Хронический эндометрит (ХЭ) является одной из значимых причин бесплодия, а также неэффективности попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и невынашивания беременности [1]. Большая частота абортов, инвазивных диагностических либо лечебных внутриматочных манипуляций в гинекологии, а также увеличение заболеваемости бессимптомными инфекциями, передаваемыми половым путем, привели к увеличению частоты ХЭ в последнее десятилетие [2—4].

Среди пациенток с ХЭ 97,6% составляют женщины репродуктивного периода, что подчеркивает особую значимость данной патологии с точки зрения влияния на репродуктивную функцию [5, 6]. По данным Г.Т. Сухих и соавт. [5, 7], у женщин с ХЭ почти в 50% случаев диагностируют бесплодие (преимущественно вторичное), у 37% в анамнезе имеются неудачные попытки ЭКО и переноса эмбриона (3,3±0,4 попытки на пациентку). У больных с неудачными попытками ЭКО и переноса эмбрионов частота ХЭ возрастает до 60% (в 22,1% — первичное бесплодие, в 36,5% — вторичное бесплодие), неудачные попытки ЭКО и переноса эмбрионов в анамнезе отмечены у 40% женщин.

В патогенезе ХЭ основная роль отводится хронической активации клеточных и гуморальных провоспалительных реакций в результате первичного патогенного микробного воздействия, сопровождающихся повышенной выработкой цитокинов и других биологически активных веществ, обусловливающих нарушение микроциркуляции, экссудацию и отложения фибрина в строме эндометрия [3, 8]. Длительная и часто бессимптомная персистенция инфекционных агентов приводит к выраженным изменениям в тканевой структуре эндометрия, препятствуя нормальной имплантации и плацентации, формируя патологический ответ на беременность, а также вызывая нарушение физиологической пролиферации и циклической трансформации эндометрия [9]. При этом иммунные реакции, протекающие в эндометрии, принимают участие как в реализации защитной функции при проникновении в полость матки инфекционных агентов, так и в полноценной имплантации и развитии эмбриона [10]. Предполагается, что изменения цитокинового профиля являются одним из важнейших факторов развития и прогрессии эндометрита [3, 6]. Некоторые авторы [11, 12] рассматривают ХЭ как аутоиммунный процесс, индуцированный инфекцией, но в дальнейшем протекающий как самоподдерживающая патологическая реакция.

Тем не менее особенности патогенеза ХЭ остаются неуточненными. До сих пор не решен вопрос прогноза эффективности лечения бесплодия, ассоциированного с ХЭ, методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В этой связи представляет интерес малоинвазивное исследование белкового состава внутриматочной жидкости для поиска дополнительных методов оценки имплантационной восприимчивости эндометрия и прогноза исхода ЭКО при ХЭ.

Цель настоящей работы — оценка значимости содержания иммунорегуляторных белков и некоторых цитокинов во внутриматочных смывах в прогнозе эффективности программ ЭКО при ХЭ.

В исследование были включены три группы женщин: основная группа — 38 бесплодных пациенток с трубным фактором бесплодия, ассоциированным с ХЭ (средний возраст 29±1,5 года, длительность бесплодия 5±1,8 года). Все женщины приняли участие в программах ЭКО. В зависимости от исхода программы, ретроспективно были сформированы две подгруппы — 17 женщин с положительным результатом ЭКО и 21 — с отрицательным результатом ЭКО.

В группу сравнения вошли 26 женщин с трубным бесплодием без ХЭ (возраст 26±1,8 года). Все женщины приняли участие в программах ЭКО, у 13 женщин наступила беременность и у 13 применение ВРТ было нерезультативным.

Группу контроля составили 10 практически здоровых фертильных женщин (возраст 27±1,7 года).

Обследование и лечение бесплодия методом ЭКО проводились на базе клиники «Медика» ГК «Мать и дитя» (Новокузнецк). Всем пациенткам проводилось комплексное обследование в соответствии с приказом № 107н от 30.08.12 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Верификация диагноза ХЭ проводилась на основании общеклинических, микробиологических, лабораторных исследований, трансвагинальной эхографии, а также посредством гистероскопии в первую фазу менструального цикла (7—10-й день) с морфологическим исследованием аспиратов эндометрия. От всех женщин получено информированное согласие на участие в исследовании.

