В настоящее время эндометриоз признается одним из самых загадочных заболеваний, затрагивающих миллионы женщин по всему миру. Несмотря на более чем полувековой опыт исследования, этиология и патогенез этого заболевания так и остаются до конца не ясными. Ввиду разнообразия клинических проявлений эндометриоз является труднодиагностируемым заболеванием, особенно на ранних стадиях. Неинвазивные методы диагностики малоспецифичны, «золотым стандартом» является лапароскопическое исследование, ценностью которого является одновременно с диагностикой хирургическое лечение эндометриоза. Однако частота рецидивов не позволяет считать этот метод лечения высокоэффективным. Современный традиционный подход к терапии больных эндометриозом предусматривает комбинацию хирургического метода (максимальное удаление патологических очагов в пределах неизмененных тканей) и супрессивной гормональной терапии, целью которой является временное угнетение функции яичников, направленное на уменьшение секреции эстрадиола, приводящее к регрессу эндометриоидных гетеротопий, хотя активно разрабатываются и новые подходы [1—4].

На сегодняшний день лечение больных эндометриозом представляет одну из важнейших проблем современной гинекологии. Не существует, а возможно, и не может существовать, единого подхода и универсального метода лечения, который гарантировал бы облегчение симптомов, приводил бы к полному излечению и отсутствию рецидивов. В связи с этим поиск новых стратегий терапии эндометриоза является крайне актуальной задачей, особенно в контексте развития персонифицированной медицины.

Одной из основных причин отсутствия прогресса в лечении эндометриоза является трудность изучения данного заболевания у людей. Невозможно оценить истинную распространенность заболевания в популяции, контролируемые эксперименты ограничены, поскольку оценка эффективности лечения затруднена без выполнения повторных лапароскопий, что представляет сложность по многим причинам.

В природе эндометриоз встречается только у человека и некоторых приматов. Считается, что важным требованием для спонтанного развития эндометриоза является наличие менструаций. Для исследовательских целей заболевание может быть индуцировано путем трансплантации либо аутологичной ткани матки, либо эндометрия человека в эктопические участки. Такие работы в течение многих лет проводятся как на приматах, так и на животных других видов, в том числе на грызунах. Отечественные экспериментальные исследования в этом направлении малочисленны. В то время как за рубежом накоплен большой опыт, позволяющий создавать разные модели эндометриоза для решения разных задач. Сформировать общее представление об экспериментальных моделях эндометриоза, оценить их преимущества и недостатки, а также применимость для решения конкретной задачи или изучаемой гипотезы является основной целью обзора.

Хорион-аллантоисная оболочка (ХАО) куриного эмбриона может рассматриваться как модель эндометриоза в широком смысле. Изначально она была разработана для исследования инвазивного, метастазирующего и ангиогенного потенциала опухолевых клеток. В качестве модели эндометриоза она была создана при культивировании фрагментов ткани эндометрия человека на базальном слое ХАО оплодотворенных куриных эмбрионов после предварительной инкубации в течение 7—10 дней. Фрагменты эндометрия пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла, а также менструальный эндометрий проникают через эпителий в мезенхимальные слои, и развиваются эндометриоидные поражения в течение 3 дней после трансплантации ткани человека [5, 6].

Модель ХАО хорошо подходит для исследования механизмов, участвующих в инвазии и ангиогенезе начальных стадий формирования очага эндометриоза. Эндометриоидные импланты легко доступны для наблюдения. Ангиогенез подтверждается врастанием сосудов ХАО во фрагменты эндометрия человека [6]. На этой модели было изучено влияние антиангиогенных факторов, таких как эндостатин, TNP-470, и антисосудистого эндотелиального фактора роста на ангиогенный ответ в эндометриальных трансплантатах [7]. Однако вполне очевидно, что эта модель эндометриоза не применима для исследования иммунных и воспалительных ответов, а также для исследования долгосрочных эффектов препаратов в процессе развития патологии.

Методы моделирования заболевания

У многих видов приматов наблюдается циклический характер менструации, сопоставимый таковым у людей. У них возможно спонтанное развитие эндометриоза с появлением эктопических поражений, гистологически идентичных и возникающих на аналогичных участках, что и у человека. Хотя существует 11 менструирующих приматов, большинство исследований проводилось на макаках-резусах и бабуинах.

