-актин, ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; вестерн-блоттинг (WB) — экспрессия белков.

Раздел 1.3. Описание соотношения экспрессии конъюгированного с белком убиквитина по отношению к неконъюгированному с белком убиквитину по данным вестерн-блоттинг анализа у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии. Учитывая результаты, полученные в разделе 1.1 и 1.2 о распределении неконъюгированного и конъюгированного убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии, мы посчитали целесообразным представить данные о соотношении конъюгированного и неконъюгированного убиквитина в изученных тканях. Это необходимо, прежде всего, для оценки вклада каждого из показателей и выбора наиболее значимого. Как следует из приведенных данных (рис. 3), в эутопическом эндометрии наибольшее и статистически значимое соотношение отмечено в тканях больных группы ЭУЭ/Б+ (454,2±29,6), чем в тканях женщинам групп ЭУЭ/Б– (454,2±29,6 и 128,6±21,5 соответственно) и ЭУК/Б– (454,2±29,6 и 68,2±38,7 соответственно). В эктопическом эндометрии больных без боли группы ЭКЭ/Б– это значение составило 57,9±21,2, а с болью группы ЭКЭ/Б+ — 133,1±12,7. Наиболее высокое соотношение конъюгированного и неконъюгированного убиквитина установлено в тканях больных группы ЭУЭ/Б+ (926,9±128,8), а наиболее низкое — в тканях больных группы ЭКЭ/Б– (86,4±18,3). Эти показатели различаются между собой в 10,7 раза. Следовательно, наибольший вклад в это соотношение вносит конъюгированный с белком убиквитин, а не свободный убиквитин, который является резервным белком для последующего убиквитирования.

Рис. 3. Соотношение экспрессии конъюгированного с белком убиквитина по отношению к не конъюгированному с белком убиквитином по данным вестерн-блоттинга у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии.

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Различия определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Убиквитин: конъюгированный с белком убиквитин с молекулярной массой более21 kDa, не конъюгированный с белком убиквитин с молекулярной массой 8,5 kDa, бета-актин — белок бета-актин, ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; вестерн-блоттинг (WB) — экспрессия белков.

Раздел 2. Описание экспрессии гена убиквитина по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии. Как следует из приведенных данных (рис. 4), оценка экспрессии гена убиквитина показала, что наиболее низкие и статистически значимые показатели экспрессии наблюдались в тканях женщин группы ЭУК/Б–. Из пациенток групп ЭУЭ/Б– и ЭУЭ/Б+ этот показатель был статистически значимо увеличен у больных с эндометриозом и с болью (0,0091±0,0051 и 0,0703±0,0301, relative gene expression соответственно). В эктопическом эндометрии пациенток группы ЭКЭ/Б+ выраженность экспрессии гена убиквитина была статистически значимо наибольшей среди всех обследованных.

Рис. 4. Экспрессия гена убиквитина по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии.

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Различия определяли с помощью критерия Манна-Уитни. ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; RT-qPCR (mRNA expression) — экспрессия мРНК по данным количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Из всех исследованных тканей экспрессия гена убиквитина была всегда статистически значимо выше в эктопическом эндометрии, но наиболее высока у пациенток с болью (группа ЭКЭ/Б+). Следовательно, имеет место градиент нарастания экспрессии гена убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии от минимальных до максимальных значений в тканях женщин исследуемых групп: ЭУК/Б– <ЭУЭ/Б– <ЭУЭ/Б+<ЭКЭ/Б– <ЭКЭ/Б+.

Раздел 3. Описание экспрессии убиквитина (HSCORE) в эпителии желез у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии по данным иммуногистохимического анализа. Из приведенных результатов (рис. 5) следует, что экспрессия убиквитина (с использованием первичных моноклональных мышиных антител — antiHuman Ubiquitin/Ubiquitin+1 Antibody, MAB701, R&D) в эутопическом и эктопическом эндометрии выявлена в клетках поверхностного эпителия и эпителия желез, в клетках стромы и сосудах у женщин контрольной группы ЭУК/Б–, у больных групп ЭУЭ/Б– и ЭУЭ/Б+, а также в эпителии желез, в клетках стромы и сосудах эктопического эндометрия пациенток групп ЭКЭ/Б– и ЭКЭ/Б+. Обращает на себя внимание распределение экспрессии убиквитина в указанных клеточных структурах. Так, наиболее активной экспрессия была в ядрах клеток эпителия желез (70—80%) и менее представлена в цитозоле (20—30%). Такое распределение не противоречит установленным данным литературы для других тканей [5]. Учитывая особенности экспрессии убиквитина среди клеточных структур эутопического и эктопического эндометрия, мы представили на рис. 5 данные об эпителии желез. Эта необходимость связана и с отсутствием поверхностного эпителия в эктопическом эндометрии.

