Введение
Известно, что хроническая плацентарная недостаточность (ХПН) может приводить к задержке роста и развития плода, повышенной перинатальной заболеваемости и смертности. По данным разных авторов, ХПН в общей популяции осложняет 35—40% беременностей, однако при акушерской и/или экстрагенитальной патологии ее частота может достигать 75% [1—3[. ХПН является одной из основных причин развития гипоксии у плода при беременности и в родах. Оценку функционального состояния плода в таких случаях осуществляют неинвазивными и инвазивными методами. Однако результаты этой оценки, по данным многих авторов [4, 5], имеют высокую частоту ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что обусловливает необходимость поиска новых маркеров нарушений функционального состояния плода, позволяющих своевременно ex temporae диагностировать развившийся дистресс плода, находящегося предпочтительно на этапе преацидоза.
«Золотым стандартом» диагностики функционального состояния плода является кардиотокография (КТГ) [6]. Однако из-за относительно низкой специфичности мониторное наблюдение за сердечным ритмом этим методом приводит к повышению частоты оперативного родоразрешения в интересах плода [4, 7]. Такой уровень специфичности можно объяснить как несоблюдением методологии выполнения КТГ, так и ошибочной интерпретацией ее результатов [7]. Сомнительный и патологический типы КТГ могут свидетельствовать о нарушении адаптивно-приспособительных реакций плода. Недостаточное поступление к плоду кислорода приводит к анаэробному метаболизму глюкозы и последующему метаболическому ацидозу за счет образования пирувата с частичным преобразованием его в лактат. Определение уровней лактата, а также pH в крови плода (проба Залинга) — широко распространенные тесты, которые выполняют при сомнительном типе КТГ. Многие авторы сообщают, что содержание лактата в крови плода обладает высокой чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики его гипоксии и может быть более информативным, чем тестирование pH. При этом, по данным литературы, сравнительная оценка этих тестов в отношении диагностики интранатальной гипоксии плода и частоты последующего оперативного родоразрешения неоднозначна [8, 9]. Считают, что использование инвазивных методов диагностики гипоксии плода в родах дает возможность снизить частоту оперативного родоразрешения [10]. Эти методы привлекательны для интранатальной диагностики нарушений функционального состояния плода в родах, однако для их исполнения необходимо иметь определенные условия: раскрытие маточного зева более 3 см, отсутствие плодного пузыря и головное предлежание плода. Кроме того, использование инвазивной диагностики увеличивает риск восходящей инфекции при длительном безводном промежутке или инфекциях, в том числе мягких родовых путей, у матери [11, 12].
В связи с наличием противопоказаний и ограничений к использованию инвазивных тестов в акушерской практике продолжается поиск новых маркеров для оценки функционального состояния плода, которые могут быть определены в периферической крови матери. В этом отношении перспективным маркером гипоксии может оказаться индуцируемый гипоксией фактор-1-альфа (HIF-1α), являющийся регулятором экспрессии гена эритропоэтина. Он представляет собой гетеродимер и содержится во всех клетках и тканях организма. HIF представлен классом bHLH-транскрипционных белков и состоит из 2 субъединиц — α и β, при этом α-субъединица является кислород-чувствительной [13]. В настоящее время учеными проводятся многочисленные исследования по изучению экспрессии HIF-1α в тканях сердца, легких, плаценты. Однако в акушерстве таких работ крайне мало, и этому имеется объяснение. Изучение фармакокинетики HIF в организме человека, особенно при беременности, затруднено. Этим обусловлена необходимость осуществлять такие исследования на базе экспериментальных моделей, которые позволяют определить экспрессию HIF, а также ее динамику в плаценте и тканях плода в физиологических условиях и условиях экспериментально созданной гипоксии.
Цель исследования — изучить экспрессию HIF-1α в тканях плаценты и мозга плодов самок кролика в условиях нарушенного и ненарушенного плацентарного кровообращения.