Первые эксперименты по искусственному созданию эндометриоза у человекообразных обезьян были проведены в 1950 г. на макаках-резусах. В попытке создать модель ретроградной менструации R. Te Linde и R. Scott [8] видоизменили матку животных так, что менструальная кровь была перенаправлена в брюшную полость. Через 10 мес у 50% обезьян были найдены эндометриоидные ткани, а также присутствовал массивный спаечный процесс [8]. Впоследствии T. D’Hooghe и соавт. [9], пытаясь увеличить объем ретроградной менструации, в модели на бабуинах провели окклюзию шейки матки с помощью трех методов: вставки из силикона в цервикальный канал, электрокоагуляции и ушивания шейки матки и супрацервикальной перевязки. Последняя выполнялась во время лапаротомии и оказалась единственным методом, который обеспечивал достаточную сопротивляемость нормальной антеградной менструации, так как увеличивался объем ретроградной менструации. Эндометриоз развивался в течение 3 мес у животных, которые подверглись этой процедуре.

Для индуцирования эндометриоза у бабуинов также использовалось внутрибрюшинное введение эндометрия. Эндометрий получали путем трансцервикальной биопсии с кюреткой или при лапаротомии. Затем ткань измельчали и вновь возвращали путем внутрибрюшинной инъекции. Через 2, 5 и 12 мес всем животным была проведена лапароскопия. Авторы [10] сообщали, что площадь поверхности эндометриоидных очагов, количество имплантатов и случаи типичного поражения были выше после забрюшинного введения менструального эндометрия.

Спонтанные заболевания: генетическая эпидемиология, факторы риска и сходство с болезнью у человека

Как уже упоминалось, у приматов эндометриоз может развиваться спонтанно. Диагноз, как и у людей, устанавливается в момент операции (лапароскопия или лапаротомия), хотя также используются рентгенологические методы. Ткань — морфологически идентична человеческой, поражения обнаруживаются в тех же местах, хотя у большинства видов чаще встречаются минимальные формы заболевания.

Были изучены многочисленные факторы риска развития спонтанного эндометриоза у приматов. С этой целью были проверены экспериментальные процедуры, такие как лапароскопия, гистеротомия, и лечение имплантатов эстрадиолом. В случае контролируемого исследования макак-резусов в Национальном центре изучения приматов в Висконсии для определения состояния болезни использовали посмертные записи, касающиеся 61 пораженного животного, которые сравнивали с материалом аналогичного числа контрольных здоровых животных, сопоставимых по возрасту на момент и год смерти [11]. Экспозиция трех или более имплантатов эстрадиолом, как и одна и более гистеротомия, была существенным фактором риска для развития заболевания. Животные, которые подверглись воздействию одной или нескольких лапароскопий, не показали повышенного риска развития эндометриоза.

Распространенность заболевания среди животных, аутопсированных между 1981 и 2001 г. в той же колонии, составила 31,4% и увеличивалась с возрастом на момент смерти [12]. Семейное распространение было подтверждено значительно более высоким средним коэффициентом родства среди больных животных по сравнению со здоровыми. Однако вполне возможно, что неволя сама по себе может влиять на вероятность развития заболевания. При сравнении заболеваемости у бабуинов, живущих длительное время в неволе, с бабуинами, обитающими в дикой природе, было показано, что увеличение продолжительности пребывания в неволе ассоциировалось с более высокой распространенностью спонтанных заболеваний [13]. В то же время неясно, действительно ли эти эффекты по праву можно отнести к жизни в неволе или же это просто возрастное действие.

В большинстве случаев эндометриоз у приматов развивается в пределах брюшной полости, прорастание во внебрюшинное пространство считается редким событием. В 2012 г. B. Assaf1 и A. Miller [14] описали такой случай у 19-летней повторнородящей самки-макаки резуса. Гистологическая экспертиза подтвердила эндометриоз брюшной полости, а также множество маточных желез и стромы, встроенных в плевральный фиброз. Множественные ткани эндометрия присутствовали в легочных лимфатических сосудах и трахеобронхиальных лимфатических узлах. Иммуногистохимически все эктопические ткани эндометрия имели в разной степени положительную иммунореактивность к цитокератину, виментину, рецепторам прогестерона и эстрогена и кальретинину, но были негативны к десмину и карциноэмбриональному антигену. Плевральный эндометриоз — чрезвычайно редкое проявление эндометриоза у приматов. Этот клинический случай подчеркивает в качестве вероятного механизма лимфогенное распространение заболевания. Однако как стромальная ткань и железистый эпителий эндометрия получили доступ к крови и лимфатическому пространству, в настоящее время неизвестно.

