Формирование бесплодия, как и бесплодие трубного происхождения, обусловлено множеством факторов ангиогенно-воспалительного стресса: инфекционными агентами, оперативными вмешательствами на органах малого таза, а также сопутствующей гинекологической патологией (хронический сальпингоофорит, хронический эндометрит, наружный генитальный эндометриоз, миома матки) [1]. Данные факторы оказывают непосредственное влияние на репродуктивную функцию, препятствуя наступлению беременности. Проведенный нами анализ клинико-анамнестической характеристики пациенток с трубным бесплодием показал, что исключение факторов, формирующих бесплодие трубного происхождения, не влияет на эффективность программы ЭКО, которая составляет 41% [9].
Открытие нами в 1983 г. гликолипопротеидного комплекса эутопического эндометрия и выявление в нем характерных изменений у женщин с бесплодием является этапом для создания научной основы поиска специфических белков эндометрия [2]. В настоящее время изучение специфических белков эндометрия, ответственных за имплантацию эмбриона, сохранение и развитие беременности, основано на использовании высокотехнологичных исследований, которые включают: геномику (genomics), эпигеномику (epigenomics), транскриптомику (transcriptomics), протеомику (proteomics) и метаболомику (metabolomics) [11].
Наличие многокомпонентной и нормализованной функциональной активности эндометрия является необходимым условием удачной имплантации. Любое нарушение этой составляющей означает неудачу наступления беременности как при физиологических условиях, так и в цикле ЭКО и ПЭ, даже при наличии растущей и зрелой бластоцисты. Молекулы адгезии L-селектина бластоцисты и его олигосахаридного лиганда МЕCА-79 в эндометрии могут служить потенциальными биохимическими маркерами рецептивности эндометрия. Исследования системы L-селектинов необходимы, так как они позволяют разработать систему мероприятий и новый класс потенциальных лекарств для применения у больных с дефектами рецептивности эндометрия, бесплодием и при повторяющихся ранних потерях беременности [6].
Существующие морфологические оценочные классификации, в том числе классификация Гарднера, недостаточно отражают зрелость эмбриона и позволяют только выделять когорту потенциальных эмбрионов для дальнейшей селекции. Следовательно, разработка неинвазивных, воспроизводимых, стандартизованных и объективных методов оценки зрелости эмбрионов на различных стадиях дифференцировки может иметь решающее значение для существенного повышения эффективности ЭКО и ПЭ. В то же время попытки оптимизации некоторых параметров технологии ЭКО и ПЭ являются субъективными и недоказанными, значительно варьируя от одного клинического случая к другому [10].
При анализе 467 работ, отраженных в поисковой системе PubMed по разделу «selectins», было выбрано 27 работ, имеющих статистически значимые различия в представленных результатах (р<0,001) и высокий индекс международного цитирования за последние 15 лет.
Цель работы - систематизация и представление наиболее значимых факторов и механизмов системы селектинов для оценки их роли в имплантации и наступлении беременности.
Описание роли L-селектина. У человека L-селектин является основным и определяющим гликопротеином на поверхности различных лейкоцитов. L-селектин человека и мыши имеет близкую структуру, на 77% они идентичны по составу аминокислот и на 79% - по кодирующим нуклеотидам. Установлены две формы L-селектина, которые могли возникнуть в результате посттранскриптомных модификаций. На лимфоцитах расположены молекулы с молекулярной массой 74 кД, в то время как на нейтрофилах - 90-100 кД [26].
Установлено, что L-селектин играет роль в миграции лимфоцитов в периферические лимфатические узлы и участки с хроническим или острым воспалением. Действуя совместно с P-селектином, L-селектин устанавливает начальное взаимодействие лейкоцитов с эндотелиальными клетками. Эта реакция сопровождается вовлечением E-селектина, приводя на конечной стадии к транссудации лейкоцитов через стенки кровеносных сосудов в лимфатические ткани или к участкам воспаления [20, 33].
Были идентифицированы три лиганда для L-селектина на поверхности эндотелиальных клеток. Все они содержат O-glycosylated mucin, или муциноподобные области. Первый лиганд, GlyCAM-1, выражен исключительно в периферических или брыжеечных лимфатических узлах. Второй лиганд L-селектина, первоначально названный sgp90, теперь известный как CD34. Этот сиалоподобный муциновый гликопротеин оказывает выраженное воздействие как на сосуды нелимфатических тканей, так и на капилляры периферических лимфатических узлов. Третий лиганд - MAdCAM-1, муциноподобный гликопротеин, обнаружен только в лимфатических узлах [17, 25, 31].