Рис. 5. Экспрессия убиквитина (HSCORE) в эпителии желез у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в эутопическом и эктопическом эндометрии по данным иммуногистохимического анализа.

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Различия определяли с помощью критерия Манна-Уитни. ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контрольная группа, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; IHC — экспрессия белков по шкале HSCORE по данным иммуногистохимического анализа.

Отмечено отсутствие статистически значимых различий между показателями в группах ЭУК/Б– и ЭУЭ/Б– (0,54±0,27 и 0,66±0,25 усл. ед. HSCORE), но было статистически значимое повышение у больных группы ЭУЭ/Б+ (1,59±0,48 усл. ед. HSCORE). В эктопическом эндометрии в эпителии желез наблюдалось также статистически значимое увеличение экспрессии убиквитина у больных группы ЭКЭ/Б+, чем у больных группы ЭКЭ/Б– (1,1±0,34 и 0,5±0,35 усл. ед. HSCORE соответственно). Сравнение экспрессии убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии показало статистически значимое ее увеличение у пациенток группы ЭКЭ/Б+ по сравнению с женщинами контрольной группы ЭУК/Б– (1,1±0,34 и 0,54±0,27 усл. ед. HSCORE соответственно) и группы ЭУЭ/Б– (1,1±0,34 и 0,66±0,25 усл. ед. HSCORE соответственно), но более низкую экспрессию, чем у больных группы ЭУЭ/Б+ (1,1±0,34 и 1,59±0,48 усл.ед. HSCORE соответственно). Полученные данные свидетельствуют об увеличении экспрессии убиквитина в эпителии желез в эутопическом и эктопическом эндометрии при наличии хронической боли.

Раздел 4. Описание содержания убиквитина у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в крови и в перитонеальной жидкости по данным иммуноферментного анализа (ИФА). Как следует из приведенных данных (рис. 6), у женщин контрольной группы содержание убиквитина в перитонеальной жидкости было статистически значимо ниже по сравнению с сывороткой крови (10,5±7,4 и 23,1±17,5 нг/мл соответственно). У пациенток группы Э/Б— таких различий не было. У больных группы Э/Б+ уровень убиквитин выше в перитонеальной жидкости (98,5±12,3 по сравнению с 79,6±19,8 нг/мл в сыворотке крови). Наиболее низкие концентрации убиквитина наблюдались в крови женщин групп К/Б– и Э/Б– (23,1±17,5 и 26,7±12,5 нг/мл соответственно) без статистически значимых различий. У пациенток группы Э/Б+ этот показатель достигал максимальных значений (79,6±19,8 нг/мл) и статистически значимо отличался от показателей у женщин групп К/Б– и Э/Б–. Наименьшие значения содержания убиквитина в перитонеальной жидкости отмечены у пациенток групп К/Б– и Э/Б– по отношению к женщинам группы Э/Б+. У женщин группы Э/Б+ эти различия были статистически значимы и в 9,4 раза увеличены в перитонеальной жидкости по сравнению с показателями группы женщин К/Б– (98,5±12,3 и 10,5±7,4 нг/мл соответственно) и в 4 раза по сравнению с показателями группы женщин Э/Б– (98,5±12,3 и 24,6±9,4 нг/мл соответственно).

Рис. 6. Содержание убиквитина у женщин контрольной группы и у больных эндометриозом в крови и в перитонеальной жидкости по данным иммуноферментного анализа (ELISA).

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Различия определяли с помощью критерия Манна—Уитни. К/Б– — контрольная группа, без боли, Э/Б– — эндометриоз, без боли, Э/Б+ — эндометриоз, с болью; С — сыворотка крови, ПЖ — перитонеальная жидкость, ELISA — иммуноферментный анализ (ИФА).

Между содержанием убиквитина в крови и в перитонеальной жидкости наблюдается умеренная положительная корреляционная связь (r-Pearson, p<0,01) у пациенток группы К/Б–, у пациенток других групп она слабо положительная. Полученные результаты свидетельствуют о возрастании содержания убиквитина в крови и в перитонеальной жидкости у больных с эндометриозом и тазовой болью, а наиболее выражено это изменение в перитонеальной жидкости.