Использование моделей приматов для изучения патогенеза заболевания и эффективности медикаментозной терапии

Изучение спонтанного эндометриоза у приматов расширило представление о естественном развитии заболевания. Исследовательская группа T. D’Hooghes [15], в частности, отметила, что эндометриоз у бабуинов — динамический процесс, который проходит периоды развития, регрессии и ремоделирования, но, в конечном счете, он прогрессирует. Этот процесс контролировался с помощью серии лапароскопий в течение 30 мес на 12 бабуинах со спонтанным заболеванием.

Были разработаны разные приложения этой модели, например, исследование влияния иммунной системы на развитие эндометриоза и снижение фертильности.

Так, T. D’Hooghe и соавт. [16] изучали на приматах роль иммунной системы, включая влияние иммуносупрессии на развитие и прогрессирование эндометриоза. В эксперименте участвовали 8 здоровых бабуинов и 24 — с эндометриозом (спонтанное развитие заболевания — 10; индуцированное внутрибрюшинным посевом менструального эндометрия — 14). Шестнадцать животных (здоровые — 4; спонтанный эндометриоз — 5; с индуцированным заболеванием — 7) получали ежедневные внутримышечные инъекции 0,8 мг/кг метилпреднизолона и 2 мг/кг азатиоприна в течение 3 мес; остальные 16 животных не получали лечения. Бабуинов с ослабленным иммунитетом и спонтанным эндометриозом было значительно больше. Площадь поверхности эндометриоидных очагов у них была также больше, чем у интактных животных. Однако животные с ослабленным иммунитетом и нелеченные с индуцированной болезнью имели сопоставимые результаты. Ни у одного изначально здорового животного из особей с ослабленным иммунитетом не развился эндометриоз.

Позднее та же группа исследователей [17] изучала влияние разной степени тяжести эндометриоза на наступление беременности у самок бабуинов, которые были в парах в течение 286 циклов. Полученные в крупном исследовании данные позволяют предположить, что эндометриоз от легкой до тяжелой формы, кроме минимальной, оказывает влияние на фертильность у бабуинов.

Модель приматов чрезвычайно полезна для оценки эффектов новых лекарственных методов лечения данного заболевания. Вещества, такие как фактор некроза опухоли (TNF) связывающий белок 1, который нейтрализует TNFα, цитокин, связанный с воспалением, были изучены на модели эндометриоза, индуцированного у приматов, в сравнении с эффектом аналога люлиберина и плацебо. Как сообщалось авторами исследования [18, 19], применение анти-TNFα было успешным в снижении тяжести заболевания. Гестагенные препараты, модуляторы прогестероновых рецепторов и антагонисты, которые проявляют антипролиферативный эффект, также могут играть роль в лечении эндометриоза [20, 21].

В 2013 г. на модели индуцированного эндометриоза у бабуинов проводились исследования влияния данного заболевания на экспрессию генов в здоровом эндометрии [22, 23]. С этой целью эндометриоз индуцировали внутрибрюшинной инокуляцией аутологичного эндометрия из менструальной крови. После индукции заболевания через определенные промежутки времени проводился анализ маточного эндометрия. Эти исследования показали, что развитие эндометриоза приводит к аномальному фенотипу эндометрия у больных, что проявляется изменением экспрессии определенных генов в эндометрии.

Модели эндометриоза на приматах также используются для изучения последствий загрязнения окружающей среды диоксинами или полихлорированными бифенилами [24].

Оценка модели эндометриоза на приматах

Хотя экспериментально индуцированный эндометриоз принципиально отличается от спонтанного заболевания, следует иметь в виду, что основной целью некоторых экспериментов (например, модели окклюзии шейки матки) была проверка конкретных гипотез. Индуцированное заболевание также предоставляет уникальную возможность для оценки параметров иммунной системы до и после индукции. Когда эти данные контрастируют с результатами, полученными у животных со спонтанным заболеванием, возникает уникальная возможность дифференцировать причину и следствие. Во всех практических отношениях спонтанный эндометриоз — наилучшая модель, хотя важно отметить, что формы заболевания от умеренной до тяжелой с кистозными образованиями яичников не часто встречаются у человекообразных обезьян [25].

Таким образом, эта модель является оптимальной для изучения многочисленных аспектов заболевания, в том числе инициирования и прогрессирования эндометриоза, иммунологических параметров, наследственных факторов, а также механизма обратной связи на эутопический эндометрий [26].

Однако этические соображения и высокая стоимость проведения экспериментов с использованием приматов ограничивают применение этой модели в исследовании эндометриоза, поэтому в основном экспериментальные модели эндометриоза разрабатываются на мелких лабораторных животных, чаще всего на грызунах. Такие модели разделяют на два типа: гомологичные и гетерологичные в зависимости от происхождения прививаемой ткани.