Известно, что во время «окна имплантации» со стороны матери экспрессируется олигосахаридный лиганд к L-селектину поверхностными эпителиальными клетками, а на эмбриональной стороне трофобластом L-селектин [19]. Повышенная экспрессия селектин-лиганда в начале и середине секреторной фазы подтверждает его участие в имплантации [28].
Показано, что L-селектин не только имеет значение для нидации и плацентации, но и обладает функциональной активностью для кровеносных сосудов. Медиаторная функция L-селектина в сосудах является важным компонентом этого процесса для получения требуемой оптимальной адгезии [37].
Селектинадгезионная система устанавливает материнско-фетальное взаимодействие. Со стороны бластоцисты наблюдается сильная экспрессия L-селектина, а со стороны эндометрия - экспрессия олигосахаридных лигандов L-селектина, таких как MECA-79 и HECA-452, которые участвуют в регуляции «окна имплантации». Экспрессия лиганда селектина MECA-79, локализованного в поверхностном и железистом эндометриальном эпителии, в течение менструального цикла значительно повышена в середину секреторной фазы. Кроме того, его иммунореактивность проявляется наиболее сильно в поверхностном эпителии в сравнении с железистым эпителием [18].
Лиганд L-селектина способствует имплантации эмбриона в эндометрий, а его уровень значительно повышается у женщин с наступившей беременностью. Процент клинических беременностей и имплантаций значительно выше у пациенток с высоким уровнем лиганда L-селектина в сравнении с пациентками с низким его уровнем [14].
Исследования [24] показывают, что недостаток экспрессии лиганда L-селектина может снижать шанс успешной имплантации, хотя у некоторых женщин беременность наступает при низком уровне экспрессии. Это объясняется тем, что экспрессия лиганда L-селектина может увеличиваться в присутствии эмбриона.
По нашим данным [7], частота имплантации и наступления беременности выше у пациенток с низким уровнем L-селектина в сыворотке крови и эндометрии по сравнению с пациентками с высоким уровнем L-селектина в крови и в эндометрии.
L-селектин in vitro удаляется с поверхности лимфоцитов и нейтрофилов протеолитическими ферментами при их активации различными агентами. В естественных условиях L-селектин солюбилизируется с поверхности нейтрофилов при воспалении, и поэтому было высказано предположение, что удаление поверхностного L-селектина должно быть необходимым условием для реализации механизма миграции лейкоцитов через эндотелий [33].
Растворимый L-селектин (sL-селектин), выделяемый лимфоцитами, имеет молекулярную массу 62 кД, в то время как фрагмент, полученный из нейтрофилов, - 75-100 кД. Он сохраняет биологическую активность как при низких, так и при высоких концентрациях и может блокировать взаимодействие лимфоцитов с эндотелием или участвовать в модуляции этого взаимодействия в естественных условиях [33]. Высокий уровень sL-селектина был обнаружен в образцах крови у здоровых людей. Установлено, что уровень sL-селектина в биологических жидкостях может быть увеличен или снижен при различных патологических состояниях [12, 21, 30, 32].
Проведенный нами систематический анализ данных литературы показал, что система адгезионных молекул L-селектина, локализованного на поверхности бластоцисты, и его олигосахаридный лиганд, тесно связанный с поверхностным эпителием эндометрия, являются одними из ведущих звеньев эмбрионально-эндометриального взаимодействия, обеспечивая удержание и нидацию эмбриона в эндометрий. Этим открывается возможность последующего воздействия системы трофинина и HB-EGF/ErbB4. Нарушения, возникающие на данном этапе, могут быть причиной неудач имплантации и, следовательно, отрицательных попыток ЭКО и ПЭ. Наличие в полости матки природного клееобразного вещества двухкомпонентного состава, способного фиксировать бластоцисту и не нарушать процессов взаимодействия и естественного развития эмбриона, позволяет создать на этой основе новый класс лекарственных препаратов для применения их в программах ВРТ [8].
Описание роли Е-селектина. E-селектин является трансмембранным гликопротеином с молекулярной массой 115 кД. Он обнаружен в клетках эндотелия после их активации цитокинами IL-1, TNF-α или эндотоксинами. Его активность достигает максимума в течение 6 ч и затем уменьшается. Поверхностные эндотелиальные клетки, содержащие E-селектин, являются для лейкоцитов необходимым посредником для их внесосудистого проникновения к участку воспаления [15, 23, 35].
