Введение

COVID-19-ассоциированное поражение печени (COVID-19-Related Liver Injury — CRLI) в острый период COVID-19 развивается у 14—78% больных, чаще при тяжелом течении заболевания, в единичных случаях как особый вариант течения болезни, и во многом сходно с описанным при тяжелых, протекающих как вирусный сепсис формах гриппа A/H1N1 и коронавирусных инфекций — MERS-CoV и SARS-CoV-1, а также при сепсисе и шоке любой этиологии [1—18]. Изолированная, или в составе синдрома острой полиорганной недостаточности, печеночная недостаточность расценивается как прогностически неблагоприятный фактор, но редко достигает критических величин и влияет на танатогенез [1—18].

Патогенез CRLI обусловлен, как полагают, сочетанием многих факторов: вирусным повреждением, иммунными нарушениями, гипоксией/реперфузией, COVID-19-ассоциированнми ангио- и коагулопатиями, бактериальной/микотической суперинфекцией, сепсисом и шоком, обострениями коморбидных заболеваний, лекарственной гепатотоксичностью и др. [1—18].

Патоморфологические изменения печени при CRLI характерны, но не неспецифичны. Они включают признаки ишемического гепатита (центролобулярные некрозы и жировая дистрофия без выраженной воспалительной реакции в 37—100% наблюдений) в сочетании с COVID-19-ассоциированными микроангиопатией, гиперкоагуляцией (12—100%) и холестазом с альтерацией и пролиферацией интрапортальных желчных протоков (12—100%). В части наблюдений встречаются тромбоз крупных вен или артерий и инфаркты печени. Определяется слабо или умеренно выраженная мононуклеарная с примесью нейтрофильных лейкоцитов, плазмоцитов портальная (23—100%) и лобулярная инфильтрация (7—100%), которая в редких случаях бывает выраженной и тогда трактуется как острый гепатит неуточненной этиологии. В единичных работах отмечены присутствие в острый период COVID-19 в портальных трактах и перисинусоидальных пространствах CD3+, CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, CD68+ моноцитов/макрофагов, а также пролиферация купферовских клеток [1, 3, 6, 7, 8—18]. Однако исследования проводились без исключения влияния на печень бактериальной/микотической суперинфекции и гепатотоксической лекарственной терапии. Количественная и качественная характеристика субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов в разные фазы острого периода COVID-19 и отдаленные сроки после перенесенного заболевания не изучались.

После перенесенного COVID-19 клинико-лабораторные проявления CRLI обычно самопроизвольно регрессируют в течение 2—3 нед, но у 2—15% больных персистируют, что получило название «постковидный гепатобилиарный синдром» как вариант постковидного синдрома. Его морфологический субстрат недостаточно изучен, описан жировой гепатоз и фиброз печени, у отдельных больных — лекарственный и аутоиммунный гепатит. В 0,6—1% наблюдений прогрессирует или возникает впервые COVID-19-ассоциированная холангиопатия, аналогичная вторичному склерозирующему холангиту у пациентов в критическом состоянии (Secondary Sclerosing Cholangitis in Critically Ill Patients — SSC-CIP), которая может приводить к первичному билиарному циррозу печени или гнойному холангиту [1, 6, 8, 19].

Изучение количественной и качественной характеристики субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов ткани печени при COVID-19 особенно актуально, так как печень обладает способностью индуцировать иммунную толерантность из-за постоянного поступления различных антигенов по системе воротной вены. Она достигается благодаря клональной делеции, истощению или ингибированию субпопуляций T-лимфоцитов [20, 21]. В результате при вирусных заболеваниях печени страдает адаптивный иммунный ответ, что при COVID-19 может приводить к повреждению ткани печени, персистенции SARS-CoV-2 или более тяжелому течению заболевания [22].

Цель исследования — анализ количественной и качественной характеристики субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов ткани печени на материале аутопсий у умерших в разные фазы острого периода COVID-19 без ее предшествующей патологии, бактериальной/микотической суперинфекции и гепатотоксической терапии, а также от неинфекционных заболеваний в отдаленные сроки после перенесенной новой коронавирусной инфекции.