Индуцирование заболевания

В гомологичной модели ткань эндометрия получают из матки животного и трансплантируют или диспергируют в брюшную полость иммунокомпетентных животных.

Первые аутологичные трансплантации матки были проведены у кроликов [27], крыс [28] и хомяков [29]. Процедура включала удаление одного из маточных рогов при минилапаротомии. Маточную ткань разрезали на небольшие участки и подшивали в брюшную полость или вводили путем инокуляции (посева). Аналогичным образом были использованы сингенные мыши (syngenic — генетически сходные с тканью реципиента). У животных доноров удаляли оба рога матки; затем ткань измельчали и вновь вводили в брюшную полость животного реципиента [30]. Чтобы исключить какие-либо различия в стадиях эстрального цикла, животных (реципиент и донор) подвергали предварительной овариэктомии с последующим назначением эстрогена.

В 2006 г. T. Hirata и соавт. [31] усовершенствовали данную модель, придумав технологию «green fluorescent protein», что позволило оперативно выявить и количественно оценить размер и расположение эндометриоидных гетеротопий у мышей, экспрессирующих GFP (зеленый флюоресцентный белок) неинвазивным способом. Новая модель трансгенных мышей, экспрессирующих люциферазу, позволяет осуществить мониторинг ангиогенеза сосудов, окружающих очаг эндометрия, при пересадке нелюминесцентным мышам [32]. На хирургически индуцированной мышиной модели эндометриоза также было показано влияние ингибиторов TNFα на интенсивность флуоресценции и размер имплантов [33]. В аналогичной модели на хомяках ткань эндометрия вводили подкожно. Для изучения орошения имплантов после прижизненного введения красителя использовали камеру, помещаемую в подкожную складку [34].

В гетерологичной модели эксплантаты эндометрия человека прививают внутрибрюшинно или подкожно мышам с иммунодефицитом или иммуносупрессией.

Впервые человеческий эндометрий был успешно имплантирован гомозиготным «nude» мышам (бестимусная мышь с мутацией «nude», у которой с рождения отсутствует вилочковая железа, и поэтому в ее организме не вырабатываются Т-лимфоциты). Эндометрий выделяли как из менструальной крови, так и при биопсии, выполненной на разных стадиях менструального цикла. Биопсию эндометрия проводили у пациенток без эндометриоза, а также с наличием данного заболевания, перенесших лапароскопию, или путем взятия проб непосредственно из полости матки от пациенток, перенесших гистерэктомию. Образцы эктопического эндометрия также получали из эндометриом яичников [35]. Трансплантацию тканей человека в организм мыши осуществляли при минилапаротомии [36], подкожно или путем инъекции в брюшную полость [37].

Показано, что для успешной трансплантации тканей имеет значение множество факторов. Так, для роста эндометрия в пределах брюшной полости необходим как эндометриальный эпителий, так и стромальная ткань. N. Zamah и соавт. [35] также установили, что одна суспензированная клетка эндометрия человека не может вызвать рост эктопического эндометрия у «nude» мышей, для этого необходимы фрагменты всей матки. Они также обнаружили, что ткани из эндометриом сохраняются дольше, чем эутопический пролиферативный эндометрий, по-видимому, предполагая, что эктопический эндометрий структурно отличается от нормального эндометрия. Кроме того, было показано, что предварительное гормональное лечение трансплантированных клеток может повлиять на вызываемые поражения. A. Beliard и соавт. [38] сообщили, что до инъекции в брюшную полость «nude» мышей клетки человеческого эндометрия предварительно подвергали обработке эстрогеном или комбинации эстрогена с прогестином, но не одним прогестином. В результате эндометриоидные поражения развивались у более высокого процента животных. При этом назначение гормонов животным-реципиентам не оказало никакого влияния.

В работе C. Korbel и соавт. [39] подчеркивалась важность размеров и пространственной ориентации имплантов, фиксированных к брюшине для роста и формирования кисты.

На модели грызунов также было изучено влияние стадии менструального цикла во время биопсии тканей из организма человека [36]. Клетки, полученные из менструальной крови, из пролиферативного, а также секреторного эндометрия обрабатывали эстрогеном и прогестероном, а затем переносили в организм «nude» мышей. Эктопическая ткань эндометрия, по морфологическим признакам соответствующая пролиферативной фазе, формировалась в большинстве случаев независимо от стадии менструального цикла, в которой трансплантаты были собраны. Эти результаты предполагают, что на модели грызунов стадия цикла донорского эндометрия не является важным фактором, влияющим на формирование эктопических очагов.

