Введение
В настоящее время во всем мире активно проводится вакцинация от COVID-19 с использованием недавно зарегистрированных вакцин. Однако влияние этих вакцин на репродуктивное здоровье мужчин на текущий момент не исследовано.
Ранее Общество по изучению репродуктивного здоровья мужчин (Society for the Study of Male Reproduction — SSMR) совместно с Обществом по репродуктивному здоровью мужчин и урологии (Society for Male Reproduction and Urology — SMRU) опубликовало рекомендации, включающие следующие положения:
— не следует отказывать в проведении вакцинации против COVID-19 мужчинам, заинтересованным в реализации репродуктивной функции;
— вакцины против COVID-19 должны быть предложены в равной степени всем мужчинам, вне зависимости от их заинтересованности в реализации репродуктивной функции [1].
Результаты первого исследования, посвященного влиянию вакцины против COVID-19 на показатели спермограммы, которое было проведено M. Safrai и соавт., продемонстрировали отсутствие изменений в параметрах спермограммы после проведения вакцинации мРНК-вакциной BNT162b2 (Pfizer/BioNTech). В данное исследование были включены 43 мужчины, среди которых у 14 диагностировано бесплодие, а у 29 наблюдались нормальные результаты спермограммы. Авторами было отмечено, что после вакцинации против COVID-19 ни один из показателей спермограммы существенным образом не изменился [2]. Несмотря на актуальность данного исследования, важно отметить, что статья M. Safrai и соавт. была опубликована в качестве препринта, что означает отсутствие независимого рецензирования экспертами. Более того, в статье не указан временной промежуток с момента вакцинации до проведения анализа эякулята.
Аналогичное исследование было осуществлено D. Gonzalez и соавт., которые провели анализ показателей спермограммы 45 мужчин репродуктивного возраста до проведения вакцинации против COVID-19 и через 70 дней после введения второго компонента мРНК-вакцины BNT162b2 (Pfizer/BioNTech) или mRNA-1273 (Moderna). Авторы не выявили выраженного изменения показателей спермограммы после проведения вакцинации против COVID-19. Стоит также отметить, что данные результаты были опубликованы в качестве «научного письма» (research letter) и не содержит подробных данных относительно проведенного исследования [3].
Материал и методы
Настоящее исследование было проведено на базе Городской клинической больницы №15 им. О.М. Филатова. В исследование были включены 10 мужчин в возрасте от 18 до 50 лет.
Для оценки влияния вакцины «Гам-КОВИД-Вак» («Спутник V») на мужскую фертильность было проведено комплексное обследование, включающее анализ показателей спермограммы (параметры концентрации, подвижности, морфологии сперматозоидов; MAR-тест), клинический и биохимический анализ крови, оценку параметров гормонального профиля (общий тестостерон, эстрадиол, ФСГ, ЛГ, пролактин), выявление сопутствующих урологических заболеваний (сбор анамнеза, физикальное обследование наружных половых органов и простаты). Результаты данного этапа исследования были опубликованы ранее [4].
Исследуемую группу составили 6 мужчин, планирующие проведение вакцинации от COVID-19 векторной вакциной «Гам-КОВИД-Вак» («Спутник V») Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. В группу сравнения были включены четверо мужчин, не заинтересованных в вакцинации от COVID-19.
Все пациенты, включенные в исследование, были четко инструктированы о сборе образцов эякулята в стерильный контейнер после не менее 48-часового и не более 5—7-дневного воздержания. Образцы эякулята пациентов исследуемой группы были получены до вакцинации и через 75 дней после введения второго компонента вакцины «Гам-КОВИД-Вак». Образцы эякулята пациентов группы сравнения были получены с аналогичным временным интервалом.
Выделение и секвенирование РНК
Выделение РНК из образцов эякулята проводилось с помощью универсального набора QIAGEN RNeasy Plus Universal Mini Kit в соответствии с протоколом производителя. Для измерения концентрации РНК использовали наборы RNA 6000 Nano и Qubit RNA Assay. Число целостности РНК (RIN) измеряли с помощью биоанализатора Agilent 2100. Для деплеции рибосомальной РНК и конструирования библиотек использовали набор KAPA RNA Hyper. Для мультиплексирования образцов в одном цикле секвенирования использовались разные адаптеры. Концентрация и качество библиотеки измерялись с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay (Life Technologies) и Agilent TapeStation. Секвенирование РНК было выполнено с использованием оборудования Illumina NextSeq 550 в режиме одноконцевого прочтения, длина прочтения — 75 п.н., получено примерно 30 млн сырых прочтений на образец. Демультиплексирование проводили с помощью программы Illumina Bcl2fastq2 v. 2.17.
