Поиск причин, механизмов и способов коррекции нарушений в репродуктивной системе является стратегической медико-социальной, демографической и экономической задачей в большинстве развитых стран мира. На сегодняшний день во всем мире около 10% пар репродуктивного возраста страдает бесплодием. В Российской Федерации частота бесплодных пар составляет около 18% [1], а в отдельных регионах России показатель бесплодия приближается к 20% [2].
Одной из теорий возникновения бесплодия при эндометриозе является нарушение рецептивности эндометрия [3, 4]. Рецептивность эндометрия — это способность адекватно реагировать на циклические колебания уровней гормонов крови. Рецептивность эндометрия является необходимым фактором для функциональной полноценности эндометрия в период «имплантационного окна», что обеспечивает успешную имплантацию бластоцисты удовлетворительного качества [5, 6]. Поскольку ключевым звеном в регуляции морфологических и функциональных изменений эндометрия является влияние стероидных гормонов, особый интерес представляет изучение количества и соотношения полноценных прогестероновых (ПР) и эстрогеновых (ЭР) рецепторов в строме и железах эндометрия, так как абсолютное содержание стероидных гормонов в плазме крови не гарантирует полноценной реализации их биологического действия на эндометрий [5, 7].
В ряде исследований отмечено, что эндометриоз характеризуется абсолютной и относительной гиперэстрогенемией и развитием «прогестерон-резистентности» вследствие снижения общего числа ПР [8, 9]. Однако потеря или снижение экспрессии ПР является лишь одной из потенциальных причин резистентности к прогестерону. ПР экспрессируется в основном двумя функционально различными изоформами: ПР-A и ПР-B, транскрибируемыми из двух промоторов в одном и том же гене, в результате чего белок ПР-A на 164 аминокислоты короче, чем ПР-B. ПР-A является основным драйвером функции матки и достаточен для фертильности, эта изоформа способна ингибировать активацию ЭР [8, 10], в то время как ПР-B в меньшей степени участвует в регуляции эндометрия и имеет решающее значение для развития молочной железы и морфогенеза во время беременности, а также способен активировать ЭР [8, 10, 11]. Для надлежащего функционирования эндометрия важно правильное соотношение ПР-A/ПР-B в эндометрии. Известно, что дисбаланс изоформ ПР также задействован в патофизиологии резистентности к прогестерону [10]. В дополнение к дисрегуляции экспрессии ПР в эндометрии при эндометриозе нарушаются многочисленные каскады эпигенетических и молекулярных взаимодействий, необходимых для передачи прогестероновых сигналов [10].
Имеются данные о том, что при эндометриозе наблюдается повышение уровня экспрессии ЭР в эпителии и строме эндометрия [3, 9, 10, 12]. Эстрогеновая активность в эндометрии осуществляется главным образом через связывание его родственных ядерных рецепторов, рецептора эстрогена 1-го типа (ЭР1/ЭРα) и рецептора эстрогена 2-го типа (ЭР2/ЭРβ), которые в отличие от ПР-A и ПР-B транскрибируются из отдельных генов. ЭР1 ответственен главным образом за пролиферацию эндометрия [8, 13—15], в то время как ЭР2 играет роль преимущественно в функции овуляции. Известно, что элиминация ЭР2 у крыс приводила к субфертильности из-за неэффективности овуляции без существенных различий в маточной эстрогеновой реактивности [10, 16]. Уровень экспрессии ЭР1 в эндометрии секреторной фазы у женщин с эндометриозом, как сообщается, находится значительно выше нормы [3, 10, 12, 17]. Данные об экспрессии ЭР2 в эутопическом эндометрии остаются противоречивыми, хотя известно об увеличении соотношения ЭР2/ЭР1-рецепторов в очагах эндометриоза. Предполагается, что именно увеличение экспрессии ЭР2 ответственно за рост эндометриоидных очагов и развитие воспаления в них [10, 15].
Одним из факторов функциональной неполноценности эндометрия при эндометриозе считают дисбаланс гормональных рецепторов, проявляющийся в нарушении соотношения ПР и ЭР в средней стадии фазы секреции, в норме составляющем от 2 до 4 [5, 18, 19].