Материал и методы

Образцы ткани печени изучены на материале 47 аутопсий. Из них 37 умерших от COVID-19, вызванной альфа- и бета-вариантами SARS-CoV-2 в 2020-2021 гг. (этиология подтверждена методом прижизненной и посмертной полимеразной цепной реакции — ПЦР); 10 от болезней системы кровообращения (БСК) в сроки от 40 до 300 сут после перенесенной новой коронавирусной инфекции. Вскрытия производились в течение первых суток после констатации летального исхода. В исследование не включали умерших с предшествовавшими заболеваниями печени, алкогольной и иной интоксикацией, коморбидными заболеваниями, сопровождающимися ее поражением (включая сахарный диабет, ожирение и метаболический синдром), со злокачественными новообразованиями, а также после интенсивной терапии, превышающей 3 сут. В первых двух группах были также исключены наблюдения с бактериальной/микотической инфекцией и умершие, получавшие антибиотикотерапию, биологическую или иную потенциально гепатотоксическую терапию. Все наблюдения были разделены на 3 группы.

В 1-ю группу вошло 10 наблюдений (4 мужчины и 6 женщин) в возрасте от 46 до 97 лет (в среднем 75,2 года) с морфологически подтвержденной экссудативной фазой диффузного альвеолярного повреждения (ДАП), умерших от ОРДС в первые 7 сут от начала заболевания и в первые сутки после госпитализации.

Во 2-ю группу включено 27 наблюдений (12 мужчин и 15 женщин) в возрасте от 29 до 89 лет (в среднем 71,7 года) с морфологически подтвержденными пролиферативной или экссудативно-пролиферативной фазами ДАП, умерших от ОРДС на 14—16-е сутки от начала заболевания и в пределах 3 сут после госпитализации.

В 3-й группе было 10 наблюдений (1 мужчина и 9 женщин) в возрасте от 72 до 94 лет (в среднем 84,7 года), умерших в первые сутки после госпитализации от ишемической кардиомиопатии, постинфарктного кардиосклероза и ишемических инфарктов головного мозга в сроки от 40 до 300 сут после перенесенной COVID-19 различной степени тяжести. Из этой группы были исключены наблюдения с прижизненными или посмертными положительными на SARS-CoV-2 результатами ПЦР и/или с клиническими проявлениями постковидного синдрома.

От 3 до 5 образцов ткани печени фиксировали в нейтральном забуференном 10% формалине и обрабатывали по общепринятой методике с изготовлением парафиновых блоков. Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Leica ST 5010, Leica Microsystems, Германия) и проводили иммуногистохимические (ИГХ) реакции с готовыми первичными моноклональными антителами к CD3 (T-лимфоцитам), клон LN10, CD4 (T-хелперам), клон 4B12, CD8 (цитотоксическим T-лимфоцитам), клон 4B11, CD56 (натуральным киллерам — ЕК-клеткам), клон CD564 и CD68 (клеткам системы мононуклеарных фагоцитов), клон 514H12 фирмы Leica Bond (иммуностейнер LeicaBond-MAX, Германия), а также CD20 (В-лимфоцитам), клон L26, производитель Ventana Medical Systems, с соответствующими контролями. Гистологические препараты сканировали с помощью цифрового сканера KF-PRO-120-HI с последующим анализом изображений [v12.4.5003].

Для каждого изучаемого антигена во всех наблюдениях 3 групп проводился подсчет клеток с положительных ИГХ-реакцией в 10 портальных трактах и 10 полях зрения в паренхиматозных дольках при увеличении в 400 раз. Для статистического анализа вычисляли М±m и медианы (Me) получившихся показателей для изученных групп наблюдений.

Ввиду того что исследуемые количественные величины имели распределение, отличное от нормального, использовали Н-критерий Краскела—Уоллиса (Н-КУ) для определения значимости различий медианных значений между группами исследования. Для интерпретации результатов однофакторного дисперсионного анализа Краскела—Уоллиса были проведены апостериорные попарные сравнения медианных значений методом (тестом) Двасса—Стила—Кричлоу—Флигнера (ДСКФ).

Результаты исследования

Результаты макро- и микроскопического исследования изменений печени в исследуемых группах наблюдений были представлены в предыдущей публикации [8], а в данной статье описание ограничено количественной и качественной характеристиками субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов портальных трактов и перисинусоидальных пространств.

