Одной из составляющих патогенеза эндометриоза, несомненно, является состояние эутопического эндометрия, что подтверждается в руководстве ESHRE от 2014 г. [13], оценка которого осуществляется с использованием системы «омикс» (omics) [2, 10]. Среди причин изменения свойств эндометрия при эндометриозе и бесплодии отмечаются нарушения экспрессии генов и белков, участвующих в имплантации бластоцисты во время «окна имплантации» [9, 12, 22].

В 2015 г. [4] проведено сравнительное исследование у женщин с 1—2-й стадией перитонеальной формы эндометриоза и вторичным бесплодием по отношению к контролю. Больным с эндометриозом было выполнено хирургическое лечение с последующим назначением аналогов ГнРГ, после чего у них в течение 12 мес осуществлялась регистрация наступления беременности. Показано снижение экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130 и SOCS1 в эутопическом эндометрии больных с ненаступившей беременностью. Кроме того, у этих больных в сыворотке крови выявлено снижение содержания LIF и увеличение уровня IL-1α выше нормативных значений. Содержание в перитонеальной жидкости IL-1α и IL-6 было также выше в группе больных с ненаступившей беременностью. Показано, что определение содержания в сыворотке крови LIF менее 21,1 пг/мл и снижения экспрессии в поверхностном эпителии и в эпителии желез эндометрия LIF, LIF Rα, IL-1RI, gp130, SOCS1 может быть использовано для прогноза наступления беременности у больных с перитонеальной формой эндометриоза.

Для оценки специфичности полученных изменений при эндометриозе были проведены исследования по изучению влияния сигнального пути LIF/LIF-Rα/gp130/SOCS1 в эндометрии на наступление беременности после ЭКО/ИКСИ у больных с бесплодием трубного происхождения [5]. Показано, что при ненаступившей беременности по отношению к наступившей беременности наблюдается снижение содержания в крови LIF, sgp130, снижение экспрессии LIF, LIF-Rα, SOCS1 по данным иммуногистохимического исследования и отсутствие изменения уровня мРНК LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1. Установленные изменения, несомненно, могут влиять на рецептивность эндометрия и приводить к развитию субфертильности у больных с бесплодием трубного происхождения. Данные, полученные при определении содержания LIF в крови и экспрессии LIF, LIF-Rα, SOCS1 в поверхностном эпителии и эпителии желез эутопического эндометрия перед назначением лечения у больных с бесплодием трубного происхождения, могут служить дополнительными показателями в оценке фертильности и эффективности лечения.

Сопоставление фенотипических характеристик экспрессии [5] PGP9.5, ЭР, ЭР-α, ЭР-β, ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, IL6-Rα, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, L-Sel, MEKA-79 в эндометрии у больных с бесплодием трубного происхождения и больных с эндометриозом и бесплодием показало, что ненаступление беременности при бесплодии трубного происхождения по отношению к наступлению беременности характеризуется низкой экспрессией в эндометрии в периоде «окна имплантации»: ЭР-α, ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, MEKA-79 и высокой экспрессией L-Sel. В то же время случаи ненаступления беременности при бесплодии и эндометриозе по отношению к наступлению беременности характеризуются низкой экспрессией в эндометрии в периоде «окна имплантации»: ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, MEKA-79 и высокой экспрессией ЭР-α, PGP9.5, L-Sel. Следовательно, при бесплодии трубного происхождения отмечаются менее выраженные изменения в эндометрии в период «окна имплантации» по отношению к больным с перитонеальной формой эндометриоза.

Следовательно, было доказано, что более высокий процент наступления беременности у больных с бесплодием трубного происхождения по отношению к больным с эндометриозом объясняется именно этими различиями [8]. Различия и схожесть в изменениях сигнальных и, как следствие, метаболических путей в реализации функциональной активности эндометрия при бесплодии трубного происхождения и перитонеальной форме эндометриоза убедительно доказывают роль эндометриального фактора в развитии бесплодия.

Несмотря на достаточное понимание процессов, лежащих в основе бесплодия, на современном этапе и применение методов ЭКО/ИКСИ для достижения наступления беременности, возникает необходимость оценки фенотипических свойств эндометрия после проведения стандартизованного метода лечения и ответа на вопрос о возможности изменения фенотипических свойств эндометрия после лечения. К сожалению, в доступной нам литературе эти данные отсутствуют.