Растворимый E-селектин (sE-селектин) обнаружен в крови здоровых людей, вероятно, являясь результатом протеолитического расщепления поверхностной части общей молекулы. Установленные уровни sE-селектина в сыворотке крови изменяются при различных патологических состояниях. Принято считать, что sE-селектин может подавлять перемещение лейкоцитов, конкурируя за связывание с мембранным E-селектином, и, следовательно, может активизировать нейтрофилы или действовать как активирующий агент [12, 27, 30].
Описание роли Р-селектина. P-селектин (gp 140, LECAM-3, PADGEM, CD62, CD62P) является поверхностным гликопротеином клеток и оказывает критическое воздействие на перемещение лимфоцитов в тканях. Р-селектин появляется на поверхности клеток в течение 1 мин в ответ на различные повреждения или воздействие факторов, приводящих к образованию тромбов. Нерастворимый или мобилизованный на поверхности клеток Р-селектин существует в течение только нескольких минут, после чего он метаболизирует внутриклеточно. Имеются данные, указывающие на то, что транскрипцию мРНК Р-селектина можно активизировать в эндотелии путем воздействия различных посредников [13].
Р-селектин состоит из NH
Р-селектин участвует в адгезии миелоцитов и B-лимфоцитов к T-лимфоцитам или к активированному эндотелию сосудов. Р-селектин также участвует в адгезии тромбоцитов к моноцитам или нейтрофилам, играя центральную роль в накоплении нейтрофилов в пределах участка образования тромба. Адгезия лейкоцитов и, в частности, нейтрофилов к эндотелию начинается со слабых взаимодействий, для которых характерны движения лейкоцитов и нейтрофилов над поверхностью эндотелия по типу «вращения» [29, 36].
Р-селектин проявляет свои свойства в присутствии L-селектина, начиная с ранних периодов активации. P-селектин локализуется в особых гранулах, или «тельцах Вейбеля-Паладе» эндотелиальных клеток и секретируется на поверхность клетки в течение минут после клеточной активации. Для более выраженного активирования Р-селектина необходимо вовлечение E-селектина. В последующем наблюдается его проникновение через стенки кровеносного сосуда в лимфатические ткани или к участкам воспаления [13, 34].
Тетрасахарид sialyl Lewisx (sLex) был идентифицирован как лиганд для P- и E-селектинов, но P-, E- и L-селектины могут все связывать sLex и sLea при соответствующих условиях [34]. Р-селектин обнаружен в плазме у здоровых людей при измеряемых концентрациях (в нг/мл), которые могут изменяться при различных патологических состояниях [12, 16, 22].
Первое проведенное нами в 2012 г. исследование по определению содержания L-, P-, E-селектинов в культуральной среде бластомеров 3-го дня развития показало, что эти данные могут служить дополнительным диагностическим признаком сохранности, жизнеспособности и функциональной активности эмбриона. Полученные результаты позволяют охарактеризовать среду культивирования эмбрионов не как инертную, а как источник дополнительной информации о состоянии эмбриона. Проведенное данное проспективное исследование явилось наукообразующим и потребовало дальнейших работ по стандартизации выбранного метода, разработке референсных значений и установлению диагностических ограничений определения уровня селектинов в культуральной среде эмбрионов [3].
В 2013 г. было проведено первое сравнительное исследование по определению содержания селектинов в культуральной среде эмбрионов 3-го и 5-го дней развития. Показано, что эти данные могут служить дополнительными диагностическими признаками их жизнеспособности и функциональной активности. Полученные результаты позволили выделить четыре варианта содержания растворимых селектинов в культуральной среде эмбрионов и показать принципиальную возможность использования культуральной среды эмбрионов 3-го и 5-го дней развития для определения в ней растворимых L-, P- и E-селектинов методом твердофазного иммуноферментного анализа. Максимальная концентрация среди изученных селектинов установлена для L-селектина и минимальные для Р- и Е-селектинов. Распределение данных по способу индукции оплодотворения (ЭКО или ИКСИ) показало, что для всех групп сохраняются достоверные различия между показателями L-селектина. При этом содержание L-селектина всегда достоверно ниже у эмбрионов с наступившей беременностью на 3-й день («тихие» эмбрионы) и достоверно выше у эмбрионов на 5-й день («активные» эмбрионы) при наступлении беременности. Возможность дозированного включения в состав среды культивирования бластомеров и бластоцист синтетических, рекомбинантных, природных или химерных селектинов является новым направлением в создании системы контролируемого развития эмбрионов перед переносом их в полость матки [5].