Получение образцов внутриматочных смывов осуществлялось перед назначением стимуляции суперовуляции на 19—21-й день менструального цикла, предшествующего лечебному циклу ЭКО. В полость матки через пластмассовый катетер, диаметром 2 мм вводилось 3 мл физиологического раствора, после 1 мин экспозиции содержимое аспирировалось. Полученный материал замораживали и хранили при –20 °С.

Индукция суперовуляции проводилась по стандартному короткому протоколу с применением антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) [13]. Оплодотворение ооцитов осуществлялось методом ЭКО, селективный перенос 1 эмбриона — на 5-е сутки культивирования.

Содержание α₂-макроглобулина (α₂-МГ), иммуноглобулина G (IgG) и лактоферрина (ЛФ) в составе внутриматочных смывов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), концентрацию альбумина оценивали количественным ракетным иммуноэлектрофорезом с применением исследовательских тест-систем, разработанных на базе НИЛ иммунологии НГИУВ – филиала ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России. При определении концентрации цитокинов в смывах использовались коммерческие тест-системы для метода ИФА (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия).

Статистический анализ полученных результатов проводился при помощи сертифицированной коммерческой программы InStat II («GraphPad», США). Использовалась проверка правильности распределения по Колмогорову—Смирнову для выбора параметрических либо непараметрических тестов при парном межгрупповом сравнении показателей. В работе приведены следующие данные: M±m, n (количество больных в группе), р (достоверность различий).

Как показали наши исследования, при трубном факторе бесплодия, ассоциированном с ХЭ, наблюдается выраженное изменение белкового профиля внутриматочных смывов (табл. 1). При сравнении со здоровыми женщинами (сохраненная репродуктивная функция) в основной группе (ХЭ) отмечено статистически достоверное повышение концентрации α₂-МГ (в 5,5 раза) и альбумина (в 3 раза), при значимом снижении уровня ЛФ (в 2 раза).

Необходимо отметить, что в группе сравнения (трубное бесплодие без ХЭ) подобные патологические изменения показателей были выражены в значительно меньшей степени — при сходном понижении содержания ЛФ (в 2,5 раза) уровень α₂-МГ был повышен только в 2,5 раза, а уровень альбумина практически не отличался от контроля. Содержание IgG в группах наблюдения статистически достоверно не отличалось от уровня IgG в группе контроля.

Анализ концентрации цитокинов во внутриматочных смывах при ХЭ (табл. 2) продемонстрировал, что данная патология ассоциирована с достоверным увеличением локальной секреции эндотелиального фактора роста, в то время как при бесплодии трубного генеза без ХЭ содержание этого показателя не отличалось от нормы.

Ретроспективное разделение женщин с бесплодием по результату применения программ ЭКО на две подгруппы (см. табл. 1) позволило выявить различия, имеющие определенные перспективы в прогнозе исхода применения ВРТ. В частности, у женщин с ХЭ и отрицательным результатом программы ЭКО содержание α₂-МГ во внутриматочных смывах было максимально высоким — в 8 раз выше, чем в контрольной группе фертильных женщин, в 3 раза выше, чем при ХЭ с позитивным исходом ЭКО, и в 2,5—2,7 раза выше, чем у женщин с бесплодием трубного генеза группы сравнения. Уровень Л.Ф. при ХЭ был снижен, а альбумина — повышен вне статистической зависимости от исхода ЭКО, однако при отрицательном результате ЭКО выраженность изменений и соответственно достоверность отличий от контроля были больше. В группе сравнения подобных тенденций в зависимости от исхода ВРТ не наблюдалось.

Концентрация общей фракции IgG в составе внутриматочных смывов при бесплодии была подвержена значительным индивидуальным колебаниям, однако максимально высокие показатели (22—33 мг/л) определялись в 33% случаев у пациенток при ХЭ и отрицательном исходе программы (в других подгруппах концентрация IgG более 22 мг/л выявлялась только в 8—15% случаев).