Раздел 5. Описание роли неконъюгированного и конъюгированного убиквитина как универсального белка, участвующего в убиквинировании и накоплении белков для последующей их деградации. Общая черта дисфункции эутопического и эктопического эндометрия, которая предполагает нарушение убиквитин-протеосомальной системы при проявлении хронической тазовой боли у больных с эндометриозом. На основании суммарных результатов проведенных исследований, представленных в разделах 1—4, показано, что убиквитин у больных эндометриозом представлен в железистом эпителии эутопического и эктопического эндометрия, у женщин контрольной группы — эутопического эндометрия, в основном в ядрах клеток (иммуногистохимический анализ). Кроме этого, убиквитин находится в двух формах: в неконъюгированном виде с молекулярной массой 8,5 kDa и в конъюгированном виде с белками с молекулярной массой больше 21 kDa (вестерн-блоттинг анализ). Следовательно, иммуногистохимическое распределение в клеточных структурах эндометрия в большей степени связано с детекцией конъюгированного убиквитина, так как соотношение убиквитин/бета-актин конъюгированного убиквитина в 86,4—926,9 раза больше, чем неконъюгированного убиквитина в зависимости от обследованных групп и локализации эндометрия. Эти данные подтверждаются экспрессией мРНК убиквитина (ПЦР) в эутопическом и эктопическом эндометрии, содержанием его в крови и в перитонеальной жидкости (ИФА). Несомненно, что накопление белков, конъюгированных убиквитином, при эндометриозе и тазовой боли свидетельствует об изменениях убиквитин-протеосомальной системы, которая влияет на множество сигнальных путей регуляции и в конечном итоге проявляет воспаление микроокружения [6]. Таргетной точкой этих изменений является нарушение профиля деградации белков в эндометрии, которое искажает процессы транскрипции и трансляции генов.

Обсуждение

Аномальное накопление нейротоксических белков является типичным признаком различных болевых проявлений и возрастных нейродегенеративных заболеваний [12]. Система убиквитиновых протеасом занимает центральное место в поддержании клеточного гомеостаза [13]. Эта система вовлекает в себя широкий спектр белков, участвующих в убиквитинировании, деубиквитинировании или убиквитин-опосредованной деградации белков, и поэтому они могут считаться потенциальными мишенями для создания лекарств. Наличие новых инструментов для исследования приводят к улучшенному пониманию этой сложной системы регулирования, что в свою очередь способствует разработке новых подходов к лечению [14].

Эукариотические клетки управляют двумя основными протеолитическими системами: убиквитин-протеосомальной системой (УПС) и аутофагией. УБП — это селективная протеолитическая система, в которой конъюгация убиквитина с субстратами индуцирует деградацию белка в протеосомах [15]. Аутофагия — это процесс, при котором компоненты цитоплазмы разрушаются лизосомами [16]. Эту систему массового разрушения можно разделить на микроаутофагию, шаперон-опосредованную аутофагию и макроаутофагию в зависимости от механизма доставки белков к лизосоме. УПС и аутофагия ответственны за 80—90% и 10—20% клеточного протеолиза, однако это соотношение может варьировать в зависимости от типа клеток и их физиологического состояния [15]. Распад клеточного белка происходит в разных клеточных компартментах: цитозоли, мембране, лизосоме и эндоплазматическом ретикулуме. Кроме того, регуляторный внутримембранный протеолиз становится сильным акцентом в ряде критических состояний, например, клеточной дифференцировке, белковом и липидном обмене, болезни Альцгеймера и т.д. Лизосомная деградация в первую очередь опосредована катепсинами. Больные, у которых отсутствует катепсин K, характеризуются нарушением ремоделирования костей. Кальпаины принадлежат к группе Ca2+-зависимой протеазы цистеина, которые участвуют в перестройке цитоскелета, в воспалении и апоптозе. Как правило, кальпаины состоят из большой субъединицы ≈80 кДа и небольшой субъединицы ≈30 кДа. Отсутствие малой субъединицы, общей для всех кальпаинов, приводит к эмбриональной летальности, а дефицит кальпаина 3-го типа приводит к мышечной дистрофии [17].

Центр обоих деградационных путей — это убиквитинирование, которое генерирует специфичные для сцепления дегроны на субстратах, предназначенных для разрушения. Дегрон — часть молекулы белка, которая регулирует скорость его протеолиза. Известные на данный момент дегроны представляют собой короткие аминокислотные последовательности, располагающиеся в любом участке аминокислотной цепочки [18]. Взаимодействие убиквитиновых дегронов с УПС способствует аутофагической кодеградации поврежденных митохондрий (митофагия) или других клеточных компонентов, таких как вторжение патогенов [19]. Более того, многие белки УПС структуры и цепи убиквитина передают сигналы различным непротеолитическим процессам, таким как реакции на повреждение ДНК, или воспалительным реакциям [20]. Убиквитин также может прикрепляться к самому себе, в результате чего образуются полиубиквитиновые цепи. Убиквитинирование может быть отменено деубиквитинирующими ферментами, которые либо обрезают, либо удаляют цепи убиквитина из белков [14]. Накопление убиквитинированных белков — это общая черта дисфункции органов и тканей, которая предполагает нарушение убиквитин-протеосомальной системы, а именно активности протеасом [21].