Большинство исследований направлены на изучение рецептивности эндометрия в фазу секреции, особое внимание уделялось исследованию эндометрия в период «окна имплантации», в то же время недостаточно изучено изменение экспрессии ПР и ЭР при эндометриозе в фазу пролиферации. Логично, что нормальное течение пролиферативной фазы цикла не является гарантией полноценности секреторной трансформации [10, 20], однако многие авторы отмечают необходимость исследования эндометрия на 8—11-й дни цикла для диагностики гиперпролиферативных процессов эндометрия и хронического эндометрита. Для минимизации инвазивных вмешательств в дальнейшей клинической практике мы предприняли попытку исследовать рецепторный статус эндометрия на основании изучения ПР и ЭР в пролиферативной фазе.
Под влиянием стероидных гормонов находится не только секреторная трансформация эндометрия, но и появление пиноподий [5, 21]. Последние относятся к наиболее изученным биомаркерам «окна имплантации». Имеются данные об успешном использовании определения пиноподий в клинической практике для улучшения клинических результатов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), хотя в ряде публикаций подвергается сомнению ценность пиноподий в роли достоверного маркера «окна имплантации» [22]. При идеальном 28-дневном естественном цикле пиноподии начинают формироваться на 17-й день цикла, достигают пика своего развития на 20—21-й дни, после чего подвергаются постепенной инволюции [21]. В настоящем исследовании морфологическая характеристика поверхностного эпителия изучена на образцах эндометрия средней стадии фазы секреции, что соответствует пику развития пиноподий. В зависимости от доли поверхностного эпителия эндометрия, занимаемого пиноподиями, выделяют три класса: обильные (более 50%), умеренные (20—50%) и немногочисленные (менее 20%) пиноподии [21]. Прогностически благоприятным признаком считаются только обильные пиноподии [23].
Цель исследования — анализ морфофункционального состояния эндометрия и его рецептивности у пациенток с эндометриозом яичников до и после хирургического лечения.
материал и методы
Дизайн исследования
Эта работа относится к обсервационным (наблюдательным) проспективным выборочным исследованиям.
Критерии соответствия и формирование групп
Базовыми критериями включения в исследование являлись: репродуктивный возраст и наличие эндометриоидной кисты яичников, подтвержденной морфологически после проведения цистэктомии. Согласно болонским критериям ESHRE [24], в зависимости от прогноза наступления беременности выборка разделена на две группы. В 1-ю группу включены женщины с умеренно сниженным овариальным резервом — пациентки, страдающие вторичным бесплодием менее 3 лет, с самостоятельными беременностями в анамнезе, с уровнем антимюллерова гормона (АМГ) в венозной крови больше 0,8 нг/мл, односторонним поражением яичников, эндометриоидной кистой менее 3 см в диаметре. Во 2-ю группу включены женщины со значительно сниженным овариальным резервом — пациентки, страдающие вторичным бесплодием более 3 лет, с отсутствием беременностей в анамнезе, с уровнем АМГ в венозной крови менее 0,8 нг/мл, двусторонним поражением яичников или эндометриоидной кистой более 3 см в диаметре.
Условия проведения
Все пациентки проходили лечение в гинекологическом отделении ГБУЗ Москвы «Городская клиническая больница №31 Департамента здравоохранения Москвы».
Продолжительность исследования
Пациентки, вошедшие в исследование, наблюдались проспективно в период 2018—2019 гг.
Описание медицинского вмешательства, методов регистрации и анализа данных
Каждой пациентке проведена операция в объеме эндоскопической цистэктомии. На дооперационном этапе, а также по истечении 3 и 6 мес после операции пациенткам выполняли аспирационную биопсию эндометрия в среднюю стадию фазы пролиферации и фазы секреции. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30 (Leica Microsystems, Германия) заливали в парафин на станции Leica EG 1150. Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином в автоматической станции Leica ST 5010. Микроскопическое исследование осуществляли на триокулярном микроскопе Leica DMLB (окуляры с увеличением ×10) с использованием цифровой камеры Leica DFC 420. В полученных микропрепаратах проводили гистологическую оценку фазы и стадии менструального цикла, выявляли сопутствующую патологию эндометрия.
