Активные формы кислорода (ROS, или АФК), к которым относятся озон, перекись водорода Н2О2, гидроксильные (свободные) радикалы ОН^–, супероксидные радикалы О2^–, синглетные формы кислорода ¹О2, пергидроксильные ионы НО2^–, в небольших количествах необходимы для нормальной регуляции функции сперматозоидов. Например, АФК способствуют окислению ядерных белков, обеспечивая уплотнение ДНК; присутствие Н2О2 необходимо для протекания акросомальной реакции; действие низких концентраций Н2О2 (10 и 100 мкмоль) приводит к повышению подвижности сперматозоидов в разной степени в зависимости от концентрации перекиси [1].

Повышение уровня АФК приводит к развитию оксидативного стресса, который неизбежно влечет нарушение ряда важнейших биохимических процессов, а также функционирования мембранных структур сперматозоида, что в свою очередь может послужить толчком к развитию мужской инфертильности [2—5].

Сперматозоиды очень чувствительны к оксидативному стрессу, так как они транскрипционно неактивны и имеют минимальное количество цитоплазмы, содержащей недостаток антиоксидантов и ДНК-восстанавливающих систем [6]. Важные защитные функции от АФК и предупреждение развития оксидативного стресса обеспечиваются за счет антиоксидантов семенной плазмы. Система антиоксидантной защиты сперматозоидов представлена комплексом ферментных и неферментных биоантиоксидантов: супероксиддисмутазой, каталазой, глутатионпероксидазой, α-токоферолом (витамином Е), аскорбиновой кислотой (витамином С), убихинонами и др. [7].

Поэтому оксидативный стресс в эякуляторных сперматозоидах может быть вызван активацией синтеза АФК в комбинации с бедностью антиоксидантов в семенной плазме. Нарушение редокс-баланса может послужить причиной мужского бесплодия.

При подготовке спермы для ВРТ сперматозоиды отделяют от семенной плазмы, выделяя субпопуляцию с лучшей подвижностью и морфологическими характеристиками. Однако при этом сперматозоиды лишаются антиоксидантной защиты и становятся более подверженными оксидативному стрессу [8].

Одним из ответов клетки на стресс является активация суицидной программы — программированной гибели клетки — апоптоза. К самым ранним биохимическим изменениям, происходящим в апоптотической клетке, относится нарушение симметрии клеточной мембраны и экстернализация фосфолипида фосфатидилсерина (ФС) на клеточную поверхность, детектировать которую можно с помощью белка аннексина-V (AnV) [9]. Изменение в клеточной мембране в ходе апоптоза также включает повышение ее проницаемости для йодида пропидия (PI). Однако в динамике развития апоптоза потеря мембранной асимметрии соответствует начальным этапам апоптоза (ранний апоптоз) и предшествует потере проницаемости мембраны для PI. На этой стадии апоптотические клетки связывают AnV, но, как и живые клетки, непроницаемы для PI ((AnV+/PI–)-сперматозоиды) [10].

Для индукции оксидативного стресса обычно используют кратковременную (от 30 мин до 4 ч) обработку клеток низкими концентрациями Н2О2 (25—50 мкмоль) [11, 12]. Н2О2 может стимулировать гибель клеток по разному пути (апоптозу или некрозу) и эффект воздействия может зависеть от концентрации Н2О2 и функционального состояния клеток, а также от времени инкубации.

С целью изучения влияния на сперматозоиды оксидативного стресса, создаваемого АФК, как одного из факторов, вызывающего апоптоз половых клеток и приводящего к нарушению фертильности у мужчин, мы проводили инкубацию сперматозоидов с Н2О2. Представляло также интерес в рамках изучения антиоксидантной защиты клеток от оксидативного стресса перед Н2О2-индуцированным повреждением провести предварительную инкубацию сперматозоидов in vitro с аскорбиновой кислотой и α-токоферолом как по отдельности, так и в сочетании и оценить после этого изменение архитектоники клеточной мембраны — процесс экстернализации на поверхность половых клеток маркера апоптоза — ФС.

