Характеристика субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов печени в острый период и в отдаленные сроки после перенесенного заболевания COVID-19

COVID-19-ассоциированное поражение печени (COVID-19-Related Liver Injury — CRLI) в острый период COVID-19 развивается у 14—78% больных, чаще при тяжелом течении заболевания, в единичных случаях как особый вариант течения болезни, и во многом сходно с описанным при тяжелых, протекающих как вирусный сепсис формах гриппа A/H1N1 и коронавирусных инфекций — MERS-CoV и SARS-CoV-1, а также при сепсисе и шоке любой этиологии [1—18]. Изолированная, или в составе синдрома острой полиорганной недостаточности, печеночная недостаточность расценивается как прогностически неблагоприятный фактор, но редко достигает критических величин и влияет на танатогенез [1—18].

Патогенез CRLI обусловлен, как полагают, сочетанием многих факторов: вирусным повреждением, иммунными нарушениями, гипоксией/реперфузией, COVID-19-ассоциированнми ангио- и коагулопатиями, бактериальной/микотической суперинфекцией, сепсисом и шоком, обострениями коморбидных заболеваний, лекарственной гепатотоксичностью и др. [1—18].

Патоморфологические изменения печени при CRLI характерны, но не неспецифичны. Они включают признаки ишемического гепатита (центролобулярные некрозы и жировая дистрофия без выраженной воспалительной реакции в 37—100% наблюдений) в сочетании с COVID-19-ассоциированными микроангиопатией, гиперкоагуляцией (12—100%) и холестазом с альтерацией и пролиферацией интрапортальных желчных протоков (12—100%). В части наблюдений встречаются тромбоз крупных вен или артерий и инфаркты печени. Определяется слабо или умеренно выраженная мононуклеарная с примесью нейтрофильных лейкоцитов, плазмоцитов портальная (23—100%) и лобулярная инфильтрация (7—100%), которая в редких случаях бывает выраженной и тогда трактуется как острый гепатит неуточненной этиологии. В единичных работах отмечены присутствие в острый период COVID-19 в портальных трактах и перисинусоидальных пространствах CD3+, CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, CD68+ моноцитов/макрофагов, а также пролиферация купферовских клеток [1, 3, 6, 7, 8—18]. Однако исследования проводились без исключения влияния на печень бактериальной/микотической суперинфекции и гепатотоксической лекарственной терапии. Количественная и качественная характеристика субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов в разные фазы острого периода COVID-19 и отдаленные сроки после перенесенного заболевания не изучались.

После перенесенного COVID-19 клинико-лабораторные проявления CRLI обычно самопроизвольно регрессируют в течение 2—3 нед, но у 2—15% больных персистируют, что получило название «постковидный гепатобилиарный синдром» как вариант постковидного синдрома. Его морфологический субстрат недостаточно изучен, описан жировой гепатоз и фиброз печени, у отдельных больных — лекарственный и аутоиммунный гепатит. В 0,6—1% наблюдений прогрессирует или возникает впервые COVID-19-ассоциированная холангиопатия, аналогичная вторичному склерозирующему холангиту у пациентов в критическом состоянии (Secondary Sclerosing Cholangitis in Critically Ill Patients — SSC-CIP), которая может приводить к первичному билиарному циррозу печени или гнойному холангиту [1, 6, 8, 19].

Изучение количественной и качественной характеристики субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов ткани печени при COVID-19 особенно актуально, так как печень обладает способностью индуцировать иммунную толерантность из-за постоянного поступления различных антигенов по системе воротной вены. Она достигается благодаря клональной делеции, истощению или ингибированию субпопуляций T-лимфоцитов [20, 21]. В результате при вирусных заболеваниях печени страдает адаптивный иммунный ответ, что при COVID-19 может приводить к повреждению ткани печени, персистенции SARS-CoV-2 или более тяжелому течению заболевания [22].

Цель исследования — анализ количественной и качественной характеристики субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов ткани печени на материале аутопсий у умерших в разные фазы острого периода COVID-19 без ее предшествующей патологии, бактериальной/микотической суперинфекции и гепатотоксической терапии, а также от неинфекционных заболеваний в отдаленные сроки после перенесенной новой коронавирусной инфекции.