Дополнительно проведены иммуногистохимические (ИГХ) и морфометрические методы исследования. В биоптатах, взятых в средней стадии фазы пролиферации, исследовали уровень экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в железах и строме эндометрия. ИГХ-окрашивание производилось в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (Ventana Medical Systems, США) с использованием антител: Ventana CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (США), связывающихся с ПР-A и ПР-B, и Ventana CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (США), связывающихся с ЭР1. Микроскопическое исследование осуществлялось на триокулярном микроскопе Leica DMLB (окуляры с увеличением ×10) с использованием цифровой камеры Leica DFC 420 (Leica Microsystems, Германия).
Оценку ИГХ-реакции производили полуколичественным методом с использованием стандартного подхода: осуществляли подсчет числа клеток с положительной ядерной экспрессией на 100 клеток в 10 полях зрения при увеличении ×200. Результаты ИГХ-реакции для ПР и ЭР оценивали в баллах по шкале Allred, в которой процент позитивных клеток оценивали от 0 до 5 баллов, а интенсивность окрашивания — от 0 до 3 (табл. 1). Сумма двух показателей (TS) являлась критерием сравнения рецепторного статуса пациенток и легла в основу статистических расчетов в исследуемой выборке [25, 26].
Таблица 1. Шкала оценки экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов по Allred
| Доля клеток с окрашенными ядрами, % | Оценка пропорции (PS, proportion score), баллы |
| 0 | 0 |
| 0—1 | 1 |
| 1—10 | 2 |
| 10—30 | 3 |
| 30—60 | 4 |
| >60 | 5 |
| Интенсивность окрашивания ядер | Оценка интенсивности (IS, intensity score), баллы |
| нет (негативное окрашивание) | 0 |
| слабое | 1 |
| умеренное | 2 |
| сильное | 3 |
Примечание. TS=PS+IS; TS=0—2 — негативный результат; TS ≥3 — позитивный результат.
Референсными значениями при статистической обработке уровней экспрессии стероидных гормонов явились описанные в научной литературе данные, полученные в средней стадии фазы пролиферации у женщин в возрасте 18—40 лет с регулярным менструальным циклом, отсутствием гормональной терапии в предыдущие 6 мес., с нормальным гинекологическим статусом и уровнем прогестерона, А4-андростендиона и тестостерона в плазме и овуляцией на 14±2-й день (±SD) во всех циклах, во время которых выполнена биопсия эндометрия. День овуляции определяли по уровню прогестерона в плазме и базальной температуре тела. Таким образом, получены следующие значения уровней экспрессии рецепторов к стероидным гормонам (табл. 2) [27].
Таблица 2. Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам в эндометрии в средней стадии фазы пролиферации у здоровых женщин
| Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам в эндометрии | Медиана | Минимальное значение — максимальное значение (min—max) | Нижний квартиль; верхний квартиль |
| ЭР в клетках стромы | 5 | 5—6 | 5; 6 |
| ЭР в клетках желез | 5 | 4—6 | 5; 5 |
| ПР в клетках стромы | 4 | 4—5 | 4; 4 |
| ПР в клетках желез | 4 | 4—5 | 4; 4 |
Примечание. ЭР — эстрогеновые рецепторы; ПР — прогестероновые рецепторы.
В биоптатах, взятых в среднюю стадию фазы секреции, исследовали строение поверхностного эпителия эндометрия с использованием морфометрических методов. Определялось процентное количество клеток, содержащих на своей апикальной поверхности пиноподии, путем подсчета в 10 полях зрения в световом микроскопе Leica DMLB при увеличении ×400 [25, 26]. Расчет статистических параметров осуществляли в программе Statistica 64 version 12.
Результаты
Объекты (участники) исследования
Обследованы 172 пациентки репродуктивного возраста (от 26 до 40 лет, медиана 32 года). В 1-ю группу (женщины с умерено сниженным овариальным резервом) включены 58 пациенток, во 2-ю группу (женщины со значительно сниженным овариальным резервом) — 114 пациенток. Из них 28 пациенткам выполнены ИГХ и морфометрические исследования биоптатов эндометрия: 10 пациенткам 1-й группы и 18 пациенткам 2-й группы.