Цель исследования — у женщин с перитонеальной формой эндометриоза изучить экспрессию в эутопическом эндометрии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 и содержание в крови LIF, sLIF-R, sgp130 в период «окна имплантации» до проведения хирургического и гормонального лечения и спустя 3 мес после его окончания. Провести анализ полученных данных в зависимости от наступления беременности в спонтанном цикле в течение 6 мес после комплексной терапии.

Под наблюдением находились 65 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза, диагностированного во время проведения лапароскопии, и бесплодием. Подбор и рандомизация больных осуществлялись совместно с д.м.н. Т.Е. Самойловой, к.м.н. М.А. Шороховой и д.м.н. Е.Д. Дубинской. Клиническая характеристика больных была представлена нами ранее [6, 7]. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Информированное согласие на участие больных в исследовании было получено у всех пациенток. Экспериментальные исследования проведены В.А. Бурлевым и Н.А. Ильясовой.

Критерии включения в исследование: женщины репродуктивного возраста (от 27 до 37 лет); перитонеальная форма эндометриоза 1—2-й стадии, согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины [21], бесплодие, отсутствие приема других гормональных препаратов для лечения наружного генитального эндометриоза на протяжении 3 мес перед началом исследования. Клинические проявления наружного генитального эндометриоза: нарушение менструальной функции (мено- и метроррагии), боли в нижних отделах живота и поясничной области различной интенсивности, диспареуния, бесплодие.

Критерии исключения: возраст пациентки старше 37 лет, наружный генитальный эндометриоз 4-й стадии, аллергические реакции на гозерелина ацетат, беременность, лактация, средняя и тяжелая экстрагенитальная патология.

Всем пациенткам были выполнены оперативные вмешательства путем лапароскопии с использованием оборудования фирмы «Karl Stors» (Германия): иссечение и/или коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, разделение спаек в области малого таза, сальпингоовариолизис. В процессе операции с целью исключения внутриматочной патологии производилась жидкостная гистероскопия с помощью жесткого гистероскопа с микрогистероскопической насадкой и наружным диаметром 88 мм («Karl Stors», Германия), а также диагностическое выскабливание слизистой матки.

Согласно дизайну исследования, для проведения консервативной терапии после лапароскопии больные получали в послеоперационном периоде курс терапии аналогом ГнРГ (гозерелина ацетат) по 3,6 мг ежемесячно, подкожно в течение 3 мес, интервал между введением препарата составлял 28—30 дней. По окончании консервативного лечения больные наблюдались в течение 6 мес. За этот период у 28 женщин наступила беременность, а у 37 беременность не наступила. Наступление беременности наблюдалось в нормальных овуляторных циклах, без индукции овуляции или применения методов ВРТ.

Контрольную группу составили 20 пациенток, которым производилась стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз в этой группе исключался после тщательного исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов. Ультразвуковое и гистероскопическое исследования матки позволили исключить у пациенток этой группы наличие аденомиоза.

Ультразвуковое исследование органов малого таза у больных проводилось до оперативного лечения и после окончания курса терапии с помощью аппарата Aloka SSD-2000 с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц.

Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром до операции. Перитонеальную жидкость получали в ходе выполнения лапароскопии из брюшной полости области малого таза без примесей крови. Образцы сыворотки и перитонеальной жидкости хранились при –70 °С до момента исследования. Все образцы биопсии эндометрия были получены в LH+7 (±2), исходя из ежемесячной оценки фазы менструального цикла и дня менструального цикла взятия образцов эндометрия, согласно стандартным критериям [18]. Первую биопсию эндометрия у 65 больных (см. схему) проводили до хирургического и гормонального лечения, вторую биопсию эндометрия осуществляли методом пайпель-биопсии с последующим патоморфологическим анализом для лабораторного контроля и верификации исходов хирургического и гормонального лечения у 24 больных спустя 3 мес после хирургического и гормонального лечения.

Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимическое окрашивание для LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 было выполнено в стандартных условиях, как описано нами ранее [9, 15, 16]. Использовались следующие первичные антитела: мышиные моноклональные античеловеческие антитела к LIF, ослиные поликлональные античеловеческие антитела к LIF-Rα, ослиные поликлональные античеловеческие антитела к gp130, ослиные поликлональные античеловеческие антитела к SOCS1. Все моноклональные или поликлональные антитела имели класс IgG1. Соответствующий класс иммуноглобулина использовался как отрицательный контроль. Вторичные антитела: биотинизированные лошадиные антимышиные, лошадиные антиослиные, ослиные антикроличьи [16].

Оценка экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 и соответствующее распределение по клеточным элементам выполнены при использовании полуколичественной системы гистологической шкалы (SCORE) [17]: интенсивность окрашивания от 0 (слабое окрашивание) до 3 (самое интенсивное окрашивание).

Анализ сыворотки крови и перитонеальной жидкости. Определение в сыворотке крови концентрации LIF, sLIFR, sgp130 и в перитонеальной жидкости содержания IL-1α и IL-6 проводилось с использованием стандартных реагентов в соответствии с рекомендациями производителя: QuantikineRHuman LIF (DLF00; R&D Systems), sLIFR Platinum ELISAs (BMS246; eBioscienceR, Inc., Сан Диего, СА, США) and QuantikineRHuman sgp130 (DGP00; R&D Systems), QuantikineRHuman IL-1α и IL-6 Immunoassays (DLA50 and D6050; R&D Systems).

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics v.20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Дизайн исследования и характеристика больных

Учитывая высокую вариабельность социального статуса включенных в исследование больных с эндометриозом и изменение социального поведения на этапах наблюдения и лечения, был разработан специальный дизайн (см. схему). Всего в исследование были включены 65 больных с перитонеальной формой эндометриоза в соответствии с критериями включения и исключения. Всем больным перед оперативным лечением был проведен первый забор крови для лабораторных исследований. В ходе хирургической операции было выполнено раздельное диагностическое выскабливание полости матки и получены образцы первой биопсии эндометрия и перитонеальная жидкость. После хирургического лечения больным назначали гозерелина ацетат в течение 3 мес. По окончании гормонального лечения все больные в зависимости от желания женщины или ее социального статуса были разделены на две группы: включенные в исследование для проведения второй биопсии (24 больные) и не включенные в исследование для проведения второй биопсии (41 больная).

Женщины, включенные в группу второй биопсии, ожидали нормализации менструального цикла и предохранялись от наступления беременности барьерным методом в течение 3 мес. По окончании срока ожидания им была проведена пайпель-биопсия с последующим патоморфологическим анализом для лабораторного контроля и верификации исходов хирургического и гормонального лечения и забор крови для лабораторного контроля. После этого они наблюдались в течение 6 мес для диагностики наступления беременности. Из 24 женщин этой группы у 10 (41,7%) наступила беременность, у 14 (58,3%) беременность не наступила.

Женщины, не включенные в группу второй биопсии (41 больная), по окончании гормональной терапии наблюдались в течение 6 мес для диагностики наступления беременности. У 18 (43,9%) беременность наступила, у 23 (56,1%) — не наступила.

Сравнение случаев наступления или ненаступления беременности у больных двух групп показало отсутствие статистически значимых различий (41,7% против 43,9% и 58,3% против 56,1% соответственно). Полученные результаты позволили провести клинический анализ групп и экспериментальные исследования.

Результаты клинического наблюдения и характеристика больных представлены в табл. 1. Как следует из данных табл. 1, средний возраст больных в группах, частота жалоб на хроническую тазовую боль, среднее количество женщин с дисменореей, диспареунией не имели статистически значимых различий и соответствовали ранее представленным результатам [3, 7].

Сравнение содержания в крови LIF, sLIF-R, sgp130 у больных группы первой биопсии с наступившей и ненаступившей беременностью показало статистически значимое снижение содержания LIF и sgp130 в случаях ненаступления беременности, как и снижение этого показателя по отношению к норме (табл. 2). Для sLIF-R статистически значимых изменений не отмечено. В группе второй биопсии, т. е. у больных после хирургического и гормонального лечения, наблюдались аналогичные изменения, но статистически значимых различий в зависимости от наступления или ненаступления беременности по отношению к группе первой биопсии не установлено. Следовательно, комплексное лечение не оказывает воздействия на изменение содержания LIF и sgp130 в крови и зависит от наступления беременности.

