Улучшение качества питательных сред для ЭКО является актуальной задачей, несмотря на многолетний опыт их производства в мире. Наиболее ответственным этапом в этой процедуре является развитие эмбриона от стадии оплодотворения до бластоцисты, для которой используются пролиферативные среды, многокомпонентные смеси сложного состава. В литературе [1-3] нет единого мнения о необходимости витаминов для ранних эмбрионов. Многие среды для ЭКО, состав которых известен, не содержат витамины, в то время как в некоторых из них витамины добавлены. Кроме того, композиции витаминов в средах для ЭКО отличаются от классических сред.

Одним из витаминов, точнее, витаминоподобных молекул, является инозитол, давно используемый в репродуктивной медицине. Инозитол - молекула шестиатомного спирта циклогексана относится к классу углеводов, однако выполняет различные функции, не свойственные углеводам. Миоинозитол (МИ) является одним из 6 стереоизомеров инозитола и выполняет функцию вторичного мессенджера в клетках. МИ и его производные регулируют уровень внутриклеточного Ca²⁺ [4], осуществляют передачу сигнала от инсулинового рецептора внутрь клеток, участвуют в передаче сигналов от фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов. Производные М.И., такие как инозитолтрифосфат, регулируют уровень внутриклеточного Ca²⁺.

Многочисленные данные указывают на положительное действие от добавления МИ в питательные среды на развитие эмбрионов у некоторых млекопитающих. В экспериментах на сельскохозяйственных животных (кролики, крупный рогатый скот) показано позитивное влияние МИ на ускоренное образование бластоцист, увеличение процента их хэтчинга и степени экспандированности бластоцист [5, 6]. Позитивный эффект МИ обнаруживается разными авторами в широком диапазоне его концентраций в питательной среде, что указывает на необходимость получения точных данных о его оптимальной концентрации. Поэтому задачей настоящей работы являлась оценка эффектов действия МИ на культивирование эмбрионов мыши как широко используемой модели для культивирования эмбрионов человека.

Лабораторные животные

В экспериментальной работе использовались мыши CBA/C57BL6, которые содержались в стандартных клетках с неограниченным доступом к воде и пище. В лабораторной комнате вивария поддерживалась комнатная температура (24±1 °C) и отношение светлого к темному времени суток 12/12. В качестве опытных объектов использовались самки 4-недельного возраста, массой 12-16 г. Все экспериментальные процедуры соответствовали стандартам GLP. Протокол исследования соответствовал этическим принципам и нормам проведения биомедицинских исследований с участием животных (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77).

Культуральные среды

Работа выполнялась с использованием сред для ЭКО ПРО и ЭКО 1 (НПП «ПанЭко»). Для последовательного культивирования применяли среды ЭКО ПРО «Дробление» и «Бластная». Для выделения ооцитов использовали среду ЭКО 1 «Аспирационная», для разрыхления кумулюса и денудации яйцеклеток - ЭКО 1 «Гиаза» и ЭКО 1 «Ооклин» для отмывки денудированных яйцеклеток. Все образцы сред не содержали МИ.

Выделение зигот и культивирование эмбрионов

Подготовка самок мышей проводилась по протоколу стимулирования суперовуляции [7]. Суперовуляция была индуцирована внутрибрюшинными инъекциями гормонов, первая инъекция - 5 МЕ препарата Фоллигон (Интерверт Интернешнл Б.В., Боксмеер, Нидерланды), вторая инъекция (спустя 48 ч) - 5 МЕ хорионического гонадотропина (ФГУП «Московский эндокринный завод»). Затем стимулированных самок подсаживали к самцам линии CBA на ночь и в опыт отбирали животных по наличию копулятивных пробок.

Спустя 13-15 ч извлекали яйцевод и вскрывали ампулы яйцевода в среде ЭКО 1 «Аспирационная», в которой собирали ооцит-кумулюсные комплексы. Данный комплекс обрабатывали ферментативной средой ЭКО 1 «Гиаза» и проводили отмывку ооцитов в среде ЭКО 1 «Ооклин». Очищенные от клеток кумулюса ооциты помещали в каплю среды ЭКО ПРО «Дробление», покрытую жидким парафиновым маслом, и культивировали при 37 °C с содержанием в воздухе 5% СО₂. Подсчет клеток производили каждые сутки, до достижения эмбрионами стадии бластоцисты (около 96 ч после извлечения). В качестве контроля использовали среду без МИ, в опытных точках добавляли МИ в концентрации от 10 до 35 мг/л. Если опыт происходил со сменой среды, то ее производили через 48 ч после посадки, путем пересадки эмбрионов в каплю с новой средой.

Подсчет количества бластомеров производили ежедневно, с 1-го по 5-й день культивирования. Также подсчитывали количество образовавшихся бластоцист и оценивали процент хэтчинга в контрольной и опытных средах. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента. Две выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям при р<0,05.