Основные результаты исследования
Анализ данных гистологического исследования биоптатов эндометрия
Исследуемый материал у всех пациенток гистологически соответствовал календарной фазе менструального цикла.
Анализ данных ИГХ-исследования биоптатов эндометрия
При проведении ИГХ-реакции для ПР и ЭР в 100% исследуемых материалов выявлена положительная ядерная экспрессия, однако имелись различия в количестве положительно окрашенных клеток и интенсивности окрашивания (табл. 3).
Таблица 3. Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам в эндометрии на дооперационном этапе
| Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам в эндометрии на дооперационном этапе | Медиана | Минимальное значение—максимальное значение (min—max) | Нижний квартиль; верхний квартиль |
| ЭР в клетках стромы, 1-я группа | 7 | 6—7 | 7; 7 |
| ЭР в клетках желез, 1-я группа | 8 | 7—8 | 7; 8 |
| ПР в клетках стромы, 1-я группа | 8 | 8—8 | 8; 8 |
| ПР в клетках желез, 1-я группа | 8 | 7—8 | 8; 8 |
| ЭР в клетках стромы, 2-я группа | 7 | 4—8 | 4,5; 8 |
| ЭР в клетках желез, 2-я группа | 7 | 4—8 | 7; 8 |
| ПР в клетках стромы, во 2-я группа | 8 | 7—8 | 8; 8 |
| ПР в клетках желез, 2-я группа | 8 | 4—8 | 7,75; 8 |
Примечание. ПР — прогестероновые рецепторы; ЭР — эстрогеновые рецепторы.
При сравнении экспрессии рецепторов к стероидным гормонам у исследуемых обеих групп на до-операционном этапе, через 3 и 6 мес после операции статистически значимых различий не было (табл. 4).
Таблица 4. Статистическая значимость различий уровней экспрессии рецепторов к стероидным гормонам у пациенток исследуемых групп
| Критерий Манна—Уитни | До операции | Через 3 мес после операции | Через 6 мес после операции |
| ЭР в клетках стромы | p=0,79 | p=0,56 | p=0,79 |
| ЭР в клетках желез | p=0,41 | p=0,84 | p=0,98 |
| ПР в клетках стромы | p=0,82 | p=0,80 | p=0,77 |
| ПР в клетках желез | p=0,59 | p=0,23 | p=0,50 |
Примечание. ЭР — эстрогеновые рецепторы; ПР — прогестероновые рецепторы.
При сравнении уровней экспрессии рецепторов к стероидным гормонам у женщин обеих групп с референсными значениями по критерию Краскела—Уоллиса обнаружены статистически значимые различия в уровнях экспрессии ЭР в железах (p=0,0024), ПР в строме (p=0,0000) и ПР в железах (p=0,0003); статистически незначимой оказалась разница в уровнях экспрессии ЭР в строме (p=0,1168). Таким образом, при эндометриозе яичников в средней стадии фазы пролиферации наблюдается повышение уровней экспрессии ЭР в железах и ПР в строме и железах эндометрия. Выявленные изменения оставались статистически значимыми через 3 и 6 мес после операции (табл. 5). Однако при динамическом наблюдении заметна тенденция к снижению экспрессии ЭР в строме пациенток обеих исследуемых групп.
Таблица 5. Статистическая значимость различий уровней экспрессии рецепторов к стероидным гормонам между изучаемой выборкой и группой здоровых женщин
| Критерий Краскела—Уоллиса | До операции | Через 3 мес после операции | Через 6 мес после операции |
| ЭР в клетках стромы | p=0,1168 | p=0,7217 | p=0,4420 |
| ЭР в клетках желез | p=0,0024 | p=0,0295 | p=0,0064 |
| ПР в клетках стромы | p=0,0000 | p=0,008 | p=0,008 |
| ПР в клетках желез | p=0,0003 | p=0,002 | p=0,003 |
Примечание. ЭР — эстрогеновые рецепторы; ПР — прогестероновые рецепторы.