Образцы ткани печени изучены на материале 47 аутопсий. Из них 37 умерших от COVID-19, вызванной альфа- и бета-вариантами SARS-CoV-2 в 2020-2021 гг. (этиология подтверждена методом прижизненной и посмертной полимеразной цепной реакции — ПЦР); 10 от болезней системы кровообращения (БСК) в сроки от 40 до 300 сут после перенесенной новой коронавирусной инфекции. Вскрытия производились в течение первых суток после констатации летального исхода. В исследование не включали умерших с предшествовавшими заболеваниями печени, алкогольной и иной интоксикацией, коморбидными заболеваниями, сопровождающимися ее поражением (включая сахарный диабет, ожирение и метаболический синдром), со злокачественными новообразованиями, а также после интенсивной терапии, превышающей 3 сут. В первых двух группах были также исключены наблюдения с бактериальной/микотической инфекцией и умершие, получавшие антибиотикотерапию, биологическую или иную потенциально гепатотоксическую терапию. Все наблюдения были разделены на 3 группы.

В 1-ю группу вошло 10 наблюдений (4 мужчины и 6 женщин) в возрасте от 46 до 97 лет (в среднем 75,2 года) с морфологически подтвержденной экссудативной фазой диффузного альвеолярного повреждения (ДАП), умерших от ОРДС в первые 7 сут от начала заболевания и в первые сутки после госпитализации.

Во 2-ю группу включено 27 наблюдений (12 мужчин и 15 женщин) в возрасте от 29 до 89 лет (в среднем 71,7 года) с морфологически подтвержденными пролиферативной или экссудативно-пролиферативной фазами ДАП, умерших от ОРДС на 14—16-е сутки от начала заболевания и в пределах 3 сут после госпитализации.

В 3-й группе было 10 наблюдений (1 мужчина и 9 женщин) в возрасте от 72 до 94 лет (в среднем 84,7 года), умерших в первые сутки после госпитализации от ишемической кардиомиопатии, постинфарктного кардиосклероза и ишемических инфарктов головного мозга в сроки от 40 до 300 сут после перенесенной COVID-19 различной степени тяжести. Из этой группы были исключены наблюдения с прижизненными или посмертными положительными на SARS-CoV-2 результатами ПЦР и/или с клиническими проявлениями постковидного синдрома.

От 3 до 5 образцов ткани печени фиксировали в нейтральном забуференном 10% формалине и обрабатывали по общепринятой методике с изготовлением парафиновых блоков. Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Leica ST 5010, Leica Microsystems, Германия) и проводили иммуногистохимические (ИГХ) реакции с готовыми первичными моноклональными антителами к CD3 (T-лимфоцитам), клон LN10, CD4 (T-хелперам), клон 4B12, CD8 (цитотоксическим T-лимфоцитам), клон 4B11, CD56 (натуральным киллерам — ЕК-клеткам), клон CD564 и CD68 (клеткам системы мононуклеарных фагоцитов), клон 514H12 фирмы Leica Bond (иммуностейнер LeicaBond-MAX, Германия), а также CD20 (В-лимфоцитам), клон L26, производитель Ventana Medical Systems, с соответствующими контролями. Гистологические препараты сканировали с помощью цифрового сканера KF-PRO-120-HI с последующим анализом изображений [v12.4.5003].

Для каждого изучаемого антигена во всех наблюдениях 3 групп проводился подсчет клеток с положительных ИГХ-реакцией в 10 портальных трактах и 10 полях зрения в паренхиматозных дольках при увеличении в 400 раз. Для статистического анализа вычисляли М±m и медианы (Me) получившихся показателей для изученных групп наблюдений.

Ввиду того что исследуемые количественные величины имели распределение, отличное от нормального, использовали Н-критерий Краскела—Уоллиса (Н-КУ) для определения значимости различий медианных значений между группами исследования. Для интерпретации результатов однофакторного дисперсионного анализа Краскела—Уоллиса были проведены апостериорные попарные сравнения медианных значений методом (тестом) Двасса—Стила—Кричлоу—Флигнера (ДСКФ).