В исследовании приняли участие 18 фертильных мужчин, средний возраст которых составил 33,5±1,0 года и от которых было получено информативное согласие на проведение исследований. Сбор эякулятов проводился после 72 ч сексуального воздержания.

Измерение показателей стандартной спермограммы проводили в соответствии с рекомендациями и нормативами ВОЗ [13]. Жизнеспособность клеток составила 80%.

Для выявления признаков апоптоза — экстернализации ФС — применяли «аннексиновый» метод — окрашивание клеток AnV, конъюгированным с флюорохромом (AnV-FITC), и PI (Becton Dickinson), согласно инструкции изготовителя, с последующим исследованием мазков на флюоресцентном микроскопе под иммерсионным объективом ×100. В результате выявляли живые неокрашенные (AnV–/PI–)-сперматозоиды, живые сперматозоиды с признаками раннего апоптоза (AnV+/PI–) и нежизнеспособные мертвые клетки (AnV+/PI+) и (AnV–/PI+) [9].

Для индукции оксидативного стресса сперматозоиды (5·10⁶/мл) в течение 2 и 4 ч инкубировали с 25 и 200 мкмоль Н2О2 («Sigma»). Контролем служили сперматозоиды, инкубированные в течение того же времени в среде Menezo B-2 («BioMerieux», Франция) с 5% СО2 при 37 °C без добавлений Н2О2.

В качестве антиоксидантной защиты клеток от Н2О2-индуцированного оксидативного стресса сперматозоиды (5·10⁶/мл) были предварительно инкубированы в течение 2 и 4 ч с добавлением 300 и 600 мкмоль аскорбиновой кислоты («Sigma») или 40 и 60 мкмоль α-токоферола в форме водорастворимого аналога Trolox («Sigma»), а также с 300 мкмоль аскорбиновой кислоты + 40 мкмоль α-токоферола и 600 мкмоль аскорбиновой кислоты + 60 мкмоль α-токоферола.

Сразу после инкубации исследовались критерии качества сперматозоидов и подсчитывалось количество живых, мертвых сперматозоидов и с признаками апоптоза.

Статистическую значимость различий сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при значении р<0,05.

Результаты эксперимента выявили, что у фертильных мужчин в контрольных образцах без добавлений Н2О2 в течение 4 ч инкубации процентное содержание (AnV+/PI–)-сперматозоидов и нежизнеспособных клеток не изменялось статистически значимо (р>0,05).

После 5 мин инкубации с 200 мкмоль H2О2 подвижность сперматозоидов была равна нулю. После 2-часовой инкубации с 200 мкмоль Н2О2 доля клеток, связывающихся только с AnV ((AnV+/PI–)-клетки), составляла более 50%, что достоверно выше, чем в контроле (р>0,001). Количество сперматозоидов с поврежденной мембраной, окрашенных PI (нежизнеспособных, мертвых клеток), стало более 30%. Только 13% сперматозоидов оставались живыми неокрашенными (AnV–/PI–)-клетками.

Инкубация сперматозоидов в течение 4 ч с 200 мкмоль H2О2 способствовала увеличению количества мертвых сперматозоидов до 71%, а доля (AnV+/PI–)-клеток оказалась более 20%.

Обработка клеток 25 мкмоль Н2О2 не приводила к стастистически значимому изменению количества AnV (+)/PI (–)-сперматозоидов по сравнению с контролем (р>0,05) ни при одном из периодов инкубации.

При проведении эксперимента по антиоксидантной защите клеток от Н2О2-индуцированного оксидативного стресса для каждого исследованного эякулята было приготовлено 6 проб: 1) контроль (без добавлений); 2) сперматозоиды, инкубированные с низкими концентрациями антиоксидантов; 3) сперматозоиды, инкубированные с высокими концентрациями антиоксидантов; 4) сперматозоиды, инкубированные с 200 мкмоль Н2О2; 5) сперматозоиды, инкубированные с низкими концентрациями антиоксидантов и далее инкубированные с 200 мкмоль Н2О2; 6) сперматозоиды, инкубированные с высокими концентрациями антиоксидантов и далее инкубированные с 200 мкмоль Н2О2.