Анализ данных морфометрического исследования биоптатов эндометрия
Морфометрически определялось процентное количество клеток, содержащих на своей апикальной поверхности пиноподии в материале, взятом в средней стадии фазы секреции. Среди исследуемых материалов лишь в единичных случаях пиноподии определены как обильные, в большинстве исследований они классифицированы как умеренные и немногочисленные. При сравнении содержания пиноподий у женщин 1-й и 2-й групп в каждом из временных промежутков статистически значимых различий не было (табл. 6).
Таблица 6. Пиноподии на поверхностном эпителии эндометрия в среднюю стадию фазы секреции
| Пиноподии | До операции | Через 3 мес после операции | Через 6 мес после операции | |||
| 1-я группа | 2-я группа | 1-я группа | 2-я группа | 1-я группа | 2-я группа | |
| Обильные | 0 | 2 | 1 | 1 | 3 | 2 |
| Умеренные | 2 | 6 | 3 | 8 | 5 | 15 |
| Немногочисленные | 7 | 9 | 5 | 8 | 1 | 1 |
| р, χ2 Пирсона | p=0,3724 | p=0,75724 | p=0,141671 | |||
У пациенток исследуемых групп определялась статистически значимая тенденция к увеличению количества пиноподий на апикальной поверхности эндометрия с течением времени после проведенной цистэктомии по поводу эндометриоза яичников. По критерию Краскела—Уоллиса уровень значимости таких изменений для женщин 1-й группы — p=0,0314 и для женщин 2-й группы — p=0,0126. Выявленные изменения могут свидетельствовать о негативном влиянии эндометриоза яичников на созревание пиноподий в эндометрии, а также о постепенном восстановлении способности эндометрия к формированию пиноподий в послеоперационном периоде.
Обсуждение
Нами выявлено, что при эндометриозе яичников в средней стадии фазы пролиферации наблюдается повышение уровней экспрессии ЭР1 в железах и ПР в строме и железах эндометрия. Полученные нами данные коррелируют с результатами аналогичных исследований, проведенных в период «окна имплантации» [12], в которых отмечены повышение экспрессии ЭР1 в железах и тенденция к увеличению экспрессии ПР-А в железах и строме эндометрия по сравнению с референсными значениями, а уровень экспрессии ЭР1 в клетках стромы был низким и не отличался значительно от такового контрольной группы.
Выявленные в настоящем исследовании изменения рецептивности эндометрия оставались статистически значимыми через 3 и 6 мес после операции, в связи с чем имеет смысл продолжить динамическое исследование рецептивности эндометрия для определения сроков восстановления его рецепторного аппарата после оперативного лечения эндометриоза яичников.
Нами выявлена статистически значимая тенденция к увеличению количества пиноподий на апикальной поверхности эндометрия с течением времени после проведенной цистэктомии по поводу эндометриоза яичников, что может свидетельствовать о негативном влиянии эндометриоза яичников на формирование пиноподий в эндометрии и о постепенном восстановлении способности эндометрия к формированию пиноподий в послеоперационном периоде, что подтверждает эффективность оперативного лечения эндометриоза яичников. Между клинически выделенными группами не найдены статистически значимые различия в морфологическом строении и рецепторном аппарате эндометрия.
Заключение
При анализе морфофункционального состояния эндометрия и его рецептивности у пациенток с эндометриозом яичников отмечено нарушение рецепторного аппарата в виде повышения уровней экспрессии эстрогеновых рецепторов 1-го типа в железах и прогестероновых рецепторов в строме и железах эндометрия в средней стадии фазы пролиферации. Изменения сохранялись через 3 и 6 мес. после оперативного лечения эндометриоидных кист яичников. Нами выявлено негативное влияние эндометриоза яичников на формирование пиноподий в эндометрии и постепенное восстановление способности эндометрия к формированию пиноподий в послеоперационном периоде, что подтверждает эффективность оперативного лечения эндометриоза яичников.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — С.М.
Сбор и обработка материала — Л.Б.Ч., А.С., Н.Г., Т.Х., Л.В.Ч.
Статистический анализ данных — Т.Х.
Написание текста — Т.Х.
Редактирование — Л.М., А.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.