Материал и методы
Объектом экспериментального исследования явились 33 самки кролика породы шиншилла массой 3856,1±234,2 г. Плацента кролика формируется по гемохориальному типу, аналогично плаценте человека. Это позволяет экстраполировать и сопоставлять процессы, происходящие в ней, с таковыми, наблюдающимися в плаценте человека. Матка самки кролика двурогая, что дает возможность создавать путем хирургической перевязки преплацентарных сосудов плацентарную недостаточность в одном роге матки, оставляя интактным другой. Использование подобной экспериментальной модели дает возможность сопоставить реакции нормально развитых и отставших в развитии плодов в едином организме матери.
Самок кролика, включенных в исследование, содержали в регламентированных условиях вивария ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России. Спаривание самки с самцом осуществляли ежедневно, в одно и то же время, дважды в день. Следующий день после покрытия считали первым днем беременности.
Основную группу составили 25 животных. В асептических условиях под ингаляционным изофлурановым наркозом (аппарат ИН «Колибри VOC», испаритель «МИНИВАП-20/S», ООО «МИТК-М», Россия) самкам данной группы на 18-й день беременности проводили лапаротомию срединным разрезом. Для устранения кожной чувствительности в кожу брюшной стенки в области предполагаемого разреза самке вводили новокаин (1% раствор 10 мл). Двурогую матку выводили в рану, проводили подсчет плодов с последующей перевязкой 1/3 преплацентарных сосудистых ветвей в одном маточном роге у каждого второго плодовместилища (по методу М.М. Вартанян, 1973) (рис. 1 на цв. вклейке) [14].
Рис. 1. Наложение лигатур на 1/3 преплацентарных сосудистых ветвей в одном маточном роге двурогой матки самки кролика.
Fig. 1. The imposition of ligatures on 1/3 of the preplacental vascular branches in one uterine horn of the two-horned uterus of a female rabbit.
Плодов в перевязанном маточном роге считали подопытными, плодов другого маточного рога — интактными. Продолжительность операции составляла около 15 мин.
После окончания операции животное самостоятельно просыпалось и занимало в дальнейшем характерное для себя сидячее положение. На 28-й день гестации проводили забор крови у самки кролика из ушной вены, а затем под тиопенталовым наркозом (5% 0,5 мл на 1 кг массы тела) животное умерщвляли методом воздушной эмболии с последующей посмертной лапаротомией. В дальнейшем осуществляли подсчет общего числа и числа выживших плодов в обоих маточных рогах. Все плоды взвешивали и проводили забор тканей плацент и мозга плодов. На рис. 2 на цв. вклейке представлены плоды самки основной группы.
Рис. 2. Подопытный и интактный плоды самки кролика основной группы.
Fig 2. Experimental and intact fetuses of a female rabbit of the main group.
Полученный материал тщательно отделяли от оболочек, взвешивали и помещали в 10% раствор забуференного нейтрального формалина. Кровь из ушной вены самки кролика центрифугировали, полученную сыворотку замораживали в морозильной камере при температуре –20°C.
Группу сравнения составили 8 самок, которым с целью изучения влияния анестезии на параметры фетоплацентарного комплекса на 18-й день беременности осуществляли анестезиологическое пособие без оперативного вмешательства. Дальнейший дизайн эксперимента был аналогичным таковому в основной группе самок.
Экспрессию HIF-1α в тканях плаценты и мозга плодов основной группы самок и самок группы сравнения определяли иммуногистохимическим методом с помощью набора BF 8002 (антитело к HIF-1α alpha Mouse mAb, США). Для исследования использовали материал плацент и мозга наименьших плодов подопытного рога и наибольших плодов интактного рога.
Экспрессию HIF-1α в крови у самок кролика оценивали иммуноферментным способом (ИФА) с помощью набора SEA 798Rb (США).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета Microsoft Excel. При нормальном распределении рассчитывали среднее значение (М), стандартную ошибку среднего (SEM), медиану (Me), использовали t-тест для определения статистической значимости. Для выявления возможной связи между показателями проводили корреляционный анализ с определением коэффициента корреляции Спирмена. Для качественных данных и определения статистической значимости рассчитывали частоты и использовали точный тест Фишера. Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически значимыми при р<0,05.
