Бесплодие является важной медицинской и социальной проблемой. Одной из наиболее частых причин нарушения репродуктивной функции (30—40%) является наружный генитальный эндометриоз. У половины больных эндометриозом выявляются точечные мутации в гене NAT2. Известно, что NAT2 — ген, продукт которого ариламин-N-ацетилтрансфераза-2 играет важную роль в ацетилировании ароматических и гетероциклических аминов. Поэтому при нарушениях его функции, обусловленных полиморфизмом кодирующего гена, происходит накопление эндотоксинов, которые в свою очередь усиливают процессы свободнорадикального окисления в клетке. Также доказана роль оксидативного стресса при эндометриозе на основании изучения специфических маркеров, что сопровождается эндотоксикозом, активацией перекисного окисления липидов, нарушением микроциркуляции. Эти факторы предполагают использование методов гемафереза, обладающих детоксикационными, реокорригирующими, иммунокорригирующими свойствами. В последние годы методы гемафереза (или эфферентные методы) используются в терапии более 200 различных заболеваний [1—9], в том числе и в акушерстве и гинекологии. Так, доказана эффективность одного из методов гемафереза — плазмафереза в комплексной терапии плацентарной недостаточности, климактерического синдрома, хронических воспалительных заболеваний органов малого таза, в реабилитации после миом- и гистерэктомии, при подготовке к программам вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [10—15]. Исследователи [16] рекомендуют включать плазмаферез в комплекс реабилитационных мероприятий после лапароскопических реконструктивно-пластических операций при трубно-перитонеальной форме бесплодия.

В программах ВРТ у женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия плазмаферез используют с целью улучшения реологических свойств крови, микроциркуляции, снижения активного воздействия стероидных гормонов на свертывающую систему крови в процессе стимуляции суперовуляции, повышения стабильности проницаемости эндотелия сосудов, снижения уровня эндотоксикоза, удаления из крови иммунных комплексов, антифосфолипидных антител и антител к хорионическому гонадотропину, а также лечения и профилактики обострения герпетической и цитомегаловирусной инфекций, снижения лекарственной нагрузки на организм и профилактики синдрома гиперстимуляции яичников.

Однако до настоящего времени до конца не изучен вопрос о возможности и патогенетической обоснованности применения плазмафереза при лечении пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза и выявленными точечными мутациями в гене NAT2. Известно, что NAT2 — ген, продукт которого ариламин-N-ацетилтрансфераза-2 играет важную роль в ацетилировании ароматических и гетероциклических аминов. Поэтому при нарушениях его функции, обусловленных полиморфизмом кодирующего гена, происходит накопление эндотоксинов, которые в свою очередь усиливают процессы свободнорадикального окисления в клетке [17]. Также доказана роль оксидативного стресса при эндометриозе на основании изучения специфических маркеров [18].

Учитывая выраженный детоксикационный эффект плазмафереза за счет не только механического удаления микробов и их токсинов, медиаторов воспаления, продуктов метаболизма, компонентов разрушенных и некротически измененных клеток, но и благодаря стимуляции органов и систем организма, отвечающих за связывание, инактивацию и выведение эндо- и экзотоксинов, а также снижения свободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов, можно предположить, что его использование окажет благоприятное воздействие на состояние всей детоксикационной системы организма, а также антиоксидантной защиты и, следовательно, позволит улучшить результаты лечения пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза.

Цель настоящего исследования — оценка эффективности терапевтического плазмафереза в комплексном лечении пациенток с перитонеальной формой эндометриоза, бесплодием и точечными мутациями в гене NAT2.

