Сравнительный анализ молекулярного состава эктопического и эутопического эндометрия методами масс-спектрометрии и иммуногистохимии у пациентов с наружным генитальным эндометриозом

Эндометриоз считают одним из самых распространенных и загадочных гинекологических заболеваний женщин репродуктивного возраста. Несмотря на то что данное заболевание диагностируется достаточно часто (согласно статистическим данным, эндометриозом в той или иной степени страдают до 30% женщин репродуктивного возраста), по сей день так и не найдены ответы на вопросы — каков патогенетический механизм развития заболевания, каким способом его лечить, как можно выявлять процесс на ранней стадии, а также существуют ли меры профилактики рецидива наружного генитального эндометриоза (НГЭ) [1, 2].

Согласно данным ряда исследований [3], в ответ на различные патофизиологические стимулы, внешние или генетические сигналы в организме человека закономерно изменяются показатели клеточного метаболизма, в частности, липидный спектр тканей. Однако в сфере выяснения патогенеза эндометриоза данная особенность изучается в весьма ограниченном количестве работ. Действительно, липиды играют неотъемлемую роль в развитии фундаментальных реакций, лежащих в основе практически любого патологического процесса, таких как воспаление, оксидативный стресс, пролиферация, ангиогенез и т. д. [4]. В связи с тем, что все вышеперечисленные звенья вовлечены в патогенез эндометриоза, на наш взгляд, целесообразно более подробно изучить роль липидов в инициации, развитии и прогрессии данного заболевания.

В результате ранее проведенного метаболомного масс-спектрометрического анализа эктопического и эутопического эндометрия нами было выявлено значительное увеличение уровня сфингомиелина (SM), фосфатидилхолина (PC), фосфоэтаноламина (PE), ди- и триглицеридов (DG, TG) в эндометриоидных тканях [5].

SM находятся в мембранах клеток различных тканей, но наибольшее их количество содержится в нервной ткани [6]. Так, ряд ученых [7] предполагают, что в эктопическом эндометрии продолжающиеся процессы денервации с последующей реиннервацией вызваны повышением уровня сфингомиелинов и являются одной из причин развития болевого синдрома при эндометриозе. Также было показано, что синдром хронической тазовой боли (ХТБ) при эндометриозе коррелирует с увеличением содержания нейрофиламентов (NF) в эндометриоидных тканях [8]. NF представляют собой компонент цитоскелета нейрона, обеспечивают внутриклеточный транспорт веществ и являются маркером зрелых и жизнеспособных клеток [8].

DG являются предшественниками многих липидов и жирных кислот, в том числе PC, PE, триацилглицеридов [20].

РС и РЕ являются маркерами повышенной пролиферации клеток, обеспечивают их устойчивость к апоптозу, активизируют ангиогенез, индуцируют морфологические изменения клеток, а также их миграцию [9]. Но существует ли взаимосвязь между количеством этих фосфолипидов и агрессивностью эндометриоидного процесса, до сих пор не изучено. Специфичным и оптимальным для широкого использования в патологоанатомической практике маркером пролиферации является антиген Ki-67. При уровне Ki-67 менее 15% опухоль считается менее агрессивной, при показателе более 30% опухоль считается высокоагрессивной [10].

В научной литературе отсутствует сопоставление нейрональных и пролиферативных маркеров с экспрессией липидов в эндометриоидных тканях, характеризующихся подобными свойствами. Таким образом, иммуногистохимическое (ИГХ) определение содержания нервных окончаний и степени пролиферации эндометриоидных тканей в сравнении с результатами масс-спектрометрии представляет огромный интерес с целью верификации данных биомаркеров. Гистологический анализ требует больше усилий и времени, чем метаболомный анализ [11], так как требует предварительной подготовки образца. Разработка быстрого метода дифференциальной диагностики эндометриоидных тканей во время операции позволила бы избежать удаления здоровых тканей, а также дать возможность для создания экспресс-диагностики НГЭ. Использование методов экспресс-скрининга тканей с применением масс-спектрометрических детекторов позволит оценить пролиферативный потенциал тканей эндометрия, а также, возможно, объяснить патофизиологические аспекты тазовой боли при эндометриозе.

Цель работы — создание методики неинвазивной экспресс-диагностики НГЭ, основанной на анализе молекулярного состава эндометриоидных тканей методами масс-спектрометрии и иммуногистохимии (ИГХ).