Экспериментальная работа проведена в соответствии с Федеральным законом от 12.04.10 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств»1, «Правилами лабораторной практики»2, 3, Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержании вивариев4 и решением локального этического комитета ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России, регламентирующими проведение научно-исследовательских работ с использованием лабораторных животных5. Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдались в соответствии с European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (1996) [15]. Перед началом исследования его план и стандартные операционные процедуры рассмотрены и утверждены этическим комитетом ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России.
Результаты
В табл. 1 представлена выживаемость плодов в сопоставляемых группах самок кролика. Как следует из табл. 1, выживаемость подопытных плодов самок основной группы была на 19% меньше, чем интактных плодов самок этой группы (p<0,05). При этом у интактных плодов самок основной группы и плодов самок группы сравнения выживаемость не различалась.
Таблица 1. Выживаемость плодов, развивавшихся в условиях нормального (интактные) и уменьшенного (подопытные) плацентарного кровообращения, у самок основной группы и группы сравнения
| Самки | Плоды самок | Количество плодов всего / в том числе живых | Выжившие плоды, % | p |
| Основная группа | Подопытные | 44/26* | 59 | 0,037 |
| Интактные | 83/65 | 78 | 0,41 | |
| Группа сравнения | Интактные | 52/37 | 71 | 0,28 |
Примечание. * — p<0,05 по сравнению с интактными плодами.
В табл. 2 представлены физиологические параметры плодов, плацент и мозга плодов самок сопоставляемых групп. Как следует из табл. 2, у самок основной группы масса подопытных плодов была в 1,2 раза меньше массы интактных плодов (p=0,0007), при этом масса интактных плодов самок основной группы и плодов самок группы сравнения не различалась.
Таблица 2. Масса плацент и плодов, развивавшихся в условиях нормального (интактные) и уменьшенного (подопытные) плацентарного кровообращения, у самок основной группы и группы сравнения
| Параметры | Плоды самок основной группы | Плоды самок группы сравнения (n=37) | |
| подопытные (n=22) | интактные (n=56) | ||
| Масса плодов, г | 42,2±1,43* (Me=43,5) | 50,0±1,25 (Me=51,75) | 49,1±0,78 (Me=50,2) |
| Масса ткани мозга, г | 1,0±0,07* (Me=1,0) | 1,4±0,05 (Me=1,3) | 1,4±0,04 (Me=1,5) |
| Масса плацент, г | 6,05±0,21* (Me=6,05) | 6,7±0,15♦ (Me=6,5) | 5,2±0,10 (Me=5,0) |
Примечание. n — количество плодов; * — p<0,05 по сравнению с интактными плодами; ♦ — p˂0,05 по сравнению с плодами группы сравнения.
Масса мозга подопытных плодов самок основной группы была в 1,4 раза меньше массы мозга интактных плодов самок этой группы (p<0,0001). Масса ткани мозга интактных плодов самок основной группы и таковых плодов самок группы сравнения не различалась. Корреляционный анализ показал, что у плодов самок исследуемых групп имеется прямая зависимость между массой их тела и массой мозга (r=0,44, p<0,0001).
Проведено сопоставление массы плацент у подопытных и интактных плодов самок основной группы. Выявлено, что масса плацент подопытных плодов была меньше в 1,1 раза массы плацент интактных плодов (p=0,02). Масса плацент плодов самок группы сравнения была в 1,3 раза меньше массы плацент интактных плодов самок основной группы (p<0,0001). Корреляционный анализ установил наличие прямой корреляционной связи между массой плацент и массой плодов, а также массой их мозга (r1=0,36, p1<0,0001; r2=0,32, p2=0,0002 соответственно).
Поскольку наличие и степень задержки роста плода может характеризовать плацентарно-плодовый индекс, являющийся индикатором циркуляторно-метаболического равновесия фетоплацентарной системы [16], нами проведена оценка данного параметра у плодов основной группы самок. У подопытных и интактных плодов самок основной группы плацентарно-плодовый индекс не различался (0,14±0,004 и 0,15±0,005 ед. соответственно, p>0,05).