Только при неблагоприятном исходе программ ЭКО (см. табл. 2) было выявлено повышение содержания фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) во внутриматочных смывах как при трубном бесплодии, ассоциированном с ХЭ, так и без него. В группе сравнения установлено подавление синтеза интерлейкина (ИЛ)-8 при негативном исходе, при трубном бесплодии, ассоциированном с ХЭ, данная тенденция была статистически недостоверной.

В целях улучшения прогноза исхода программ ЭКО была оценена чувствительность и специфичность определения уровня регуляторно-транспортных белков во внутриматочных смывах при Х.Э. Согласно подсчетам, чувствительность и специфичность в негативном прогнозе исхода ЭКО для α₂-МГ (более 3,2 г/л) при бесплодии с ХЭ составила 71 и 76% соответственно, в группе сравнения 46 и 61% соответственно; для альбумина (более 0,24 г/л) при бесплодии с ХЭ — 57 и 47%, в группе сравнения 31 и 85% соответственно, остальные показатели были менее значимы.

Для повышения чувствительности и специфичности был рассчитан коэффициент содержания этих белков во внутриматочных смывах: К= концентрация α₂-МГ (мг/л) · концентрация альбумина (г/л) ·100. При значении К=90 и более прогнозируется низкая эффективность применения программ ЭКО. Чувствительность теста составила 71%, специфичность — 71% при ХЭ, а в группе сравнения — 31 и 77% соответственно, что недостаточно для отдельного применения в клинической практике, однако представляет интерес в качестве компонента расширенного алгоритма расчета эффективности программ ЭКО при ХЭ, учитывающего клинико-лабораторные показатели, для повышения эффективности лечения ХЭ при помощи ВРТ.

Результативность программ ЭКО во многом зависит от рецептивности эндометрия к имплантации эмбриона. При этом важную роль в полноценности трансформации эндометрия «окно имплантации» играет его морфофункциональное состояние (отсутствие воспалительных инфильтратов и склеротических изменений, толщина, рецепторный аппарат и адекватная васкуляризация [7, 14]), а также качественный состав внутриматочной жидкости, содержащей локально синтезируемые белки и факторы сывороточного происхождения, включая иммунорегуляторные и транспортные белки (в том числе реактанты воспаления), иммуноглобулины, цитокины и факторы роста, различные растворимые рецепторы [14, 15].

В настоящее время большая роль в воспалительном процессе, происходящем внутри клеток эндометрия, отводится цитокинам и факторам роста [4, 6, 16]. Считается, что при ХЭ продуцируемые макрофагами цитокины стимулируют клеточную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, эндотелиоцитов, тромбоцитов, а также секрецию ферментов, разрушающих структуру экстрацеллюлярного матрикса [2, 3]. Выявленное нами повышение уровня наиболее чувствительно реагирующего при воспалении ФНО-α во внутриматочных смывах у женщин с трубным фактором бесплодия как с ХЭ, так и без него при отрицательном результате ЭКО подтверждает наличие бессимптомного воспаления, препятствующего имплантации эмбриона в указанных группах, и совпадает с данными других авторов [3, 17] по гиперэкспрессии этого цитокина при Х.Э. Важным представляется выявленное увеличение концентрации эндотелиального фактора роста VEGF во внутриматочных смывах только при бесплодии, ассоциированном с Х.Э. Известно, что VEGF активно экспрессируется при ХЭ [3, 15] и стимулирует выработку ИЛ-6 [18], однако нами выявлена лишь недостоверная тенденция к повышению уровня ИЛ-6 в данной группе (р=0,08). В любом случае высокая концентрация факторов роста во внутриматочных смывах является неблагоприятным фактором, дискоординирующим цикличную пролиферацию ткани эндометрия.

Обращает на себя внимание выявленное нами достоверное снижение содержания ИЛ-8 у женщин группы сравнения и некоторая тенденция к уменьшению данного показателя у женщин с ХЭ при нерезультативном исходе ЭКО. Возможно, повышение уровня ИЛ-8 во внутриматочном содержимом — необходимое условие для благоприятной имплантации, взаимосвязанное с другими показателями. Согласно данным некоторых авторов [19, 20], иммуногистохимический анализ лимфоидных клеток пациенток с ХЭ показывает снижение количества CD4-клеток и увеличение CD8-лимфоцитов, а также гиперстимуляцию IgG и в меньшей степени IgM, повышение количества макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов, которые привлекаются в очаги воспаления, высвобождая ряд цитокинов воспаления. Эти данные подтверждают необходимость комплексного изучения не только цитокинового профиля, но и тесно взаимосвязанных с ним регуляторных факторов гуморального иммунитета. Последние представляются более эффективными в плане диагностики и прогноза, поскольку цитокиновый профиль нестабилен и подвержен цикличным колебаниям. В частности, уровень провоспалительных цитокинов увеличивается в менструальных выделениях у женщин с ХЭ [21].