Как следует из данных табл. 3, содержание sIL-1α и sIL-6 в перитонеальной жидкости у женщин с ненаступившей беременностью статистически значимо выше по отношению к больным с наступившей беременностью и группе контроля. Уровень sIL-1α в перитонеальной жидкости у больных с эндометриозом и наступившей беременностью был статистически значимо выше по отношению к контролю, в то время как увеличение содержания sIL-6 не было статистически значимым.

Экспрессия в эутопическом эндометрии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 выявляется в поверхностном эпителии и в эпителии желез в контроле, у больных с эндометриозом с наступившей или ненаступившей беременностью (табл. 4). Нами не представлены данные об экспрессии этих показателей в клетках стромы эндометрия, так как они были низкими и статистически незначимыми.

Полученные данные свидетельствуют о том, что между аналогичными показателями у женщин с эндометриозом и бесплодием с наступившей беременностью до и после лечения по отношению к норме отсутствуют статистически значимые различия. В то же время минимальные и статистически достоверные значения экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 наблюдаются в поверхностном эпителии эутопического эндометрия и в эпителии желез у больных с эндометриозом и ненаступившей беременностью по отношению к больным с наступившей беременностью и норме. Это проявляется как при первой биопсии до лечения, так и при второй биопсии после проведенного лечения.

Следовательно, у больных с эндометриозом и ненаступившей беременностью по отношению к больным с наступившей беременностью и нормативным значениям наблюдается снижение экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в поверхностном эпителии и эпителии желез эутопического эндометрия в середину секреторной фазы менструального цикла как до лечения, так и после лечения.

Оценке состояния эутопического эндометрия при эндометриозе в настоящее время в литературе уделяется особое внимание [1]. Это касается поиска как маркеров диагностики эндометриоза, так и предикторов бесплодия при данном заболевании [13]. Учитывая, что процессы, лежащие в основе бесплодия, на современном этапе достаточно изучены, возникает необходимость оценки влияния терапии после проведения стандартизованного метода лечения. Несомненно, что этот вопрос тесно связан с возможностью изменения фенотипических свойств эндометрия под действием лечения. В доступной нам литературе эти данные отсутствуют, за исключением нашей работы, опубликованной в 2015 г. [16].

В проведенном исследовании у женщин с перитонеальной формой эндометриоза изучена экспрессия LIF, sgp130, SOCS1 в эутопическом эндометрии и содержание в крови LIF, sLIF-R, sgp130 в период «окна имплантации» до хирургического и гормонального лечения и спустя 3 мес после его окончания. В последующем был проведен анализ полученных данных в зависимости от наступления беременности в спонтанном цикле в течение 6 мес после комплексной терапии.

Результаты проведенного исследования показали, что содержание в крови LIF, sgp130, SOCS1 после лечения не меняется и сохраняет свои значения у женщин как с наступившей, так и ненаступившей беременностью. Если до лечения эти показатели были снижены при ненаступившей беременности по отношению к наступившей беременности и к норме, то после лечения они сохраняют те же значения и статистически значимо не изменяются. При наступившей беременности показатели соответствуют нормативным значениям и сохраняют значение после лечения без статистически незначимых изменений.

В ткани эутопического эндометрия экспрессия LIF, gp130, LIF-Rα, SOCS1 была статистически значимо снижена в поверхностном эпителии и в эпителии желез у женщин с ненаступившей беременностью по отношению к наступившей беременности и к норме как до комплексного лечения, так и после него. У больных с перитонеальной формой эндометриоза и наступившей беременностью изученные показатели в эндометрии статистически значимо не отличались от нормы как до лечения, так и после него.

Полученные данные свидетельствуют о том, что лечение с включением хирургического и гормонального методов не оказывает влияния на фенотипическую характеристику эндометрия. Эти свойства эутопического эндометрия не изменяются под действием лечения и связаны только с тканевыми фенотипическими особенностями.

Несомненным является и тот факт, что процесс лечения может оказывать воздействие на функциональную активность яичников, что может влиять на случаи наступления беременности. Однако нами не отмечено статистически значимых различий между группами первой и второй биопсии по случаям наступления или ненаступления беременности, что указывает на одинаковый уровень такого возможного воздействия в группах.