Исследование проводилось на операционном материале (капсулы эндометриоидных кист яичников и очаги перитонеального эндометриоза), полученном от 20 пациенток с установленным во время лапароскопической операции и подтвержденным патоморфологическим диагнозом НГЭ, находившихся на лечении на базе ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России в 2015 г. Возраст больных составил от 19 лет до 41 года (в среднем 30 лет). При этом 50% пациенток находились в пролиферативной и 50% — в секреторных фазах менструального цикла. Степень распространенности НГЭ оценивалась, согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности (R-AFS), в соответствии с которой 6 пациенток имели II стадию, 9 пациенток — III стадию и 5 пациенток — IV стадию.

Критериями включения в исследование являлись: возраст женщин от 15 до 44 лет, отсутствие гормонального лечения не менее 6 мес до операции, отсутствие воспалительных заболеваний органов малого таза и тяжелой соматической патологии.

У всех пациенток (100%) отмечался выраженный синдром ХТБ (100%), при этом на дисменорею жаловались 13 (65%) женщин, на диспареунию — 2 (10%).

В настощей работе анализу подвергались перитонеальные очаги эндометриоза, капсулы эндометриоидных кист с прилежащими интактными тканями и соскоб эндометрия. Образцы тканей делились на две части: основная часть тканей отправлялась для морфологического исследования, из которых вырезался лишь небольшой участок ткани размером 0,5×0,5 см для масс-спектрометрического анализа.

Для проведения ИГХ-исследования после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч и стандартного протокола проводки материал заливали в парафин. Далее проводили окрашивание гематоксилином и эозином. Для ИГХ-исследования готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и сушили при температуре 37 °C в течение 18 ч. После депарафинизации срезов их регидратировали в батарее спиртов 95°, 80° 70°, инкубируя в каждом растворе по 2 мин. В исследовании использовались мышиные моноклональные антитела к NF (клон 2F11, 1:100, «Dako», Дания) и к маркеру пролиферации Ki-67 (клон MIB-1, RTU, «Dako», Дания). Для визуализации мест связывания антител с антигенами использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованием водонерастворимого конечного продукта коричневого цвета системы EnVision («Dako Cytomation»). Для правильной постановки ИГХ-реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре ИГХ-реакции, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы-производителя. Оценка результатов ИГХ-реакций осуществлялась следующим образом: NF оценивались в баллах исходя из критериев: 2 балла — до 20% окрашенных клеток, 4 балла — от 20 до 40%, 6 баллов — более 40%; Ki-67 высчитывался в процентах, также согласно количеству окрашенных клеток (максимально 100%).

Масс-спектрометрический анализ тканей проводили методом электрораспылительной ионизации [5]. Данный метод позволяет получать высокоинформативные масс-спектры молекул (в основном липидов) ткани при минимальной пробоподготовке.

Результаты масс-спектрометрического анализа тканей обрабатывали методами многофакторного анализа частных наименьших квадратов (PLS). В результате была создана статистическая модель, позволяющая дифференцировать эутопический и эктопический эндометрий. На основании созданной модели был выделен список переменных с наиболее значимыми проекциями (variable influence on projection — VIP), соответствующих липидам. Для выявленных таким образом липидов проводился корреляционный анализ их уровня с экспрессией Ki-67 и NF. Выраженность связи оценивалась по величине коэффициента корреляции (линейные корреляции Пирсона).

1. ИГХ-анализ

Макроскопически эндометриоидные кисты яичников имели вид полостей, заполненных свежей кровью, размером от 1×3 до 2×4 см. Перитонеальные эндометриоидные очаги были представлены в виде бляшек, заполненных темной кровью или жидкостью дегтеобразного, а иногда белого, желтого или розового цвета, размером от 0,5×0,5 до 1×1 см.

Микроскопическиэндометриоидные гетеротопии характеризовались скоплением железистых эндометриоидно-подобных образований, окруженных богатой клеточными элементами цитогенной стромой. Соотношение между стромальными и эпителиальными элементами в эндометриоидных гетеротопиях было неодинаковым в различных образцах.

При микроскопическом исследовании эндометриоидных кист яичников определялись склероз, гемосидероз их стенок и свежие кровоизлияния (см. рисунок, 1а).

Среди перитонеальных очагов эндометриоза преобладали активные очаги (в 75% случаев), представленные активным стромальным компонентом, гемосидерозом, пролиферацией эпителия (см. рисунок, 2а), а в 2 случаях — гиперплазированным эпителием, имеющими периваскулярный, интраваскулярный и периневральный характер роста.

В соскобах эндометрия имелись признаки пролиферативной фазы или ранней стадии фазы секреции (см. рисунок, 3а).

В результате проведенного ИГХ-исследования обнаружены характерные изменения в очагах эктопического эндометрия.