Проведена оценка экспрессии HIF-1α в тканях плаценты и мозга плодов самок основной группы и плодов группы сравнения (табл. 3). Как следует из табл. 3, у подопытных плодов самок основной группы экспрессия HIF-1α в ткани мозга была в 6 раз выше, чем у интактных плодов самок этой группы (p=0,0001). Экспрессия HIF-1α в мозгу у интактных плодов самок основной группы и плодов самок группы сравнения не различалась. У плодов самок обеих групп выявлена обратная корреляционная зависимость между экспрессией HIF-1α в ткани мозга плодов и массой плодов, а также массой их мозга (r1=–0,29, p1=0,02; r2=–0,29, p2=0,03 соответственно).
Таблица 3. Площадь экспрессии HIF-1α в плацентах и ткани мозга плодов самок сопоставляемых групп
| Площадь экспрессии HIF-1α, % | Плоды самок основной группы | Плоды самок группы сравнения (n=12) | |
| подопытные (n=26) | интактные (n=21) | ||
| Мозг плода | 1,26±0,2* (Me=1,25) | 0,22±0,08 (Me=0,05) | 0,37±0,13 (Me=0,13) |
| Плацента | 0,64±0,10* (Me=0,39) | 0,23±0,04 (Me=0,18) | 0,39±0,10 (Me=0,40) |
Примечание. n — количество плодов; * — p<0,05 по сравнению с интактными плодами.
Экспрессия HIF-1α в ткани плацент подопытных плодов самок основной группы была в 3 раза выше, чем у интактных плодов самок этой группы (p=0,0005). При этом экспрессия HIF-1α в ткани плацент интактных плодов самок основной группы и плодов самок группы сравнения не различалась. У плодов самок обеих групп корреляционный анализ показал наличие обратной связи между экспрессией HIF-1α в плаценте и массой плодов (r1=–0,36, p1=0,005), однако связь между экспрессией HIF-1α в плаценте и массой ткани мозга не обнаружена.
На рис. 3 на цв. вклейке представлена экспрессия HIF-1α в субвентрикулярном отделе головного мозга подопытных (а) и интактных (б) плодов самок основной группы. Обращает внимание высокая экспрессия HIF-1α в ткани мозга подопытных плодов самок основной группы по сравнению с интактными плодами этой группы.
Рис. 3. Экспрессия индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа (HIF-1α) в ткани мозга плодов в субвентрикулярном отделе у подопытных плодов (а) и интактных плодов (б) самки кролика основной группы.
Fig 3. Expression of HIF-1α in fetal brain tissue in the subventricular region of experimental fetuses (a) and intact fetuses (b) of a female rabbit of the main group.
Проведена сравнительная оценка содержания HIF-1α в крови самок сопоставляемых групп. Анализ показал, что у самок группы сравнения содержание HIF-1α было выше, чем у самок основной группы (3,80±2,47 и 2,18±1,70 пг/мл соответственно, p<0,05). Экспрессия HIF-1α в крови самок кролика не зависела от площади экспрессии HIF-1α в ткани мозга плодов и их плацент, а также от массы плодов, их мозга и плацент.
Таким образом, у плодов, которые развивались в условиях уменьшенного плацентарного кровотока, была меньше масса тела, мозга и плаценты на фоне высокой экспрессии HIF-1α в мозгу и плаценте.
Обсуждение
Экспериментальная модель хронической плацентарной недостаточности, которая использована в нашем исследовании, предложена М.М. Вартанян (1973) [14]. Ряд авторов применяли эту модель для изучения патофизиологических механизмов развития ХПН и функционального состояния нормально развитых и отставших в развитии плодов, развивающихся в едином организме матери, а также для изучения сократительной деятельности матки в индуцированных родах [17, 18].