Pro et contra. В течение 2010—2015 гг. нами проведены исследования по поиску молекулярных предикторов наступления или ненаступления беременности у больных с перитонеальной формой эндометриоза [3—5, 15, 16]. Полученные данные касались оценки наступления или ненаступления беременности только с учетом результатов до лечения и не были связаны с результатами после лечения. Анализ общей совокупности данных касался 18 эутопических эндометриальных иммуногистохимических предикторов: alphaB-crystallin, ПМС, СЭФР-A, СЭФР Р1, PGP9.5, ЭР, ЭР-α, ЭР-β, ПР-А+В, ПР-В, IL-1RI, IL6-Rα, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, L-Sel, MEKA-79. Статистически значимые результаты в эндометрии были получены в отношении 12 (66,6%) из них: alphaB-crystallin, ПМС, PGP9.5, ЭР-α, ПР-А+В, ПР-В, LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1, L-Sel, MEKA-79. Можно ли считать эти результаты значимыми без учета их изменений после лечения и является ли лечение патогенетическим для изменения соответствующих показателей после лечения?

Для ответа на этот вопрос и было проведено настоящее исследование по изучению изменений экспрессии LIF, gp130, LIF-Rα, SOCS1 в эндометрии после лечения как предикторов наступления беременности. Установлено, что эти предикторы не изменяют свой уровень значения после лечения: если эти показатели были снижены до лечения, то они снижены после лечения в случае ненаступления беременности и если они соответствуют нормативным значениям в случае наступления беременности, то они также не изменяются после лечения.

Исходя из полученных данных, следует, что LIF, gp130, LIF-Rα, SOCS1 действительно отражают предикцию наступления беременности и не являются патогенетически значимыми для стандартной, традиционной и использованной в работе терапии перитонеальной формы эндометриоза. К сожалению, в мировой литературе нет ответа на это утверждение. Опубликованная нами в 2015 г. работа [16] существенно меняет акценты оценки эффективности лечения перитонеальной формы эндометриоза и бесплодия у женщин. Этой статьей мы хотели раскрыть и обозначить вектор поиска новых и патогенетически значимых методов лечения, так как суммированные данные по эффективности лечения эндометриоза показали отсутствие таковых [11, 14, 19, 20, 23].

Таким образом, проведено исследование по изучению экспрессии LIF, gp130, LIF-Rα, SOCS1 в эутопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза и бесплодием по отношению к контролю в зависимости от наступления или ненаступления беременности до и после лечения. Одновременно проводилась оценка содержания в крови LIF, sLIF-R, sgp130. Дизайн исследования был специально разработан, исходя из включения всех 65 больных для проведения первой биопсии до лечения и включения 24 больных в группу проведения второй биопсии после проведения лечения. Больным с эндометриозом было проведено хирургическое лечение с последующим назначением аналога ГнРГ, после этого у них в течение 6 мес осуществлялась регистрация наступления беременности. Показано снижение экспрессии LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 В эутопическом эндометрии у больных с ненаступившей беременностью до и после лечения. У этих больных в сыворотке крови наблюдалось снижение содержания LIF, gp130, SOCS1 как до, так и после лечения. При наступлении беременности экспрессия LIF, LIF-Rα, gp130 и SOCS1 соответствовала нормативным значениям как до, так и после лечения. Применение хирургического и гормонального (аналог ГнРГ) методов лечения перитонеальной формы эндометриоза не оказывает влияния на экспрессию LIF, LIF-Rα, gp130, SOCS1 в эутопическом эндометрии и содержание в крови LIF, gp130, SOCS1 после лечения. Отсутствие влияния лечения на наступление беременности соответствует данным литературы [11, 14, 19, 20, 23]. Возможность поиска обоснованных методов лечения эндометриоза может проводиться только на патогенетической основе.

Благодарности. Выражаем благодарность professor Matts Olovsson и medical doctor Christian Moberg, Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Уппсала, Швеция, за участие в обсуждениях и содействие. Мэру (кметъ) г. Поморие, Республика Болгария, Ивану Алексиеву за поддержку. Работа выполнена по теме «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами и фертильностью у женщин с и без эндометриоза» (номер регистрации Минобрнауки России в НТИМИ № 0465/03/10). Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (гранд № 8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова», Минздрава России и Минздравом России.

Конфликт интересов отсутствует.