Результаты макро- и микроскопического исследования изменений печени в исследуемых группах наблюдений были представлены в предыдущей публикации [8], а в данной статье описание ограничено количественной и качественной характеристиками субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов портальных трактов и перисинусоидальных пространств.

Во всех наблюдениях 1-й и 2-й групп при гистологическом исследовании отмечена слабо или умеренно выраженная мононуклеарная с примесью нейтрофильных лейкоцитов портальная инфильтрация с сохранением пограничной пластинки, повышено число интраэпителиальных лимфоцитов интрапортальных желчных протоков. Внутри долек встречались немногочисленные лимфоциты и их небольшие группы, а также нейтрофильные лейкоциты, в 30% наблюдений — лейкостазы в синусоидах. Выявлялась пролиферация купферовских клеток.

В наблюдениях 3-й группы отмечены проявления хронического венозного полнокровия, а также, по-видимому, последствия перенесенного COVID-19: слабо или умеренно выраженная мононуклеарная инфильтрация портальных трактов, неполные и полные соединительнотканные портоцентральные и порто-портальные септы и признаки вторичного склерозирующего холангита, сходного с SSC-CIP [8]. Внутри долек наблюдались единичные лимфоциты, а пролиферация купферовских клеток не была выражена.

Результаты ИГХ-исследования показали, что основные изменения количества и состава субпопуляций лимфоцитов, а также клеток системы мононуклеарных фагоцитов развивались интралобулярно, причем состав субпопуляций лимфоцитов менялся разнонаправлено.

В портальных трактах общее количество T-лимфоцитов (CD3+), цитотоксических T-лимфоцитов (CD8+), В-лимфоцитов (CD20+), ЕК-клеток (CD56+), а также клеток системы мононуклеарных фагоцитов (CD68+) в острый период COVID-19 (1-я и 2-я группы наблюдений) статистически достоверно не превышало эти показатели у умерших от БСК в отдаленные сроки после перенесенного инфекционного заболевания (табл. 1).

Таблица 1.Достоверность различий между группами наблюдений по Н-критерию Краскела—Уоллиса количества субпопуляций лимфоцитов (CD3+-CD56+) и клеток мононуклеарных фагоцитов (CD68+) в портальных трактах

Однако количество T-хелперов (CD4+) было достоверно больше в экссудативную фазу ДАП COVID-19 (1-й группе наблюдений), в 3,5 раза снижалось в пролиферативную и смешанную фазы (2-я группа), и они не определялись у умерших в отдаленные сроки после перенесенного инфекционного заболевания (3-я группа) (см. табл. 1, рис. 1). За счет уменьшения числа T-хелперов при неизменном количестве цитотоксических T-лимфоцитов соотношение среднего количества лимфоцитов CD4+/CD8+ в портальных трактах уменьшалось в 6 раз во 2-й группе по сравнению с 1-й (с 0,6 до 0,1), а в 3-й группе обнаруживались только клетки CD8+.

Рис. 1.T-хелперы (CD4+) в портальных трактах печени (в том числе интраэпителиально в мелких желчных протоках — а, б).

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа наблюдений; г — распределение T-хелперов (CD4+) в портальных трактах (Me 1-й группы — 8,5 (1—55), 2-й — 1 (0—20), 3-й — 0; p=0,003 по Н-КУ; p=0,021 по тестам ДСКФ); а—в — ИГХ-реакция, ×200.

По сравнению с 3-й группой наблюдения в 1-й и 2-й группах обращали на себя внимание интраэпителиальные T-лимфоциты (включая T-хелперов и цитотоксических T-лимфоцитов), а также ЕК-клетки (CD56+) желчных протоков портальных трактов и инфильтрирующие стенки мелких интрапортальных сосудов (см. рис. 1, а, б, рис. 2, а—г). В 3-й группе наблюдений они практически не выявлялись.

Рис. 2.Интраэпителиальные лимфоциты желчных протоков портальных трактов и инфильтрирующие стенки интрапортальных сосудов (стрелки).

а — T-лимфоциты (CD3+), 1-я группа наблюдений; б — T-хелперы (CD4+); в цитотоксические T-лимфоциты /киллеры (CD8+); г — ЕК-клетки (CD56+), 2-я группа наблюдений. ИГХ-реакция, ×400.