К настоящему времени регулируемая деградация белка бросила вызов преобладающим точкам зрения о том, что основные клеточные решения принимаются во время транскрипции и на уровне трансляции [22]. Это подтверждено участием протеасом в воспалительных реакциях. Так, NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) как ключевой транскрипционный фактор, участвующий в воспалительной реакции связан с ингибитором-κB находящимся в цитозоле. При соответствующей стимуляции ингибитор-κB фосфорилируется и деградирует в протеасоме, а свободный NF-κB попадает в ядро и индуцирует экспрессию нескольких генов, участвующих в воспалительном ответе [23].

Следовательно, накопление убиквитинированных белков предполагает не только изменение профиля деградации белков в клетках, но и влияние этого процесса на экспрессию генов. Так, в нашем исследовании наблюдается как накопление в большей степени конъюгированного убиквитином белка в эутопическом и эктопическом эндометрии при эндометриозе и болевом синдроме, так и активация экспрессии гена убиквитина. По нашему мнению, это связано с попаданием в ядро ряда факторов деградации белков, которые индуцируют экспрессию не только генов убиквитина, но и генов участвующих в воспалении микроокружения и индукции боли. Как нами показано ранее, при эндометриозе и боли наблюдается целый спектр активации мРНК соответствующих генов: мРНК VIP [6, 10], мРНК VIPR1, мРНК iNOS, мРНК COX2 [7], мРНК nNOS, мРНК UCHL1 [8].

Суммируя полученные результаты, следует считать доказанным увеличение содержания убиквитина, конъюгированного с белками, в ткани эутопического и эктопического эндометрия при наличии боли, как и увеличение уровня неконъюгированного с белком убиквитина по данным вестерн-блоттинг анализа. Однако анализ соотношения между этими белками показал, что наибольший вклад в это соотношение вносит конъюгированный с белком убиквитин, а не свободный убиквитин, который является резервным белком для последующего убиквитирования. Разработанный метод вестерн-блоттинг анализа для идентификации конъюгированного и неконъюгированного убиквитина в ткани эутопического и эктопического эндометрия может быть использован для оценки экспрессии белка убиквитина как маркера нарушения убиквитин-протеосомальной системы, а именно активности протеасом. Анализ экспрессии гена убиквитина с использованием ПЦР в реальном времени показал наличие линейного градиента нарастания экспрессии гена убиквитина в эутопическом и эктопическом эндометрии от минимальных у женщин группы ЭУК/Б— до максимальных значений у больных группы ЭКЭ/Б+. Оценка данных иммуногистохимического анализа свидетельствует об увеличении экспрессии убиквитина в эпителии желез в эутопическом и эктопическом эндометрии при наличии хронической боли. Полученные результаты также указывают на возрастание содержания убиквитина в крови и в перитонеальной жидкости у больных с эндометриозом и тазовой болью, но наиболее значимо это изменение наблюдается в перитонеальной жидкости.

Заключение

Установлено изменение у больных с эндометриозом и тазовой болью вклада уровня убиквитина, конъюгированного с белками, по отношению к неконъюгированному убиквитину. Это позволяет выделить конъюгированный убиквитин как универсальный омиксный маркер, участвующий в накоплении убиквитинированных белков для последующей их деградации, что свидетельствует о нарушении в эутопическом и эктопическом эндометрии убиквитин-протеосомальной системы. Полученные результаты позволяют объяснить многочисленные публикации в научной литературе о накоплении у больных с эндометриозом различных регуляторных белков в эутопическом и эктопическом эндометрии. При накоплении конъюгированного убиквитином белка отмечается и активация экспрессии гена убиквитина, что связано с попаданием в ядро ряда факторов деградации белков, которые индуцируют экспрессию не только генов убиквитина, но и генов, участвующих в воспалении микроокружения. Последующий поиск и применение новых лекарственных форм, влияющих на нормализацию убиквитин-протеосомальной системы, позволит получать более широкий спектр терапевтических воздействий при эндометриозе. Это, например, показано к применению кратковременных и/или низких доз бортезомиба приводящего к ингибированию протеасом, и как следствие, к предотвращению гипертрофии левого желудочка в экспериментах на животных моделях. Однако хроническое использование бортезомиба у человека не лишено кардиотоксичности [21].

Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России: «Разработка дифференцированного подхода к ведению пациенток репродуктивного возраста с различными формами эндометриоза», №госрегистрации: 122020900125-8.

Благодарности. Выражаю благодарность honorary professor M. Olovsson, N.A. Ilyasova, PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие, обсуждение и поддержку. Работа выполнена по теме: «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами эутопического и эктопического эндометрия и тазовой болью у женщин с эндометриозом», учетный номер Минобрнауки России в НТИМИ 0431/01/15. Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской Королевской Академией наук, Шведским медицинским Исследовательским Советом (грант №8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, Rudbeck laboratory i Uppsala, The Human Protein Atlas i Uppsala, Akademiska sjukhuset i Uppsala, ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова», Минздрава России и Минздравом России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.