В исследование были включены 140 пациенток с бесплодием и перитонеальным эндометриозом, верифицированным при лапароскопии, и точечными мутациями в гене NAT2. Всем больным при лапароскопии произведена аргоноплазменная коагуляция очагов эндометриоза, сальпингоовариолизис, фимбриопластика (по показаниям). Далее все пациентки были разделены на две группы: основная группа — 93 (66,4%) женщины, которым в следующем после лапароскопии цикле проведен курс плазмафереза (второй этап комплексного лечения); группа сравнения — 47 (33,6%) пациенток, у которых эфферентные методы лечения не применялись. Учитывая современные рекомендации Европейского общества репродукции человека о неэффективности гормональной терапии и биологически активных добавок в отношении повышения фертильности после оперативного вмешательства по поводу эндометриоза, от назначения любых препаратов было решено отказаться. Курс лечебного плазмафереза у пациенток основной группы проводился в первую фазу менструального цикла, начиная с 5—6-го дня, и включал 3 сеанса плазмафереза с интервалом 2—4 дня. Процедура проводилась в аппарате PCS2 фирмы «Haemonetics» (США). Сборка систем магистралей осуществлялась в асептических условиях непосредственно перед процедурой. В качестве антикоагулянта использовали раствор АСД-А (кислая декстроза), подаваемый автоматически в соотношении к крови 1:12. Перед началом процедуры пациентке вводили внутривенно гепарин из расчета 25 ЕД на 1 кг массы тела. Проведение лечебного плазмафереза осуществлялось с подачей крови в аппарат со скоростью 25—40 мл в 1 мин в зависимости от пропускной способности катетера и возможности вены. Скорость вращения центрифуги PCS2 7500 об/мин, плазма удалялась со скоростью 15—30 мл/мин в зависимости от скорости подачи крови.

Одновременно с забором крови и удалением плазмы производилось плазмозамещение кристаллоидными (физиологический раствор 0,9%) и коллоидными (растворы гидроксиэтилированного крахмала 6 или 10% с молекулярной массой 130/04 или 200/04) растворами в соотношении 1:1,5 к объему эксфузии в автоматическом режиме аппарата. В случаях исходного низкого содержания альбумина (менее 60 г/л) в плазмозамещение включали 10% раствор альбумина (100 мл).

Для определения объемов циркулирующей плазмы и крови (ОЦП и ОЦК соответственно) и количества удаляемой плазмы использовалась математическая программа расчета, основанная на некоторых антропометрических данных пациентки и некоторых физиологических константах. ОЦК определяли с учетом массы тела, роста, конституционного типа по методике Moore:

ОЦК = М·Кк,

где М — масса тела в кг; Кк — количество крови в мл на 1 кг массы тела (зависит от типа телосложения женщины и составляет от 55 до 70 мл/кг).

Далее рассчитывали показатель гематокрита, который составляет утроенный уровень гемоглобина (г%):

Гт = Гн ·3,

где Гт — гематокрит в %; Гн — содержание гемоглобина в г%.

Затем по расчетному ОЦК и показателю гематокрита определяли ОЦП:

ОЦП = ОЦК (100% – Гт).

Из расчетного показателя ОЦП высчитывали планируемый процент удаления плазмы (П), добавляя к этому объему 5% на дополнительно вводимый в приточную магистраль раствор антикоагулянта, в большей своей части удаляемый с плазмой, и получали величину планируемого количества удаляемой плазмы (КУП):

КУП = ОЦП·П· (100%+5%) = ОЦП· П ·1,05.

Критерии включения в исследование:

— пациентки с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза, верифицированного при лапароскопии;

— возраст 20—39 лет;

— нормальный овариальный резерв (уровень ФСГ менее 8 МЕ/л, антимюллерова гормона более 2 нг/мл и количество антральных фолликулов более 10 в каждом яичнике на 2—3-й день цикла);

— наличие 3 и более точечных мутаций в гене NAT2.

Критерии исключения:

— пациентки с миомой матки, доброкачественными опухолями яичников, гидросальпинксами, пороками развития женских половых органов;

— наличие соматической патологии, ассоциированной с точечными мутациями в гене NAT2 (псориаз, нейродегенеративные заболевания, заболевания легких и мочевого пузыря);

— пациентки с эндокринным фактором бесплодия.

Общеклиническое обследование

При сборе анамнеза особое внимание уделяли менструальной и репродуктивной функциям пациенток, исходу предшествующих беременностей, а также их осложнений. Оценивали частоту инфекционных заболеваний в детстве, характер течения воспалительного процесса, получали данные о сопутствующей экстрагенитальной патологии и о перенесенных оперативных вмешательствах, травмах, наследственных заболеваниях.

Генетическое исследование

Наличие полиморфизма генов NAT2 определяли в лаборатории на базе ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Информированное согласие на использование крови для проведения исследований было получено у всех пациенток.

Материалом для этого исследования служили образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови пациенток. В качестве консерванта использовали 1 мл 0,5 M ЭДТА (рН 8,0).

Количественная оценка уровня эндогенной интоксикации (эндотоксический индекс — ЭИ, молекулы средней массы — МСМ) и уровня оксидативного стресса (малоновый альдегид — МА, супероксиддисмутаза — СОД, общая антиоксидантная активность — ОАО) до и после проведения плазмафереза.