Оптимизация ростовых свойств пролиферативных сред для ЭКО касается всех компонентов этих сред и требует анализа состава и концентрации витаминов в среде. Проведено сравнение ростовых свойств пролиферативной среды ЭКО ПРО «Дробление», включающей состав витаминов, соответствующий основным классическим питательным средам: DMEM, F-10, RPMI-1640, среда 199. Обнаружено, что витаминный состав среды RPMI-1640 существенно улучшает питательные свойства среды по сравнению с добавками витаминов других тестированных сред (табл. 1).

Последовательный анализ всех витаминов, входящих в состав среды RPMI-1640, обнаружил, что основной вклад в увеличение выхода мышиных бластоцист в питательных средах связан с повышением концентрации МИ.

Для анализа действия МИ на мышиные преимплантационные эмбрионы проводили параллельное культивирование в среде с МИ и в контрольной - без М.И. После оплодотворения выделяли ооцит-кумулюсные комплексы, проводили денудацию ооцитов и помещали их в среду для культивирования. Разделение на оплодотворенные и неоплодотворенные ооциты не проводилось, чтобы избежать длительной инкубации эмбрионов на воздухе с малым количеством CO₂. В дальнейшем опыте производили подсчет тех эмбрионов, которые через сутки инкубации (6% CO₂, 37 °C) делились до двух бластомеров, и их принимали за 100% оплодотворенных ооцитов.

После суток культивирования зиготы, развивающиеся в двух разных условиях, не проявили значительных различий. Сравнение деления клеток в контрольной и опытной средах на 2-е сутки культивирования не выявило различий. При этом около 25% эмбрионов в среде с МИ достигло 8-клеточной стадии, в контрольной среде - лишь 10%. В контрольных средах без МИ на 5-й день культивирования выход бластоцист составил 62±3% (23 из 37 клеток). В опытных средах сравнивали присутствие МИ в одной из них или в обеих сразу (рис. 1). При добавлении МИ в первую среду - ЭКО ПРО «Дробление» наблюдалось увеличение выхода бластоцист до 77±2,2% (р<0,05) (30 из 39 клеток). При добавлении МИ во вторую среду - ЭКО ПРО «Бластная» процент выхода бластоцист - 67±3,2% (18 из 27 клеток) практически не отличался от контроля. Присутствие М.И. в обеих средах дает самый высокий выход бластоцист - 85±2,8% (23 из 27 клеток) в сравнении с другими опытами (p<0,05) (см. рис. 1).

При оценке качества эмбрионов на 5-й день культивирования можно заключить, что большинство бластоцист в среде с МИ относится к классу АА, размером 1-2 [8]. Частичная фрагментация бластоцист наблюдалась лишь в контрольной среде - без МИ. В целом при наблюдении за развитием мышиных эмбрионов в среде с МИ очевидно ускоренное развитие и клетки хорошего качества. Растет выживаемость клеток, количество экспандированных бластоцист.

Дополнительным наблюдением и показателем качества бластоцист являлся естественный хэтчинг - разрыв блестящей оболочки и выход эмбриона из нее. При успешном хэтчинге вероятность имплантации эмбриона в стенку матки значительно возрастает. В опыте с добавлением МИ в среду хэтчинг наблюдался на 5-й день культивирования: в контроле 78±3,1% от всех бластоцист (18 из 23), в среде с МИ - 91±2,2% (21 из 23) (р<0,05). В условиях in vitro блестящая оболочка эмбриона может утолщаться, и разрыва (хэтчинга) не происходит. Сравнивая контрольную и опытную среды, можно наблюдать, что в среде с МИ процент бластоцист, приступивших к естественному хэтчингу, больше, чем в среде без МИ (рис. 2). На рис. 2 видно, что в контроле хэтчинг присутствует, однако он не проходит до конца, оставаясь на стадии выклева бластоцисты, что говорит об утолщении блестящей оболочки. Следовательно, присутствие МИ оказывает положительное действие на всех стадиях развития эмбриона.

При исследовании влияния различных концентраций на выход бластоцист были проведены эксперименты с концентрациями МИ 10, 15, 25 и 35 мг/л. Результаты типичного эксперимента представлены в табл. 2. Полученные данные показывают, что оптимальная концентрация МИ в среде ЭКО ПРО «Дробление» совпала с оптимальной концентрацией в среде ЭКО ПРО «Бластная» и составляет 25 мг/л М.И. При уменьшении концентрации до 15 и 10 мг/л выход бластоцист значительно снижается. Видно, что присутствие МИ на первых стадиях развития эмбриона - первое и второе деление - положительно влияет на образование бластоцист в дальнейшем. Более того, присутствие МИ в среде ЭКО ПРО «Дробление» увеличивает скорость развития эмбрионов. Если в среде присутствует МИ, то спустя 48 ч число бластомеров составляет 6-8, что опережает среднее количество бластомеров на 2-е сутки культивирования, которое обычно составляет 4 бластомера. При сравнении с добавлением МИ на поздних стадиях выход бластоцист снижался, но тем не менее был выше контрольного значения.