Во всех наблюдениях 1-й и 2-й групп при гистологическом исследовании отмечена слабо или умеренно выраженная мононуклеарная с примесью нейтрофильных лейкоцитов портальная инфильтрация с сохранением пограничной пластинки, повышено число интраэпителиальных лимфоцитов интрапортальных желчных протоков. Внутри долек встречались немногочисленные лимфоциты и их небольшие группы, а также нейтрофильные лейкоциты, в 30% наблюдений — лейкостазы в синусоидах. Выявлялась пролиферация купферовских клеток.

В наблюдениях 3-й группы отмечены проявления хронического венозного полнокровия, а также, по-видимому, последствия перенесенного COVID-19: слабо или умеренно выраженная мононуклеарная инфильтрация портальных трактов, неполные и полные соединительнотканные портоцентральные и порто-портальные септы и признаки вторичного склерозирующего холангита, сходного с SSC-CIP [8]. Внутри долек наблюдались единичные лимфоциты, а пролиферация купферовских клеток не была выражена.

Результаты ИГХ-исследования показали, что основные изменения количества и состава субпопуляций лимфоцитов, а также клеток системы мононуклеарных фагоцитов развивались интралобулярно, причем состав субпопуляций лимфоцитов менялся разнонаправлено.

Портальные тракты

В портальных трактах общее количество T-лимфоцитов (CD3+), цитотоксических T-лимфоцитов (CD8+), В-лимфоцитов (CD20+), ЕК-клеток (CD56+), а также клеток системы мононуклеарных фагоцитов (CD68+) в острый период COVID-19 (1-я и 2-я группы наблюдений) статистически достоверно не превышало эти показатели у умерших от БСК в отдаленные сроки после перенесенного инфекционного заболевания (табл. 1).

Таблица 1. Достоверность различий между группами наблюдений по Н-критерию Краскела—Уоллиса количества субпопуляций лимфоцитов (CD3+-CD56+) и клеток мононуклеарных фагоцитов (CD68+) в портальных трактах

Однако количество T-хелперов (CD4+) было достоверно больше в экссудативную фазу ДАП COVID-19 (1-й группе наблюдений), в 3,5 раза снижалось в пролиферативную и смешанную фазы (2-я группа), и они не определялись у умерших в отдаленные сроки после перенесенного инфекционного заболевания (3-я группа) (см. табл. 1, рис. 1). За счет уменьшения числа T-хелперов при неизменном количестве цитотоксических T-лимфоцитов соотношение среднего количества лимфоцитов CD4+/CD8+ в портальных трактах уменьшалось в 6 раз во 2-й группе по сравнению с 1-й (с 0,6 до 0,1), а в 3-й группе обнаруживались только клетки CD8+.

Рис. 1. T-хелперы (CD4+) в портальных трактах печени (в том числе интраэпителиально в мелких желчных протоках — а, б).

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа наблюдений; г — распределение T-хелперов (CD4+) в портальных трактах (Me 1-й группы — 8,5 (1—55), 2-й — 1 (0—20), 3-й — 0; p=0,003 по Н-КУ; p=0,021 по тестам ДСКФ); а—в — ИГХ-реакция, ×200.

По сравнению с 3-й группой наблюдения в 1-й и 2-й группах обращали на себя внимание интраэпителиальные T-лимфоциты (включая T-хелперов и цитотоксических T-лимфоцитов), а также ЕК-клетки (CD56+) желчных протоков портальных трактов и инфильтрирующие стенки мелких интрапортальных сосудов (см. рис. 1, а, б, рис. 2, а—г). В 3-й группе наблюдений они практически не выявлялись.

Рис. 2. Интраэпителиальные лимфоциты желчных протоков портальных трактов и инфильтрирующие стенки интрапортальных сосудов (стрелки).

а — T-лимфоциты (CD3+), 1-я группа наблюдений; б — T-хелперы (CD4+); в цитотоксические T-лимфоциты /киллеры (CD8+); г — ЕК-клетки (CD56+), 2-я группа наблюдений. ИГХ-реакция, ×400.