Наше исследование при перевязке 1/3 преплацентарных сосудов показало, что у подопытных плодов самок основной группы выживаемость была на 19% ниже, чем у интактных. В работе Н.Г. Павловой и А.А. Яковлевой (2020) показано, что выживаемость плодов самок кролика в подопытном роге была ниже на 29,3%, чем плодов в интактном роге [19]. Различия в выживаемости могут объясняться числом перевязанных ветвей преплацентарных сосудов. В нашем исследовании выживаемость плодов самок группы сравнения, которым не проводили оперативное вмешательство, не отличалась от выживаемости интактных плодов самок основной группы. Это дало нам основание считать, что изменения у подопытных плодов по массе тела, плаценты и мозга связаны только с выполненной перевязкой преплацентарных сосудов.
В подопытном роге у самок основной группы создана умеренная плацентарная недостаточность, о чем свидетельствовала более низкая (на 15,6%) масса подопытных плодов по сравнению с интактными. В работе М.М. Габаевой и соавт. (2011) получены аналогичные результаты: масса подопытных плодов самок кролика была в 1,2 раза меньше массы интактных плодов [20]. Это показывает, что создаваемая в подопытном роге дозированная плацентарная недостаточность приводит к развитию хронической плацентарной недостаточности, сопровождающейся задержкой роста плодов. В нашем исследовании подопытные плоды самок кролика основной группы помимо массы тела имели более низкую массу мозга. Современные статистические данные показывают, что у новорожденных, которые антенатально или интранатально имели системную гипоксию, развиваются морфофункциональные нарушения со стороны центральной нервной системы. Тяжелое гипоксическое повреждение может вызывать снижение пролиферации клеток в субвентрикулярной зоне [21, 22]. В доклинических исследованиях с использованием экспериментальной модели гипоксии на мышах замечено, что вследствие воздействия гипоксии на головной мозг происходит расширение субвентрикулярной зоны контралатерального полушария [23]. В работе R.V. Simões и соавт. (2015), в которой проводили перевязку 40—50% преплацентарных сосудов самкам кролика на 25-й день беременности, также показано, что меньшая масса плодов при рождении ассоциирована с меньшими размерами их мозга [24]. Кроме того, по данным спектрометрии, у плодов с задержкой развития в коре головного мозга и гиппокампе определены низкие уровни аспартата и N-ацетиласпартата (NAA) и более высокие уровни глицина как возможного маркера поражения головного мозга вследствие гипоксии. Эти метаболические изменения ассоциированы с нейроструктурными изменениями головного мозга, оцененными с помощью магнитно-резонансной томографии. Напротив, в исследовании L.S. Cahill и соавт. (2019), где использована экспериментальная модель хронической гипоксии на мышах, у плодов, подвергшихся гипоксии, по данным магнитно-резонансного томографического исследования, отсутствовали структурные изменения головного мозга, однако объемы печени и легких были уменьшены на 22% и 27% соответственно [25]. Кроме того, у этих плодов, по данным доплерометрического исследования, был на 69% увеличен церебральный кровоток, при этом легочный кровоток снижен на 62%. Эти явления связаны с адаптивно-приспособительными реакциями плодов при гипоксии.
В нашей работе низкая масса плодов и их мозга, напротив, ассоциирована с высокой экспрессией HIF-1α в ткани мозга. Гипоксия инактивирует ферменты PHD и FIH, которые в условиях нормоксии приводят к деградации HIF-1α, в связи с чем происходит запуск экспрессии гипоксиязависимых генов, таких как гены эритропоэтина (EPO) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Под влиянием гипоксии происходит активация ядерных факторов транскрипции, что ведет к повышению продукции провоспалительных цитокинов. В неонатальном периоде системная гипоксия значительно индуцирует экспрессию HIF-1α в коре головного мозга и гиппокампе [26]. Так, H. Kletkiewicz и соавт. (2018) в своей работе показали, что активация HIF-1α представляет собой быстро реагирующую и адаптивную систему в незрелом мозге, особенно в областях, наиболее восприимчивых к повреждению, вызванному гипоксией [27]. В работе Ю.И. Кировой (2016), в которой использована модель гипобарической и гипербарической гипоксии на мышах, показано, что индуцируемая гипоксией сукцинатзависимая срочная экспрессия транскрипционного фактора HIF-1α тканеспецифична, фенотипична и дозозависима [28].