При 2-часовом инкубировании сперматозоидов как с низкими, так и с высокими концентрациями аскорбиновой кислоты или α-токоферола у фертильных мужчин изменение количества AnV (+)/PI (–)-сперматозоидов по сравнению с контрольными образцами было стастистически недостоверно, р>0,05 (рис. 1, 2).

Более продолжительное (4 ч) инкубирование сперматозоидов как с низкими, так и с высокими концентрациями аскорбиновой кислоты или α-токоферола не приводило к статистически значимому изменению количества AnV (+)/PI (–)-сперматозоидов (р>0,05).

Предварительное добавление к сперматозоидам фертильных мужчин как низких, так и высоких концентраций аскорбиновой кислоты или α-токоферола перед 2-часовой инкубацией клеток с 200 мкмоль Н2О2 приводило к полной защите сперматозоидов от Н2О2-индуцированной экстернализации ФС.

Инкубирование сперматозоидов фертильных мужчин со смесью антиоксидантов в обоих сочетаниях концентраций вызвало стастистически достоверное увеличение количества AnV (+)/PI (–)-сперматозоидов по сравнению с контрольными образцами (рис. 3).

Предварительное добавление к сперматозоидам смеси антиоксидантов еще больше усиливало Н2О2-индуцированные изменения в мембране и вызывало увеличение экстернализации ФС на поверхность мембран сперматозоидов.

Тенденция снижения количественных и качественных характеристик спермы человека отчетливо проявляется в мире в последнее время. Мощное воздействие на мужскую репродуктивную систему оказывают различные факторы. Несмотря на внушительный перечень этих факторов, причины, структура и биохимические основы нарушения фертильности до сих пор остаются не вполне понятными [14—17]. Один из таких факторов, приводящих к нарушению фертильности у мужчин, вызывая гибель половых клеток, — оксидативный стресс, которому клетки могут подвергаться в течение длительного времени перед эякуляцией. АФК — известный индуктор апоптоза не только в соматических клетках, но и в созревших сперматозоидах на тестикулярном уровне [18].

Апоптоз — многоступенчатый, алгоритмизированный процесс, сопровождающийся стадиеспецифическими необратимыми изменениями морфологии и биохимии клетки, происходящими как в ядре (разрушение ДНК на отдельные фрагменты), так и в клеточной мембране сперматозоида (нарушение симметрии клеточной мембраны и повышение ее проницаемости), и экспрессией некоторых молекул [9, 19—21]. Такой сперматозоид не может быть использован для строительства нового организма, так как при попадании в яйцеклетку он не способен обеспечить нормальное развитие, даже если оплодотворение произойдет. С развитием ВРТ и особенно с внедрением метода ИКСИ увеличивается риск введения в ооцит сперматозоидов с такими нарушениями, особенно в случаях использования спермы низкого качества [8].

Предпринята попытка оценить биохимические изменения в мембране сперматозоидов, характерные для начальных стадий апоптоза, после воздействия на клетки разных концентраций Н2О2 в течение различного периода инкубации.

Результаты эксперимента показали, что в ответ на стимуляцию Н2О2 половых клеток в условиях in vitro наблюдалось дозозависимое увеличение количества AnV-позитивных клеток (AnV+/PI–), которое изменялось в зависимости от периода инкубации. Только инкубация с дозой 200 мкмоль H2O2, в зависимости от времени инкубации, приводила сначала к переходу жизнеспособных клеток в клетки, связывающие AnV, что указывает на нарушение симметрии клеточной мембраны и экстернализацию ФС, а затем к переходу от AnV-позитивных клеток к клеткам, окрашивающимся PI, что указывает на повреждение мембраны, т. е. потерю ее целостности.