Перисинусоидальные пространства

В отличие от портальных трактов в перисинусоидальных пространствах общее количество T-лимфоцитов (CD3+), число цитотоксических T-лимфоцитов (CD8+), ЕК-клеток (CD56+) и В-лимфоцитов (CD20+) у умерших от БСК после перенесенной COVID-19 (3-я группа) было статистически достоверно больше, чем в 1-й и 2-й группах (по тестам ДСКФ; p=0,031; p=0,030; p=0,015 и p=0,036 соответственно). При этом число клеток системы мононуклеарных фагоцитов (CD68+) было меньше, а между 1-й и 2-й группой различия были статистически недостоверны (табл. 2, рис. 3, а—г).

Таблица 2. Достоверность различий между группами наблюдений количества субпопуляций лимфоцитов и клеток мононуклеарных фагоцитов в перисинусоидальных пространствах по Н-критерию Краскела—Уоллиса

Рис. 3. T-лимфоциты (CD3+) в перисинусоидальных пространствах печеночных долек.

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа наблюдений; г — распределение T-лимфоцитов (CD3+) в перисинусоидальных пространствах (Me 1-й группы — 19 (11—25); 2-й — 24 (17—92); 3-й — 64 (34—144); p=0,015 по Н-КУ; p=0,031 по тестам ДСКФ при сравнении 1-й и 3-й групп); а—в — ИГХ-реакция, ×200.

Напротив, как и в портальных трактах, количество T-хелперов (CD4+) в перисинусоидальных пространствах в 3-й группе было меньше по сравнению с 1-й и 2-й группой (по тесту ДСКФ p=0,021). Между 1-й и 2-й группой наблюдений различия были статистически недостоверны. В результате нарастания числа цитотоксических T-лимфоцитов и снижения T-хелперов соотношение среднего количества лимфоцитов CD4+/CD8+ уменьшалось в 2 раза во 2-й группе по сравнению с 1-й (с 0,18 до 0,09), а в 3-й группе обнаруживались только клетки CD8+.

Число положительных клеток CD68+ системы мононуклеарных фагоцитов в перисинусоидальных пространствах достоверно не отличалось в 1-й и 2-й группах, но было меньше в 3-й (см. табл. 2, рис. 4, а—г). Морфологические особенности указывают, что это в основном купферовские клетки, пролиферация которых более заметна во II и III зонах печеночных долек.

Рис. 4. Клетки системы моноцитарных фагоцитов (CD68+) — моноциты, макрофаги, купферовские клетки в перисинусоидальных пространствах печеночных долек.

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа наблюдений; г — распределение клеток CD68+ в перисинусоидальных пространствах (Me 1-й группы — 375 (320—470); 2-й — 440 (310—580); 3-й — 240 (155—315); p=0,015 по Н-КУ; p=0,031 по тестам ДСКФ при сравнении 1-й и 3-й групп); а—в — ИГХ-реакция, ×200.

Обсуждение

При анализе доступной научной литературы не удалось найти публикации, в которых обсуждались бы качественные и количественные характеристики субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов в ткани печени в разные фазы острого периода COVID-19 и в отдаленные сроки после перенесенной новой коронавирусной инфекции. Отдельные исследования продемонстрировали только наличие в ткани печени различных субпопуляций T-лимфоцитов и пролиферацию купферовских клеток в острый период COVID-19 [3, 6, 7, 9—18]. Однако в этих работах в анализ были включены наблюдения с коморбидными заболеваниями, бактериальной/микотической суперинфекцией, гепатотоксической лекарственной терапией, длительной ИВЛ в отличие от настоящего исследования, где влияние этих патогенетических факторов повреждения печени было специально максимально ограничено.

Ранее описанные нами и другими авторами патоморфологические изменения печени в острый период тяжелой формы COVID-19, протекающей как вирусный сепсис и септический шок, соответствуют проявлениям ишемического (гипоксического) гепатита. Он характерен для различных тяжелых инфекционных и неинфекционных заболеваний, гипоксемии, шока и сепсиса любой этиологии. Ишемический гепатит — это один из видов сепсис-ассоциированного гепатита при синдроме полиорганной недостаточности, для которого типичны отсутствие или минимальная выраженность портальной и лобулярной воспалительной инфильтрации, что подтвердило данное исследование [1, 8, 23, 24].