Впервые продемонстрированные нами повышенные концентрации α₂-МГ и альбумина в содержимом внутриматочных смывов у женщин с трубным фактором бесплодия, особенно при неэффективном применении ВРТ-технологий на фоне ХЭ подтверждают наличие бессимптомного воспаления в эндометрии. При этом процесс достаточно выражен, чтобы привести к неселективной экссудации из кровотока не только низкомолекулярного альбумина (56 кД), но и высокомолекулярного тетрамера α₂-МГ (720 кД). Учитывая, что данные белки синтезируются преимущественно гепатоцитами печени, их появление во внутриматочных смывах связано исключительно с увеличением проницаемости тканей [22] на фоне повышения протеиназной активности, описанной в работе С.В. Литвиновой и соавт. [17]. Поскольку α₂-МГ в отличие от альбумина является не только транспортным, но и иммуномодуляторным белком, способным активно влиять на секрецию цитокинов и транспортирующим их к клеткам-мишеням [23], избыток α₂-МГ во внутриматочном содержимом может вызвать дисбаланс цитокинового профиля, оказав дополнительное негативное воздействие на состояние эндометрия. Более того, α₂-МГ является уникальным ингибитором протеиназ с частичным сохранением их литической активности [24], и накопление подобных комплексов с протеиназами на тканях может потенцировать локальное воспаление.

Уровень IgG в составе внутриматочных смывов у женщин с ХЭ и неэффективным результатом ЭКО имел некоторую тенденцию к повышению (р=0,09), самые высокие показатели его концентрации тоже были выявлены в данной подгруппе. Это подтверждает результаты других авторов [19, 20] и также свидетельствует о наличии подострого воспаления, препятствующего имплантации.

Напротив, содержание ЛФ, синтезируемого эпителиальными клетками, было достоверно снижено при бесплодии по сравнению с фертильными женщинами. Причиной данного феномена может быть описанный выше недостаток секреции ИЛ-8, взаимозависимо стимулирующего синтез ЛФ [25]. Нельзя исключать и врожденный дефицит синтеза ЛФ у женщин, предрасположенных к бесплодию. По крайней мере, известно, что данный белок обладает выраженными антибактериальными и противовирусными свойствами, способными защитить эндометрий от патогенной инвазии, а также модулирует синтез цитокинов, активно участвует в процессах оплодотворения и развития плода [26].

1. При трубном факторе бесплодия, ассоциированном с ХЭ, наблюдаются изменения белкового состава внутриматочного содержимого, свидетельствующие о наличии воспаления и экссудации (повышено содержание α₂-МГ и альбумина), а также сниженном защитном потенциале секреторного иммунитета (снижено содержание ЛФ). При трубном факторе бесплодия без ХЭ наблюдается менее выраженное повышение концентрации α₂-МГ на фоне аналогичного дефицита ЛФ во внутриматочных смывах.

2. Выраженность изменений изученных показателей взаимосвязана с исходом программы ЭКО. Самые неблагоприятные изменения концентрации α₂-МГ, альбумина, ФНО-α и IgG выявлены во внутриматочных смывах при негативном результате ЭКО при ХЭ.

3. Содержание во внутриматочных смывах α₂-МГ более 3,2 мг/л и альбумина более 0,24 г/л в лютеиновую фазу цикла, предшествующего лечебному, является прогностическим маркером неэффективности процедуры ЭКО при трубном бесплодии, ассоциированном с ХЭ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.В., Р.М.

Сбор и обработка материала — Я.Н., В.В., Т.В., А.Г., В.Н.

Статистическая обработка данных — Р.М., В.Н.

Написание текста — Я.Н., В.В., В.Н.

Редактирование — Р.М., Л.В., Л.Г.