Экспрессия белков NF выявлена только в очагах эктопического эндометрия (см. рисунок, 1б, 2б, 3б). В эутопическом эндометрии содержание маркера приравнивалось к нулю. При этом наибольшее содержание NF отмечалось в перитонеальных очагах (в 10 случаях оценивалось как 4 балла и только в 2 случаях как 2 балла). В капсулах эндометриоидных кист в 9 случаях содержание маркера приравнивалось к 2 баллам и в 3 случаях — к 4 баллам.

О повышенной пролиферативной активности железистого и стромального компонентов свидетельствовали высокие показатели Ki-67 эктопического эндометрия по сравнению с эутопическим эндометрием (p<0,05) (см. рисунок, 1 В, 2 В, 3в). Индекс пролиферации железистого компонента эндометриоидных гетеротопий, согласно экспрессии Ki-67, в 2 случаях составил 20—25%, в остальных случаях не превышал 7%. В стромальном компоненте данный индекс не превышал 15% и в большинстве случаев составил 3—10%. При этом пролиферативная активность, судя по экспрессии Ki-67, в железистом компоненте очагов достоверно выше по сравнению со стромальным (p<0,05).

2. Масс-спектрометрический анализ

В таблице показаны липиды, уровень которых повышен в эндометриоидных тканях по сравнению с эутопическим эндометрием. Уровень Ki-67 коррелировал в железах перитонеальных очагов с уровнем DG 44:9, PC 40:9, PE O-20:0, в строме перитонеальных очагов с уровнем PCO-36:3, PC 32:1, PC 38:6, PC 38:7, PC 40:6, PC 40:8, TG 49:4, SM 34:1. Уровень NF в перитонеальных очагах коррелировал только с уровнем PEO-20:0 и DG 44:9. В железах капсул эндометриоидных кист яичников оказались значимыми соотношение уровня Ki-67 с уровнем PEO-20:0 и TG 41:2, а в строме эндометриомы только с уровнем PC 38:6. Уровень NF и количество PCO-36:3, PC 38:6, TG 49:4, PC 40:6, PC 40:9, PC 40:7, PC 40:8, PC 38:7, SM 34:1 показали хорошую взаимосвязь. В железах эутопического эндометрия уровень Ki-67 соотносился с уровнем TG 52:3, PCO-42:1, DG 44:9, PC 38:7, PE O-20:0, PCO-36:3, в строме эутопического эндометрия — с уровнем PC 40:8, PC 40:7, TG 52:3, PCO-42:1, PC 40:9.

В данной работе изучена корреляция содержания липидов с пролиферативной активностью клеток и уровнем NF. Наибольшие коэффициенты корреляции выявлены между экспрессией Ki-67 в строме эндометриоидных очагов на брюшине и уровнем липидов PC 40:8, PC 32:1, PC 40:6, PC 38:7, PC 38:6, PCO-36:3, TG 49:4, а в эндометриоидных кистах яичников обнаружена значительная отрицательная корреляция между уровнями нейрофиламентов и PC 40:8, PC 40:7, PC 40:9, PC 40:6, PC 38:7, PC 38:6, PCO-36:3, TG 49:4. Для SM 34:1 наблюдается наибольшая отрицательная корреляция с уровнем Ki-67 в строме эндометриоидной ткани на брюшине и с уровнем NF в кистах яичников.

При этом наиболее значимыми оказались липиды PC 38:6, PC 40:6, TG 44:9, PEO-20:0, SM 34:1, так как корреляция их уровня с уровнем NF и Ki-67 оказалась значимой в эктопическом эндометрии в отличие от эутопического.

SM, PC, PE и DG являются как компонентами нервной ткани, так и липидами, способствующими повышенной пролиферации клеток.

В настоящее время накоплено множество сведений о том, что сфинголипиды являются важными биологическими сигнальными молекулами и участвуют в разнообразных клеточных процессах. Например, церамид модулирует события, связанные с сигнализацией апоптоза, в то время как при фосфорилировании или гликозилировании его происходит образование митогенных факторов, таких как Cer-1-фосфат (C1P) и глюкозилцерамид (GlcCer) [7]. Повышенный уровень GlcCer зарегистрирован при многих хронических заболеваниях, таких как болезнь Гоше, рак, сахарный диабет 2-го типа, поликистоз почек. Исследования в области почечных эпителиальных клеток, кератиноцитов и ряда раковых клеток дополнительно демонстрируют митогенные свойства GlcCer. GlcCer-синтаза (GCS) — фермент, который катализирует гликозилирование церамида и является первым шагом для биосинтеза высших гликосфинголипидов, также участвующих в клеточной пролиферации [6, 7]. Учитывая повышенные клеточные пролиферативные состояния, связанные с эндометриозом, мы предположили, что нарушения регуляции в метаболическом пути сфинголипидов могут быть связаны с внутренней усиленной пролиферацией клеток эндометрия, что приводит к росту эндометриоидных гетеротопий и имплантации в эктопических участках.