Развитие эмбриона in vitro является важным этапом процедуры ЭКО. Обеспечение успешности этой процедуры во многом зависит от состава сред, в которых происходит развитие эмбриона. Питательные среды для ЭКО представляют собой сложные смеси различных веществ, в том числе и витаминов. Состав витаминов питательных сред широко варьирует у различных производителей, что указывает на необходимость оптимизации их концентраций. Ранее нами было показано положительное влияние витаминов на выход мышиных бластоцист при использовании набора витаминов среды F-10 [9]. Однако основной наблюдавшийся эффект был связан с антиоксидантным действием аскорбиновой кислоты. Более подробный анализ эффектов витаминов, проведенный в настоящей работе, выявил существенный позитивный вклад МИ в скорость развития мышиных эмбрионов и выход бластоцист на 4-е сутки развития.

В организме человека МИ выполняет функцию вторичного мессенджера, так как содержит гидроксильные группы, способные присоединять остатки фосфорной кислоты. Также, взаимодействуя с ионами кальция и магния, МИ осуществляет передачу сигнала от инсулинового рецептора внутрь клеток, регулируя таким образом адсорбцию клеткой глюкозы [10]. МИ играет важную роль и в репродуктивной системе, участвуя в передаче сигналов от ФСГ и Л.Г. Поэтому изомер МИ, D-хироинозитол, используется в качестве средства для терапии синдрома поликистозных яичников. Недавно в качестве препарата в комбинации с фолиевой кислотой был использован МИ, который показал положительные результаты в доклинических и клинических испытаниях [11]. МИ оказывает воздействие на функционирование сперматозоидов, регулируя осмолярность и объем семенной плазмы, а также подвижность сперматозоидов [12].

Молекула МИ является предшественником одного из широко распространенных вторичных мессенджеров - фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PIP3). Последний является регулятором каскада, который приводит к выбросу кальция в цитозоль из ретикулума. Ион Ca²⁺ играет важную роль в развитии преимплантационных эмбрионов на стадии как деления, так и формирования бластоцели. Значит для нормального развития необходима определенная концентрация МИ во внешней среде в качестве субстрата для синтеза PIP3. Также известно, что МИ и его производные необходимы для осуществления эффектов гонадотропина, ЛГ и ФСГ, тем самым оказывая влияние на функционирование репродуктивной системы и фертильность.

В эксперименте T. Chiu и соавт. [13] рассматривали созревание ооцитов in vitro в среде с 30 ммоль/л МИ, что соответствует 5,4 г/л, на дальнейшее развитие. Присутствие инозитола положительно действует на развитие яйцеклеток, ускоряя дезинтеграцию ядерной оболочки ооцита и наступление первого (мейотического) деления. Предполагается, что это действие достигается путем изменения концентрации Ca²⁺, выхода его из ретикулума в цитозоль и запуска сигнальных каскадов. Авторы исследования рекомендуют МИ в качестве добавки для среды, в которой происходит созревание ооцитов.

Ранее было показано, что МИ оказывает положительное влияние на развитие эмбрионов у ряда видов млекопитающих. Например, эксперименты на сельскохозяйственных видах (кролики, крупный рогатый скот) показывают позитивное влияние МИ на эмбрионы. Добавление М.И. в питательную среду увеличивает образование бластоцист, процент хэтчинга и качество бластоцист [5, 14]. Влияние М.И. на развивающиеся преимплантационные эмбрионы подтверждено также в работе S. Colazingari и соавт. [15]. В течение 4 дней эмбрионы мышей после процедуры ИКСИ культивировались в присутствии М.И. Кроме подсчета количества клеток бластоцист с помощью инвертированного микроскопа, использовался метод флюоресцентной окраски для подсчета бластомеров. Показано, что присутствие в среде МИ в концентрации 10 ммоль/л (1,8 г/л) увеличивает выход бластоцист на 30%, а также положительно влияет на качество бластоцист, увеличивает пролиферативную активность и ускоряет развитие эмбрионов. Авторы связывают действие МИ с запуском фосфорилирования протеинкиназы B (PKB/Akt), вызывающего активацию этого фермента. PKB/Akt усиливает пролиферативную активность клеток эмбриона, тем самым увеличивая количество бластомеров и их размер [15].

В выполненной нами работе действие МИ на развитие эмбрионов мыши оценивали при значительно более низких концентрациях (до 35 мг/л). Этот диапазон ближе к физиологическим величинам данного витамина и соответствует его концентрации в классических питательных средах. Поэтому исходя из положительного эффекта от добавления МИ в концентрации 25 мг/л можно полагать, что данная концентрация является оптимальной для развития ранних эмбрионов и может быть использована и для культивирования эмбрионов человека.

Конфликт интересов отсутствует.