Статистическая обработка данных

Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы SPSS (версия 10.0.7) и Statistica (версия 6.0) for Windows. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Результаты анализа клинико-анамнестических особенностей пациенток с бесплодием, перитонеальной формой эндометриоза и мутациями гена NAT2 были представлены нами ранее [20]. В полученных данных обращает на себя внимание высокая частота хронических заболеваний органов дыхания и мочеполовой системы, инфекционных, аутоиммунных и аллергических поражений кожи; отягощенный онкологический и аллергологический анамнез у этой группы больных. При оценке результатов клинико-лабораторных исследований выявлено некоторое снижение показателей гемоглобина практически у всех пациенток: среднее содержание гемоглобина 110±3 г/л (норма 120—140 г/л). Общее количество лейкоцитов у 93% данных пациенток приближалось к верхней границе нормы — среднее значение 8,4±0,6·10⁹/л (норма 4,0—9,0·10⁹/л), а в лейкоцитарной формуле у 78% пациенток отмечался незначительный сдвиг влево (палочкоядерные — 7,7±0,6%, сегментоядерные — 45,2±0,3%). Это может быть связано с нарушением метаболизма ксенобиотиков, обусловленным точечными мутациями в гене NAT2 и эндогенной интоксикацией [21].

Согласно результатам исследований, эффективность лечения бесплодия у пациенток с перитонеальной формой эндометриоза и точечными мутациями в гене NAT2 достоверно ниже, чем у пациенток без мутаций [22]. Установлено, что группа пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза является неоднородной по состоянию системы детоксикации и про-антиоксидантного баланса на системном уровне. Выявленные изменения взаимосвязаны с наличием или отсутствием точечных мутаций гена NAT2: при их наличии отмечено увеличение уровня эндогенной интоксикации и прооксидантный сдвиг. Данная когорта больных может быть отнесена к группе неблагоприятного прогноза в отношении частоты наступления маточной беременности после лечения [23].

С целью оценки влияния эфферентных методов лечения на уровень эндогенной интоксикации и показатели оксидативного стресса у пациенток с бесплодием, перитонеальной формой эндометриоза и точечными мутациями в гене NAT2 было проведено определение ЭИ, уровня МСМ и количественная оценка уровня МДА, СОД, ОАО до и после курса лечения с применением плазмафереза.

Изменения показателей эндогенной интоксикации и оксидативного стресса после применения терапевтического плазмафереза у пациенток с бесплодием, перитонеальным эндометриозом и точечными мутациями в гене NAT2 представлены в табл. 1. После проведения курса плазмафереза отмечено достоверное снижение концентрации МСМ (р<0,05). Относительно Э.И. анализ показал, что в процессе комплексного лечения с применением плазмафереза у пациенток наблюдалось его возрастание (р<0,05).

Для оценки показателей оксидативного стресса использовался сравнительный анализ концентрации МДА, СОД и ОАО в крови пациенток. Установлено, что в основной группе пациенток, у которых применяли плазмаферез, регистрировалось выраженное снижение содержания МДА (с 4,7±0,39 до 2,5±0,29 мкмоль/л; р<0,05). Повышение уровня СОД и ОАО составило 23,4 и 14,8% соответственно (р<0,05).

С целью оценки отдаленных результатов лечения бесплодия у пациенток с перитонеальной формой эндометриоза и точечными мутациями в гене NAT2 в течение 12 мес было проведено дальнейшее наблюдение. Данные представлены в табл. 2.

Как показал анализ, наибольшая частота наступления беременности в обеих группах (27,9% в основной группе и 19,1% в группе сравнения) отмечалась в первые 3 мес после лечения и значительно снижалась после 6 мес наблюдения, что согласуется с данными литературы [24]. Однако в группе пациенток, не получивших комплексное лечение с использованием эфферентных методов лечения, частота наступления как самостоятельной беременности, так и беременности в результате программ ВРТ в течение 6—12 мес была достоверно ниже (в 6,5 и 1,5 раза соответственно), чем в основной группе. Обращает на себя внимание, что количество замерших беременностей в течение первых 3 мес у пациенток, которым не проводился терапевтический плазмаферез, было в 4 раза выше, чем в основной группе (р<0,05), и составило 8,5%.