SM, образующие сложную оболочку нервных волокон, также играют важную роль в процессе проведения нервного импульса. Согласно мнению проф. P. Stratton [12], эндометриоидные поражения сопровождаются ХТБ за счет сдавления и прорастания через близлежащие нервы, в связи с наличием в очагах фактора роста нервов. Имеются научные работы [13], доказывающие корреляцию между плотностью нервных волокон и тяжестью болевого синдрома. Наличие невропатических проявлений у 25% пациенток с эндометриозом может быть обусловлено экспрессией нервных волокон и тесной корреляцией с воспалительным микроокружением в эндометриоидных очагах, в развитии которых принимают также участие SM [13]. Экспрессия NF, которая отмечена только в строме очагов эндометриоза, в отличие от эутологического эндометрия, также свидетельствует о новообразовании нервных волокон и развитии болевого синдрома у пациенток с НГЭ.

PC также является наиболее распространенным фосфолипидом в нейронах. Биосинтез PC происходит по пути Кеннеди, в котором фосфохолин и цитидин-5-дифосфохолин являются основными промежуточными продуктами [9].

PC является субстратом для синтеза фосфолипазы А2 (PA2) — фермента, экспрессия которого усиливается в эндометриоидных очагах [6]. Под действием РА2 из PC образуется лизофосфатидная кислота, которая вместе с сфингазин-1-фосфатом участвует в регуляции различных клеточных процессов, таких как пролиферация, выживание, миграция и дифференцировка [21]. Также имеются данные, что лизофосфолипиды изменяют кривизну, форму и толщину клеточных мембран и, таким образом, регулируют активность каналов и ферментов. Кроме этого, лизофосфатидная кислота имеет биологическую функцию усиления фактора роста нервов и содействует выживанию клеток [21].

Фосфатидилэтаноламин (PEO) является наиболее распространенным глицерофосфолипидом внутренней мембраны клеток, участвует в регуляции различных клеточных процессов, включая пролиферацию клеток, сигнализацию, аутофагию и апоптоз [14]. PEO синтезируется заново из этаноламина и DG через путь цитидинфосфоэтаноламин-Кеннеди и декарбоксилирования фосфатидилсерина в митохондриях [15]. Синтез de novo PEO регулируется ферментом Pcyt2. Важность PEО и Pcyt2 активности для роста опухолей также была хорошо изучена во многих исследованиях, в том числе при раке молочной железы [16, 17]. Клетки рака молочной железы имеют сниженную активность Pcyt2 и уровень PEO/плазмалогенов относительно незлокачественных клеток [16], а также показано снижение содержания фермента Pcyt2 при раке печени [18, 19]. Таким образом, связь этого липида с уровнем Ki-67 подтверждает его гиперпролиферативные свойства.

Учитывая участие DG в обмене веществ и сигнальных клеточных путях, поддержание надлежащего уровня DG имеет решающее значение для гомеостаза и развития клеток. Относительная чувствительность или устойчивость к ингибитору синтазы жирных кислот (FASN) приводит к усилению метаболизма DG и активации протеинкиназы С [22]. Усиление образования липидов de novo, особенно через повышающую регуляцию основных липогенных ферментов FASN, является одним из главных признаков раковых клеток, которые также коррелирует с плохим прогнозом у пациентов с раком [20]. FASN, как было показано многими исследованиями [22], способствует повышению пролиферации клеток и злокачественной прогрессии через генерацию предшественников жирных кислот, изменяет текучесть мембран, влияет на онкогенную способность трансдукции сигнала и экспрессию генов. Учитывая важность FASN в различных аспектах пролиферации раковых клеток и их прогрессии, фармакологическое ингибирование этого фермента становится все более привлекательной терапевтической стратегией для борьбы с раком.

Как явствует из полученных результатов, метод прямой масс-спектрометрии может быть использован для дифференциации между эктопическим эндометрием и здоровой тканью, что подтверждается ИГХ-исследованием.

Дальнейшая верификация вышеперечисленных липидов в качестве серологических биомаркеров может привести к созданию неинвазивной диагностики для пациенток с подозрением на НГЭ, оценить предикторы возникновения рецидива заболевания, повысить безопасность и эффективность хирургического вмешательства, а также, возможно, уменьшить потребность в проведении диагностической лапароскопии.

Источники финансирования

Исследования были выполнены при поддержке гранта № 16−14−00029 РНФ и частично (идентификация липидов) гранта Министерства образования Российской Федерации №МК-8484.2016.7.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.