В отличие от портальных трактов в перисинусоидальных пространствах общее количество T-лимфоцитов (CD3+), число цитотоксических T-лимфоцитов (CD8+), ЕК-клеток (CD56+) и В-лимфоцитов (CD20+) у умерших от БСК после перенесенной COVID-19 (3-я группа) было статистически достоверно больше, чем в 1-й и 2-й группах (по тестам ДСКФ; p=0,031; p=0,030; p=0,015 и p=0,036 соответственно). При этом число клеток системы мононуклеарных фагоцитов (CD68+) было меньше, а между 1-й и 2-й группой различия были статистически недостоверны (табл. 2, рис. 3, а—г).

Таблица 2.Достоверность различий между группами наблюдений количества субпопуляций лимфоцитов и клеток мононуклеарных фагоцитов в перисинусоидальных пространствах по Н-критерию Краскела—Уоллиса

Рис. 3.T-лимфоциты (CD3+) в перисинусоидальных пространствах печеночных долек.

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа наблюдений; г — распределение T-лимфоцитов (CD3+) в перисинусоидальных пространствах (Me 1-й группы — 19 (11—25); 2-й — 24 (17—92); 3-й — 64 (34—144); p=0,015 по Н-КУ; p=0,031 по тестам ДСКФ при сравнении 1-й и 3-й групп); а—в — ИГХ-реакция, ×200.

Напротив, как и в портальных трактах, количество T-хелперов (CD4+) в перисинусоидальных пространствах в 3-й группе было меньше по сравнению с 1-й и 2-й группой (по тесту ДСКФ p=0,021). Между 1-й и 2-й группой наблюдений различия были статистически недостоверны. В результате нарастания числа цитотоксических T-лимфоцитов и снижения T-хелперов соотношение среднего количества лимфоцитов CD4+/CD8+ уменьшалось в 2 раза во 2-й группе по сравнению с 1-й (с 0,18 до 0,09), а в 3-й группе обнаруживались только клетки CD8+.

Число положительных клеток CD68+ системы мононуклеарных фагоцитов в перисинусоидальных пространствах достоверно не отличалось в 1-й и 2-й группах, но было меньше в 3-й (см. табл. 2, рис. 4, а—г). Морфологические особенности указывают, что это в основном купферовские клетки, пролиферация которых более заметна во II и III зонах печеночных долек.

Рис. 4.Клетки системы моноцитарных фагоцитов (CD68+) — моноциты, макрофаги, купферовские клетки в перисинусоидальных пространствах печеночных долек.

а — 1-я группа; б — 2-я группа; в — 3-я группа наблюдений; г — распределение клеток CD68+ в перисинусоидальных пространствах (Me 1-й группы — 375 (320—470); 2-й — 440 (310—580); 3-й — 240 (155—315); p=0,015 по Н-КУ; p=0,031 по тестам ДСКФ при сравнении 1-й и 3-й групп); а—в — ИГХ-реакция, ×200.

При анализе доступной научной литературы не удалось найти публикации, в которых обсуждались бы качественные и количественные характеристики субпопуляций лимфоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов в ткани печени в разные фазы острого периода COVID-19 и в отдаленные сроки после перенесенной новой коронавирусной инфекции. Отдельные исследования продемонстрировали только наличие в ткани печени различных субпопуляций T-лимфоцитов и пролиферацию купферовских клеток в острый период COVID-19 [3, 6, 7, 9—18]. Однако в этих работах в анализ были включены наблюдения с коморбидными заболеваниями, бактериальной/микотической суперинфекцией, гепатотоксической лекарственной терапией, длительной ИВЛ в отличие от настоящего исследования, где влияние этих патогенетических факторов повреждения печени было специально максимально ограничено.

Ранее описанные нами и другими авторами патоморфологические изменения печени в острый период тяжелой формы COVID-19, протекающей как вирусный сепсис и септический шок, соответствуют проявлениям ишемического (гипоксического) гепатита. Он характерен для различных тяжелых инфекционных и неинфекционных заболеваний, гипоксемии, шока и сепсиса любой этиологии. Ишемический гепатит — это один из видов сепсис-ассоциированного гепатита при синдроме полиорганной недостаточности, для которого типичны отсутствие или минимальная выраженность портальной и лобулярной воспалительной инфильтрации, что подтвердило данное исследование [1, 8, 23, 24].