Биоинформатический анализ
Файлы FASTQ, полученные после секвенирования РНК, были обработаны с помощью программного обеспечения STAR в режиме Gene Counts с аннотацией транскриптома человека от Ensembl (версия сборки генома GRCh38 и аннотация транскриптов GRCh38.89). Идентификаторы генов Ensembl были преобразованы в символы генов HGNC с использованием полного набора данных HGNC (https://www.genenames.org; версия базы данных от 13 июля 2017 г.). Уровни экспрессии были установлены для 36 596 аннотированных генов с соответствующими идентификаторами HGNC. Минимальное количество однозначно картированных прочтений составило 3,41 млн для исследуемых биопроб при среднем значении 15,95 млн. Анализ дифференциальной экспрессии генов выполняли с использованием программного обеспечения DESeq2 со следующими пороговыми значениями: скорректированное р-значение FDR <0,05 и | log2 (кратности изменения) | > 1. Дифференциальные гены визуализированы с помощью R-пакета EnhancedVolcano.
Результаты
Мы выполнили секвенирование РНК (РНКсек) образцов спермы, полученных до и после вакцинации (n=6), или контрольных образцов, взятых с таким же временным интвервалом (n=4). Всего было получено 10 РНКсек-профилей, статистика картирования представлена в таблице.
Таблица. Статистика картирования прочтений
| # | До/после вакцинации/контроля | РНКсек-идентификатор | Уникально картированные прочтения, млн |
| 1 | До | 1-1_S1_ME_L001_R1_001 | 22,02 |
| 1 | После | 1-3_S2_ME_L001_R1_001 | 18,03 |
| 10 | До | 10-1_S10_ME_L001_R1_001 | 14,83 |
| 10 | После | 10-3_S11_ME_L001_R1_001 | 10,94 |
| 17 | До | 17-1_S3_ME_L001_R1_001 | 17,87 |
| 17 | После | 17-3_S4_ME_L001_R1_001 | 11,60 |
| 31 | До | 31-1_S9_ME_L001_R1_001 | 20,27 |
| 31 | После | 31-3_S10_ME_L001_R1_001 | 18,87 |
| 34 | До | 34-1_S12_ME_L001_R1_001 | 17,07 |
| 34 | После | 34-3_S13_ME_L001_R1_001 | 16,92 |
| 39 | До | 39-1_S16_ME_L001_R1_001 | 3,41 |
| 39 | После | 39-3_S17_ME_L001_R1_001 | 12,42 |
| 42 | До | 42-1_S5_ME_L001_R1_001 | 17,19 |
| 42 | После | 42-3_S6_ME_L001_R1_001 | 20,55 |
| 43 | До | 43-1_S14_ME_L001_R1_001 | 14,85 |
| 43 | После | 43-3_S15_ME_L001_R1_001 | 10,46 |
| 44 | До | 44-1_S11_ME_L001_R1_001 | 18,21 |
| 44 | После | 44-3_S12_ME_L001_R1_001 | 20,80 |
| 46 | До | 46-1_S18_ME_L001_R1_001 | 14,64 |
| 46 | После | 46-3_S13_ME_L001_R1_001 | 18,11 |
Далее был проведен кластерный анализ исследуемых образцов. Для этого были логарифмированы нормализованные количества прочтений генов при помощи программного обеспечения DESeq2. Полученная дендрограмма показана на рис. 1 на цв. вклейке. Все пары образцов до/после сгруппированы вместе, за исключением двух вакцинированных пациентов: 39 и 46.
Рис. 1. Кластерный анализ логарифмированных значений нормализованной генной экспрессии.
Образцы «до» и «после» показаны зеленым и красным цветом соответственно.
Fig. 1. Cluster analysis of logarithmic values of normalized gene expression.
Также был выполнен анализ главных компонент (PCA) для данных генной экспрессии. Полученные результаты указывают на то, что расстояние между образцами, полученными до и после вакцинации, в среднем выше, чем в контрольной группе (рис. 2 на цв. вклейке), что соответствует кластерному анализу.
Рис. 2. Анализ главных компонент для логарифмированных значений нормализованной генной экспрессии.
Пробы «до» и «после» соединяются линией для каждого пациента. Образцы мужчин группы контроля и мужчин, вакцинированных от COVID-19, показаны синим и оранжевым цветом соответственно.
Fig. 2. Principal component analysis for logarithmic values of normalized gene expression.
На следующем этапе исследования был выполнен парный анализ дифференциальной экспрессии генов между образцами, полученными до и после вакцинации. В образцах, полученных после вакцинации, выявлено 13 статистически значимых дифференциальных генов с повышенной экспрессией: C2orf16, FAM153A, LINC01095, PRSS37, LINC01921, SPATA31D5P, DAB1-AS1, DDX4, MIR7515HG, CEP152, ENAM, FAM186A, SORCS3-AS1 (рис. 3 на цв. вклейке). Не было выявлено статистически значимых терминов генной онтологии (GO), связанных с указанным набором генов. Также не было выявлено генов, экспрессия которых была бы значимо снижена после проведения вакцинации.
Рис. 3. Распределение дифференциальных генов по логарифму кратности изменения и логарифму p-значения между образцами пациентов 31, 39, 42, 43, 44 и 46, полученными до и после вакцинации.