Сперматозоиды имеют высокий уровень полиненасыщенных жирных кислот в мембране, поэтому наиболее очевидное влияние свободных радикалов на жизнеспособность сперматозоидов выражается в повреждении мембран клеток. Присутствие свободных радикалов вызывает реорганизацию клеточной мембраны и изменение в распределении ФС, вследствие чего он начинает экспрессироваться на ее поверхность.

При подготовке спермы для ВРТ сперматозоиды отделяют от семенной плазмы, при этом они лишаются антиоксидантной защиты и становятся более подверженными оксидативному стрессу. Много дискуссий ведется о преимуществах антиоксидантной терапии, применяемой для улучшения мужской фертильности. Для лечения мужского бесплодия в последнее время внедряются методы антиоксидантной защиты органа или организма в целом. В качестве терапии антиоксидантами применяются витамины Е, С, карнитин и др. [22—27]. Добавление антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота или α-токоферол, к сперматозоидам было использовано с целью сохранения целостности их ДНК [28]. Однако следует признать, что антиоксидантная терапия может давать обратный негативный эффект с нежелательными последствиями, если превышен порог безопасной дозировки.

Несомненно, существует множество преимуществ антиоксидантной защиты и применения антиоксидантов как in vivo, так и in vitro. Проведенное исследование доказало благотворное влияние инкубации сперматозоидов in vitro с антиоксидантами — аскорбиновой кислотой и α-токоферолом по отдельности для защиты мужских половых клеток от Н2О2-индуцированного повреждения.

С помощью «аннексинового» метода удалось доказать, что аскорбиновая кислота (300 или 600 мкмоль) или α-токоферол (40 или 60 мкмоль) предотвращают процесс экстернализации маркера апоптоза ФС на поверхность половых клеток, вызванный индуктором оксидативного стресса Н2О2. Данный эффект имел место при 2-часовой предварительной инкубации сперматозоидов фертильных мужчин с каждым из указанных антиоксидантов по отдельности. Увеличение времени инкубации половых клеток с антиоксидантами перед Н2О2-индуцированным повреждением не приводило к улучшению эффекта антиоксидантной защиты.

Проведенное исследование показало, что Н2О2 стимулирует гибель эякуляторных сперматозоидов по пути как апоптоза, так и некроза и направленность эффекта зависит как от концентрации Н2О2, так и от времени инкубации. Н2О2 в концентрации 200 мкмоль при 2-часовом воздействии стимулирует апоптоз сперматозоидов фертильных мужчин, вызывая необратимые биохимические изменения в клеточной мембране, вследствие чего ФС начинает экспрессироваться на ее поверхность и возрастает число AnV (+)/PI (–)-сперматозоидов.

Добавление аскорбиновой кислоты или α-токоферола к сперматозоидам фертильных мужчин не оказывает какого-либо статистически значимого влияния на изменение в распределении ФС и изменения количества AnV (+)/PI (–)-сперматозоидов. Однако эти антиоксиданты, но только по-отдельности, защищают сперматозоиды от H2O2-стимулированной гибели, препятствуя реорганизации клеточной мембраны и экстернализации ФС.

Данные выводы могут иметь клиническое значение, поскольку экспрессия маркера апоптоза ФС может быть использована в качестве диагностического инструмента для прогнозирования нарушений оплодотворяющей способности и дисфункций эякуляторных сперматозоидов, а также мужского бесплодия. Безусловно, полученные результаты расширяют область знаний при лечении мужского бесплодия, обусловленного активацией синтеза АФК и бедностью антиоксидантов в семенной плазме, т. е. нарушением редокс-баланса.

Понимание возможных механизмов смерти половых клеток в результате воздействия различных факторов, одним из которых является оксидативный стресс, поможет в поиске необходимых маркеров для сперматозоидов, проходящих отбор при подготовке спермы для ВРТ. Результаты исследования могут быть полезны при подготовке сперматозоидов для ИКСИ у мужчин, у которых сперма долгое время находилась в эпидидимисе в случаях абстиненции, или анэякуляции, или при затрудненном ее продвижении, обструкции семявыносящих путей, либо в случаях высокого уровня АФК.