Так, если в портальных трактах общее число T-лимфоцитов, T-хелперов/цитотоксических T-лимфоцитов, ЕК-клеток и В-лимфоцитов не различалось во всех трех изученных группах наблюдений, то в перисинусоидальных пространствах оно даже было меньше, чем в отдаленные сроки после перенесенного COVID-19 у умерших от БСК. Эти умершие были с хроническим венозным полнокровием печени и связанной с этим ишемическим/гипоксическим ее повреждением (3-я группа). Нельзя исключить, что это вызвано последствиями ранее перенесенного COVID-19 у таких больных, тем более, что у них выявлены фиброз печени и признаки склерозирующего холангита, сходного с SSC-CIP [1, 8].

Только количество цитотоксических T-лимфоцитов было максимальным в экссудативную фазу ДАП (1-я группа), снижалось в пролиферативную и смешанную фазы (2-я группа), а в 3-й группе лимфоциты CD4+ не выявлялись. Это приводило к высокой величине соотношения лимфоцитов CD4+/CD8+ как в строме, так и паренхиме печени в раннюю фазу острого периода COVID-19. Кроме того, для острого периода COVID-19 (1-я и 2-я группы) оказалась характерной выраженная пролиферация купферовских клеток. Это позволяет предположить, что наряду с неспецифическим ишемическим гепатитом в ткани печени развиваются изменения, вызванные либо прямым повреждением SARS-CoV-2, либо сложным комплексом иммунных нарушений, свойственных COVID-19. Следует также учитывать способность печени индуцировать иммунную толерантность, что влияет на количественные и качественные характеристики иммунокомпетентных клеток, присутствующих в ее ткани [20—22].

Выявленные особенности состава и количества иммунокомпетентных клеток печени в острый период COVID-19 характерны для некоторых вариантов течения вирусных гепатитов [25]. Однако, несмотря на высокий уровень экспрессии АПФ-2 холангиоцитами, аналогичный альвеолоцитам 2-го типа (главной мишенью SARS-CoV-2), присутствие этих рецепторов у гепатоцитов, обнаружение многими исследователями белков и генетического материала SARS-CoV-2 в холангиоцитах и гепатоцитах, вопрос о роли вирусного повреждения печени при COVID-19 остается открытым [1—19].

Повышение числа интраэпителиальных T-лимфоцитов желчных протоков портальных трактов в 1-й и 2-й группах наблюдения, включая T-хелперы и цитотоксические T-лимфоциты, а также ЕК-клетки, укладывается в ранее описанные нами и другими авторами COVID-19-ассоциированную холангиопатию, которая приводит у отдельных больных к развитию вторичного склерозирующего холангита, сходного с SSC-CIP. T-лимфоциты и ЕК-клетки, инфильтрирующие стенки мелких сосудов портальных трактов, можно трактовать как проявление COVID-19-ассоциированной микроангиопатии [1—19].

Проведенное исследование впервые позволило провести анализ состава и количества иммунокомпетентных клеток в ткани печени в разные фазы острого периода COVID-19 и в поздние сроки после перенесенной новой коронавирусной инфекции на материале, который исключил влияние коморбидных заболеваний, бактериальной/микотической суперинфекции и гепатотоксической лекарственной терапии.

Исследование подтвердило, что морфологическим субстратом COVID-19-ассоциированного поражения печени может быть ишемический гепатит, а COVID-19-ассоциированные холангиопатия и микроангиопатия придают ему определенную специфичность. Выявленные изменения не позволяют исключить, что патогенез повреждения печени может быть также связан в том числе с прямым действием SARS-CoV-2 или иммунными нарушениями, свойственными COVID-19.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Красненкова С.Ф., Зайратьянц О.В., Михалева Л.М.

Сбор и обработка материала — Красненкова С.Ф., Конторщиков А.С., Мидибер К.Ю.

Статистическая обработка — Конторщиков А.С., Мидибер К.Ю., Печникова В.В.

Написание текста — Красненкова С.Ф.

Редактирование — Зайратьянц О.В., Михалева Л.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.