Использование моделей для изучения патологических механизмов и эффективности лекарств

Создание моделей эндометриоза на грызунах способствовало оптимизации изучения патофизиологических механизмов заболевания. Так, исследование in vivo механизмов, участвующих в прикреплении клеток эндометрия и ранней эволюции поражений, стало возможным путем изучения морфологии трансплантированной ткани в различные промежутки времени.

M. Nisolle и соавт. [40] использовали мышей «nude» для оценки способности к прогрессированию человеческого менструального эндометрия, пересаженного в брюшную полость при минилапаротомии путем биопсии образцов в 1, 3 и 5-й дни после операции. Уже в 1-й день стромальные клетки были замечены прикрепленными к мезотелию, а на 3-й день наблюдались первые признаки реорганизации эпителиальных и стромальных клеток в эндометриальные железы. На 5-й день были отмечены кистозные эндометриоидные очаги, которые по сравнению с трансплантатами, удаленными в 1-й и на 3-й дни после операции, показали большую пролиферативную активность железистых клеток и увеличение уровня сосудистого эндотелиального фактора роста в стромальных клетках. Эти результаты показывают, что стромальные клетки участвуют в процессе прикрепления, а железистые клетки в росте очага поражения.

В последнее время активно обсуждается важная роль ангиогенеза в прогрессировании эндометриоза. Получить экспериментальные доказательства этого, а также провести оценку антиангиогенной терапии можно с помощью как гомологичных, так и гетерологичных моделей на грызунах. В рамках настоящего обзора рассматривать преимущества каждой модели не представляется возможным. Их детальный анализ был проведен в 2013 г. A. Edwards и соавт. [41].

Нет сомнений, что иммунные факторы играют важную, возможно, и ключевую роль в патогенезе эндометриоза. В гомологичных моделях иммунная система животных функционирует нормально, поэтому такие модели хорошо подходят для изучения влияния иммуномодулирующих и противовоспалительных препаратов на эндометриоз. Так, в результате лечения ИЛ-12 имплантированных эндометриальных тканей на мышиной модели было высказано предположение, что ИЛ-12 подавляет развитие эндометриоидных очагов через активацию NK-клеток [42].

На модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс изучают новые подходы к терапии эндометриоза. Так, были изучены ингибиторы ароматазной активности в сравнении с мелатонином. Показано, что мелатонин вызывал более выраженный регресс гетеротопий по сравнению с летрозолом, а также снижал частоту рецидивов после прекращения лечения [43]. Однако механизм его действия неизвестен и доказательной клинической базы тоже нет.

На гетерологичной мышиной модели эндометриоза при внутрибрюшинной пересадке человеческого эндометрия было показано влияние прогестинов на внеклеточный матрикс и ангиогенные факторы [44].

Оценка моделей эндометриоза на грызунах

Несмотря на то что использование животных, не относящихся к отряду приматов, является более предпочтительным с точки зрения их относительной дешевизны и способности формировать эндометриоидные поражения, воспроизводимые на них модели имеют определенные ограничения. Большое количество экспериментальных методик различается даже в рамках этих моделей и, очевидно, широкое филогенетическое различие между не приматами и человеком делает сравнение довольно сложным. «Nude» мыши могут выступать в качестве реципиентов человеческой ткани; впрочем, не исключено, что аплазия тимуса может косвенно влиять на факторы роста и цитокины в перитонеальной жидкости. Возникают также вопросы о том, содержит ли перитонеальная среда грызунов все паракринные раздражители, необходимые для неоангиогенеза. Детальный иммуногистохимический анализ этих моделей не проводился, поэтому степень репрезентативности моделей грызунов для человека до сих пор неизвестна [45].

За последние годы множество новых фармацевтических препаратов для терапии эндометриоза проходило доклинические испытания на моделях животных, и лишь некоторые из них были допущены до клинических испытаний. При этом ни один новый препарат так и не был внедрен в клиническую практику. По мнению экспертов [4, 46], анализирующих систематические обзоры, основные проблемы возникают в результате использования неадекватных моделей животных, а также отсутствия стандартизации в дизайне и интерпретации результатов, полученных в доклинических испытаниях.

Тем не менее модели животных имеют неоценимое значение в изучении эндометриоза. С их помощью решаются практические проблемы, связанные с изучением заболевания у женщин. Анализ информации, полученной во время экспериментов на модельных животных, привел к более глубокому пониманию распространенности заболевания, патогенеза и его связи с бесплодием. Несмотря на то что многие вопросы все еще остаются открытыми, есть надежда, что модели животных помогут на них ответить. Эти ответы в перспективе должны привести к лучшей диагностике заболевания и стратегии его лечения.

Конфликт интересов отсутствует.