Клинико-лабораторные исследования показали, что процент имплантаций и наступления беременности статистически значимо выше в программах ЭКО/ИКСИ у пациенток с низким уровнем L-селектина в сыворотке крови (менее 1710 нг/мл), низкой экспрессией L-селектина в эндометрии (поверхностный эпителий, железы и строма) и высокой экспрессией MECA-79 в эндометрии (поверхностный эпителий и железы). При ненаступлении беременности в программах ЭКО/ИКСИ наблюдается высокий уровень L-селектина в сыворотке крови (более 1710 нг/мл) и в эндометрии (поверхностный эпителий, железы и строма) и низкая экспрессия MECA-79 в поверхностном эпителии и в железах. Эти данные открывают новые возможности для повышения эффективности лечения с использованием программ ЭКО/ИКСИ на основе мониторинга уровня L-селектина в сыворотке крови и в эндометрии и его лиганда MECA-79 в эндометрии, а также поиска новых таргетных способов подготовки больных с бесплодием к ВРТ [7].
В последующем в 2014 г. нами была проведена прегравидарная подготовка эндометрия у 28 больных с трубным фактором бесплодия перед программой ЭКО, которая включала воздействие лечебных физических факторов и циклическую гормональную подготовку в течение одного менструального цикла [3]. Циклическая гормональная подготовка проводилась с использованием трансдермального эстрадиола с 5-го по 25-й день и микродозированного прогестерона с 16-го по 25-й день менструального цикла. Электроимпульсную терапию начинали на 5-7-й день менструального цикла ежедневно по 20 мин 1 раз в день по методике, разработанной в гинекологическом отделении восстановительного лечения ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Курс составил 10 процедур. Все больные были разделены на две группы в зависимости от уровня селектина в крови в период «окна имплантации»: 1-я группа с уровнем селектина менее 1710 нг/мл, 2-я группа - с уровнем селектина более 1710 нг/мл. Стимуляцию суперовуляции проводили по короткому протоколу. Наступление беременности отмечено при уровне L-селектина менее 1710 нг/мл у 57,1% больных с лечением (без лечения - у 42,9%; р>0,05). Наименьшая эффективность (14,3%) отмечена у больных при уровне L-селектина более 1710 нг/мл без лечения, с лечением - в 42,3% (р<0,05). Отмечается высокая статистическая значимость различий между показателями 57,1 и 14,3% (р<0,01). Следовательно, у больных 1-й группы лечение не влияет на результативность ЭКО, в то время как во 2-й группе лечение приводит к повышению эффективности ЭКО. Уровень L-селектина в крови является прогностическим показателем, который в совокупности с другими факторами рецептивности эндометрия оказывает влияние на частоту наступления беременности.
Наиболее значимые научные данные, полученные в 1983-2014 гг. по проблеме роли лиганд-рецепторных взаимодействий в системе эндометрий-эмбрион, представлены в таблице.
- этапное снижение уровня L-селектина на 3-й день инкубации и последующее повышение его в культуральной среде на 5-й день инкубации с одновременной высокой экспрессией его лиганда МЕСА-79 в поверхностном эпителии и в эпителии желез в период «окна имплантации» и сниженной экспрессией L-селектина в поверхностном эпителии, эпителии желез и клетках стромы, сопровождается наступлением беременности;
- этапное повышение уровня L-селектина на 3-й день инкубации и последующее снижение его в культуральной среде на 5-й день инкубации с одновременной низкой экспрессией его лиганда МЕСА-79 в поверхностном эпителии и в эпителии желез в период «окна имплантации» и повышенной экспрессией L-селектина в поверхностном эпителии, эпителии желез и клетках стромы сопровождается ненаступлением беременности;
- содержание L-селектина в крови у больных с бесплодием трубного происхождения имеет прогностическое значение для наступления беременности в программах ЭКО/ИКСИ.
Таким образом, цикл исследований по оценке прогностической и диагностической значимости определения уровня селектинов в культуральной среде эмбрионов 3-го и 5-го дней инкубации, в сыворотке крови, в эндометрии и селективного лиганда МЕCА-79 в эндометрии в период «окна имплантации» в программе ЭКО/ИКСИ позволил показать участие этой системы факторов в процессах наступления беременности (схема).
Благодарности. Выражаю благодарность профессору Matts Olovsson и aссистенту профессору Anneli Stavreus-Evers, сотрудникам Department of Women's and Children's Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за многолетнее сотрудничество, участие, обсуждение и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась Шведской королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (проект №8683), Университетом Уппсалы, Швеция, Российской академией наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова», Минздрава России.