Порог FDR-корректированного p-значения — 0,05. Порог для модуля двоичного логарифма кратности изменения — 1.
Fig. 3. Distribution of differential genes by logarithm of multiplicity of change and logarithm of p-value between patient samples 31, 39, 42, 43, 44, and 46 obtained before and after vaccination.
Далее был проведен анализ дифференциальной экспрессии между контрольными образцами, взятыми с аналогичным временным интервалом. Статистически значимых дифференциально экспрессирующихся генов в результате данного анализа выявлено не было (рис. 4 на цв. вклейке).
Рис. 4. Распределение дифференциальных генов по логарифму кратности изменения и логарифму p-значения между образцами пациентов 1, 10, 17 и 34, полученными для контрольных образцов, взятых с тем же временным интервалом, что и для вакцинированных пациентов.
Порог FDR-корректированного p-значения — 0,05. Порог для модуля двоичного логарифма кратности изменения — 1.
Fig. 4. Distribution of differential genes by logarithm of fold change and logarithm of p-value between patient samples 1, 10, 17, and 34, obtained for control samples taken at the same time interval as the vaccinated patients.
Обсуждение
В данном исследовании был проведен сравнительный анализ образцов эякулята двух исследуемых групп мужчин репродуктивного возраста на уровне экспрессии генов. В исследуемой группе образцы эякулята получены до вакцинации и через 75 дней после введения второго компонента вакцины, в группе сравнения образцы эякулята получены с аналогичным временным интервалом. Не было обнаружено статистически значимо дифференциально экспрессирующихся генов в образцах эякулята мужчин группы сравнения. В то же время в результате сравнительного анализа образцов эякулята, полученных до и после вакцинации, выявлено 13 генов, экспрессия которых достоверно повышена в образцах эякулята, полученных после вакцинации. Согласно базе данных Gene от NCBI и проекту «Атлас протеома человека» (HPA; https://doi.org/10.1074/mcp.M113.035600), 9 из указанных 13 генов экспрессируются исключительно в семенниках: LINC01095, PRSS37, LINC01921, SPATA31D5P, DAB1-AS1, DDX4, MIR7515HG, SORCS3-AS1, FAM186A, а экспрессия генов FAM153A и CEP152 повышена в семенниках и ряде других тканей. Два гена из вышеуказанных кодируют длинные некодирующие РНК (LINC01095, LINC01921), один ген — микроРНК (MIR7515HG), один ген — псевдоген (SPATA31D5P), два гена — антисмысловую РНК (DAB1-AS1, SORCS3-AS1), пять генов являются белок-кодирующими (PRSS37, DDX4, FAM153A, CEP152, FAM186A). Ген CEP152 кодирует центросомный белок [5], а функция генов FAM153A и FAM186A неизвестна. Ген DDX4 кодирует хеликазу, и ранее было показано, что метилирование данного гена (а следовательно, и его пониженная экспрессия) ассоциировано с остановкой созревания сперматозоидов [6]. Ген PRSS37, в свою очередь, кодирует сериновую протеазу, низкий уровень которой в образце эякулята, по данным литературы, ассоциирован с идиопатическим мужским бесплодием [7].
В ранее проведенном исследовании мы выявили, что в образцах эякулята, полученных после перенесенного COVID-19, снижена экспрессия митохондриальных генов и изменен уровень активации сигнальных путей Toll-подобных рецепторов [8]. Это потенциально может приводить к нарушению энергетического обмена в сперматозоидах и снижению их подвижности после перенесенного COVID-19. В данной же работе мы продемонстрировали результаты по повышению экспрессии 13 генов в образцах эякулята, полученных после проведения вакцинации от COVID-19. Интересно отметить, что, по данным литературы, сниженная экспрессия двух генов из вышеуказанных (DDX4 и PRSS37) ассоциирована с идиопатическим мужским бесплодием.
Заключение
Сравнительный анализ образцов эякулята, полученных до вакцинации против COVID-19 векторной вакциной «Гам-КОВИД-Вак» («Спутник V») и через 75 дней после введения второго компонента вакцины, не выявил статистически значимых изменений в функционировании внутриклеточных молекулярных путей. Полученные данные позволяют предположить отсутствие негативного воздействия указанной вакцины на молекулярно-генетические характеристики сперматозоидов у мужчин репродуктивного возраста.
Для формирования финальных выводов об отдаленных последствиях вакцинации против COVID-19, влияющих на репродуктивное здоровье мужчин, необходимо проведение дальнейших масштабных клинических исследований. Однако полученные на сегодняшний момент результаты подтверждают безопасность вакцины «Гам-КОВИД-Вак» («Спутник V») и подчеркивают необходимость вакцинации, которая остается единственным эффективным методом профилактики новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Таким образом, следует рекомендовать вакцинацию против COVID-19 мужчинам репродуктивного возраста для нивелирования вероятности неблагоприятных последствий инфекции, включающих ухудшение параметров эякулята, и влияния в целом COVID-19 на наступление и течение беременности.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.