По данным литературы [25], одной из причин неразвивающейся беременности в I триместре являются обширные повреждения трофобласта, вызванные окислительным стрессом и дисфункцией про- и антиоксидантных систем. Следует отметить, что в последние годы лечебный плазмаферез стал достаточно широко использоваться в клинике невынашивания беременности как в качестве прегравидарной подготовки, так и в виде лечебного фактора во время гестации [26—28].

Количество пациенток с внематочной беременностью достоверно не различалось в исследуемых группах.

Выявлено увеличение частоты наступления беременности в основной группе по сравнению с пациентками, не получившими комплексное лечение, в 2 раза в течение 3—6 мес и в 4 раза в течение 6—12 мес. Однако эффективность программ ВРТ в основной группе пациенток через 6 мес после лечения резко снижалась с 8,6 до 3,2%, что может быть связано с кратковременным эффектом комплексного лечения с использованием терапевтического плазмафереза и последующими рецидивирующими изменениями состояния оксидативного стресса.

В конце 90-х годов прошлого столетия было показано, что недостаточность системы детоксикации, предопределенной генетически, может являться фактором риска развития эндометриоза. Исследователями доказано, что ген глутатион-S-трансфераза М1 (GST), связанный со второй фазой детоксикации, играет существенную роль в патогенезе данного заболевания [29]. Более современные исследования [30], проведенные в эксперименте с резус-макаками, доказали роль полиморфизма гена ариламин-N-ацетилтрансферазы (NAT-2) в развитии эндометриоза.

Показано, что аллельные варианты гена NAT2 характеризуются различной активностью фермента N-ацетилтрансферазы. В зависимости от этого носителей соответствующих аллельных вариантов разделяют на «быстрых», «промежуточных» и «медленных» ацетиляторов [31]. Исследуемые точечные мутации приводят к формированию «медленного фенотипа ацетилирования», который, согласно данным литературы [32], способствует снижению уровня фермента N-ацетилтрансферазы, замедляя превращение ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА. При подобных изменениях нарушается метаболизм ксенобиотиков, что повышает уровень эндогенной интоксикации.

Кроме того, в последнее время проводятся исследования, посвященные изучению маркеров оксидативного стресса в фолликулярной жидкости и сыворотке крови у пациенток с бесплодием и эндометриозом, связанное с поиском механизмов, приводящих к снижению фертильности как при естественном зачатии, так и при использовании ВРТ, в том числе низкому качеству яйцеклеток. Показано снижение антиоксидантной активности у пациенток с бесплодием и эндометриозом, что влияет как на фолликулогенез, так и на качество ооцитов и эмбрионов [33]. Изменения в работе многокомпонентной антиоксидантной системы и регуляции определенного уровня перекисного окисления липидов нарушают нормальное функционирование клеток, в том числе и эндометрия, что является провоцирующим фактором в распространении и прогрессировании генитального эндометриоза [34—36].

Доказано, что особенности полиморфизма гена NAT2 ассоциированы с эффективностью лечения пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза и влияют на отдаленные результаты. Выявлено, что у забеременевших в результате лечения пациенток с перитонеальной формой эндометриоза частота встречаемости точечного полиморфизма гена NAT2 (с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G) в 3 раза ниже, чем у незабеременевших. Пациентки, не имеющие точечных мутаций в гене NAT2, могут быть отнесены в группу благоприятного прогноза [37].

Таким образом, результаты проведенного исследования показали эффективность плазмафереза в качестве метода, стабилизирующего системный оксидантный статус, а также его положительную роль с клинических позиций у пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза. В этой группе пациенток после комплексного лечения выявлено достоверное увеличение частоты наступления маточной беременности (как самостоятельных, так и в ходе программ ВРТ), а также снижение количества неразвивающихся беременностей.

По всей вероятности, данный эффект является относительно кратковременным и позволяет создать некое «благоприятное окно» повышения фертильности в группе женщин с точечными мутациями гена NAT2 и нарушениями в системе детоксикации (группа неблагоприятного прогноза в отношении наступления маточной беременности), что объясняет наилучшие результаты в течение 3 мес после лечения.

Разработанная методика дифференцированного подхода к ведению пациенток с бесплодием и перитонеальным эндометриозом с учетом особенностей полиморфизма гена NAT2 позволяет достоверно улучшить отдаленные результаты лечения (наступление маточной беременности и ее пролонгирование).