Так, если в портальных трактах общее число T-лимфоцитов, T-хелперов/цитотоксических T-лимфоцитов, ЕК-клеток и В-лимфоцитов не различалось во всех трех изученных группах наблюдений, то в перисинусоидальных пространствах оно даже было меньше, чем в отдаленные сроки после перенесенного COVID-19 у умерших от БСК. Эти умершие были с хроническим венозным полнокровием печени и связанной с этим ишемическим/гипоксическим ее повреждением (3-я группа). Нельзя исключить, что это вызвано последствиями ранее перенесенного COVID-19 у таких больных, тем более, что у них выявлены фиброз печени и признаки склерозирующего холангита, сходного с SSC-CIP [1, 8].

Только количество цитотоксических T-лимфоцитов было максимальным в экссудативную фазу ДАП (1-я группа), снижалось в пролиферативную и смешанную фазы (2-я группа), а в 3-й группе лимфоциты CD4+ не выявлялись. Это приводило к высокой величине соотношения лимфоцитов CD4+/CD8+ как в строме, так и паренхиме печени в раннюю фазу острого периода COVID-19. Кроме того, для острого периода COVID-19 (1-я и 2-я группы) оказалась характерной выраженная пролиферация купферовских клеток. Это позволяет предположить, что наряду с неспецифическим ишемическим гепатитом в ткани печени развиваются изменения, вызванные либо прямым повреждением SARS-CoV-2, либо сложным комплексом иммунных нарушений, свойственных COVID-19. Следует также учитывать способность печени индуцировать иммунную толерантность, что влияет на количественные и качественные характеристики иммунокомпетентных клеток, присутствующих в ее ткани [20—22].

Выявленные особенности состава и количества иммунокомпетентных клеток печени в острый период COVID-19 характерны для некоторых вариантов течения вирусных гепатитов [25]. Однако, несмотря на высокий уровень экспрессии АПФ-2 холангиоцитами, аналогичный альвеолоцитам 2-го типа (главной мишенью SARS-CoV-2), присутствие этих рецепторов у гепатоцитов, обнаружение многими исследователями белков и генетического материала SARS-CoV-2 в холангиоцитах и гепатоцитах, вопрос о роли вирусного повреждения печени при COVID-19 остается открытым [1—19].

Повышение числа интраэпителиальных T-лимфоцитов желчных протоков портальных трактов в 1-й и 2-й группах наблюдения, включая T-хелперы и цитотоксические T-лимфоциты, а также ЕК-клетки, укладывается в ранее описанные нами и другими авторами COVID-19-ассоциированную холангиопатию, которая приводит у отдельных больных к развитию вторичного склерозирующего холангита, сходного с SSC-CIP. T-лимфоциты и ЕК-клетки, инфильтрирующие стенки мелких сосудов портальных трактов, можно трактовать как проявление COVID-19-ассоциированной микроангиопатии [1—19].

Заключение

Проведенное исследование впервые позволило провести анализ состава и количества иммунокомпетентных клеток в ткани печени в разные фазы острого периода COVID-19 и в поздние сроки после перенесенной новой коронавирусной инфекции на материале, который исключил влияние коморбидных заболеваний, бактериальной/микотической суперинфекции и гепатотоксической лекарственной терапии.

Исследование подтвердило, что морфологическим субстратом COVID-19-ассоциированного поражения печени может быть ишемический гепатит, а COVID-19-ассоциированные холангиопатия и микроангиопатия придают ему определенную специфичность. Выявленные изменения не позволяют исключить, что патогенез повреждения печени может быть также связан в том числе с прямым действием SARS-CoV-2 или иммунными нарушениями, свойственными COVID-19.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Красненкова С.Ф., Зайратьянц О.В., Михалева Л.М.

Сбор и обработка материала — Красненкова С.Ф., Конторщиков А.С., Мидибер К.Ю.

Статистическая обработка — Конторщиков А.С., Мидибер К.Ю., Печникова В.В.

Написание текста — Красненкова С.Ф.

Редактирование — Зайратьянц О.В., Михалева Л.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.