Имеются данные об изучении экспрессии HIF-1α не только в центральной нервной системе, а также в тканях легких и сердца, однако в акушерстве такие работы немногочисленны. В исследовании на новорожденных ягнятах, родившихся преждевременно, на 115-й день беременности, которым в дальнейшем проводили искусственную вентиляцию легких в течение 4 ч, выявлено снижение экспрессии HIF-1α в ткани легких [29]. Авторы связывают это с повышением активности PHD. Вследствие уменьшения количества экспрессии HIF-1α снижается продукция VEGF, что приводит к бронхолегочной дисплазии. H. Figueroa и соавт. (2017) описали в своей работе повышение экспрессии HIF-1α в ткани сердца отставших в развитии плодов самок кролика, продемонстрировав окислительное повреждение, повышение NO-связанных ферментов и расширение коронарных сосудов при нарушении маточно-плацентарного кровообращения [30].
В нашем исследовании помимо массы плодов и массы их мозга определяли также массу плацент подопытных плодов самок кролика основной группы: она была в 1,1 раза меньше, чем интактных. Другие данные получили Н.Г. Павлова и соавт. (2020), по данным которых масса плацент подопытных и интактных плодов не различалась [31]. Несмотря на то что масса тела плодов и масса их мозга была меньше, плодово-плацентарный коэффициент у подопытных и интактных плодов самок основной группы не различался, это дало основание считать, что созданная нами ХПН носила умеренный характер. Значительные отклонения плодово-плацентарного коэффициента могли быть достигнуты путем перевязки большего числа преплацентарных сосудов, однако более грубое оперативное вмешательство при перевязке преплацентарных сосудов может привести к высокой летальности плодов, что доказано в работе М.М. Вартанян. Однако экспрессия HIF-1α в плацентах была выше и обратно коррелировала с массой плодов. В предыдущем нашем исследовании изучена экспрессия HIF-1α в плацентах в конце беременности у женщин с ХПН, родоразрешенных путем операции кесарева сечения в связи с нарушениями функционального состояния плода по данным КТГ [32]. Установлено, что при таких акушерских осложнениях экспрессия HIF-1α в плацентах выше, чем в плацентах женщин при физиологической беременности в сопоставимые сроки. В работе R.E. Albers и соавт. (2019) показано, что длительная экспрессия трофобласт-специфического HIF-1α приводит к задержке роста и развития плода, кроме того, при высокой длительной экспрессии HIF-1α наблюдаются значительные изменения в процессах дифференцировки плаценты, которые включают нарушения морфогенеза ветвления и неспособность ремоделирования материнских спиральных артерий. Эти изменения могут участвовать в патогенезе преэклампсии [33].
Однако выявить корреляционную связь площади экспрессии HIF-1α в плацентах и мозгу плодов с экспрессией HIF-1α в крови самок кролика не удалось, что может объясняться как степенью экспериментально созданной гипоксии, так и влиянием на содержание HIF-1α в крови самок наличия в их организме одновременно подопытных и интактных плодов.
Заключение
Таким образом, наше исследование показало, что уровень индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа при экспериментально созданной задержке роста плода повышается в плаценте и мозгу, что доказывает перспективность использования его как маркера гипоксии. Нами обнаружена четкая зависимость между показателями массы плодов и массы их мозга и экспрессией указанного фактора в ткани мозга плодов, что подтверждает значительное патологическое влияние гипоксии на головной мозг как наиболее метаболически активный орган. Однако при этом не обнаружена связь с экспрессией индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа в крови самки кролика, поэтому исследования должны быть продолжены, поскольку экспериментальная модель комбинированная и в едином организме самки кролика находятся одновременно две группы плодов — нормально развитые и отставшие в развитии.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1Федеральный закон от 12.04.10 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств».
2Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».
3Приказ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 02 декабря 2009 г. №544-ст. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
4Постановление главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.08.14 №51 (зарегистрировано в Минюсте России 31.10.14 №34547) «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)».
5Протокол №001_АГ1/1_45 от 01.03.2019 г.