Среди всех причин бесплодия мужской фактор занимает значительное место. Все пациенты с азооспермией и тяжелой олигозооспермией нуждаются в генетическом обследовании. В 15% случаев у них выявляются хромосомные аномалии, чаще всего синдром Клайнфельтера в мозаичном варианте [1, 2].

Индивидуумы с мозаичным кариотипом 46,XY/46,XX имеют два клона клеток: один с мужским, другой с женским набором хромосом. Подобное состояние может быть связано с химеризмом. Под химеризмом понимают наличие двух различных генетически не идентичных популяций клеток, находящихся в рамках единого организма. Химеризм разделяется на искусственный (артифициальный), тетрагаметический и химеризм в результате трансфузии клеток близнецов («twin chimerism»). Кроме того, встречаются такие понятия, как микрохимеризм и герминальный химеризм.

Тетрагаметическая химера образуется в результате слияния двух различных зигот на самых ранних стадиях развития [3]. Тетрагаметический химеризм редко встречается у человека и, как правило, сопровождается истинным гермафродитизмом [4].

При внутриутробном переливании крови, пересадке стволовых клеток [5], при аллотрансплантации костного мозга или других органов и тканей может сформироваться искусственный, артифициальный химеризм.

При трансплацентарной трансфузии крови одного близнеца к другому может также формироваться химера, и, по мнению ряда авторов [6], частота такого события составляет 8% при двойнях и 21% при тройнях.

Частота химеризма в популяции точно не известна, и количество наблюдений у человека ограничено. Заподозрить химеризм можно в случае выявления кариотипа с двумя клонами клеток, дискордантными по половым хромосомам, и при других случаях мозаицизма [7, 8], а также при дискордантности по группе крови [9, 10]. Поставить диагноз химеризма можно только по результатам молекулярно-генетического исследования при генотипировании ДНК с помощью высокополиморфных микросателлитных маркеров (STR).

В настоящей работе описано редкое клиническое наблюдение тетрагаметического химеризма, подтвержденное молекулярно-генетическим исследованием, у внешне здорового пациента с азооспермией, обследованного в связи с бесплодием.

Цитогенетические анализы выполнялись в генетической лаборатории ГУ «Республиканского научно-практического центра (РНПЦ) «Мать и дитя».

Кариотипирование проводилось с помощью стандартной методики GTG-banding на препаратах хромосом из лимфоцитов периферической крови.

Молекулярно-цитогенетическое исследование (метод интерфазной FISH) выполнялось на препаратах, приготовленных из клеток буккального эпителия и образца спермы. Для анализа использовалась центромерная ДНК-проба CEPХ(DXZ1)SG/CEPY(DYZ3)SO («Abbott Molecular Inc.», США).

Препарат некультивируемых интерфазных ядер буккального эпителия был получен согласно методике, предложенной T. Lier и соавт. [11].

Для исследования сперматозоидов образец спермы обрабатывали гипотоническим раствором и фиксатором, аналогично методике обработки культуры лимфоцитов периферической крови. Затем полученный осадок раскапывали на предметные стекла, которые высушивали на воздухе, 2 раза помещали в раствор буфера SSC комнатной температуры и выдерживали в течение 10 мин, проводили дегидратацию в этаноле, высушивали на воздухе, помещали в раствор 1M NaOH и выдерживали в течение 3 мин, промывали в холодной воде и высушивали на воздухе.

Молекулярно-генетическое исследование выполнялось в «Научно-практическом центре Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь» и заключалось в генотипировании ДНК с помощью STR-маркеров. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови методом экстракции фенол-хлороформом по общепринятой методике [12], а также экстрагированная из пятен крови, высушенных на FTA-бланках (Watman).

Экстракцию ДНК из пятен крови проводили следующим образом: из FTA-бланка выбивали небольшой диск (d=1,2 мм), отмывали FTA-буфером, затем 2 раза ТЕ-буфером, затем сушили 5 мин при 56 °C в соответствии с рекомендациями [13].

Генотипирование ДНК проводили с использованием ряда наборов [14-17]. Всего исследовано 23 аутосомных STR-маркера ДНК, 10 маркеров половой X-хромосомы и 16 маркеров половой Y-хромо­сомы. Генотипирование образцов ДНК осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием автоматического программируемого термоциклера GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Результаты генотипирования выявляли путем электрофоретического разделения продуктов ПЦР в ДНК-анализаторе Applied Biosystems 3500хl с использованием программного обеспечения GeneMapper.

Описание случая

Пациент П., белорус, 28 лет, проживающий в городе, образование высшее, направлен в ГУ РНПЦ «Мать и дитя» Минска в связи с первичным бесплодием в течение 7 лет. При обследовании по месту жительства у пациента выявлена азооспермия и предложено проведение ЭКО с донорской спермой.

Из анамнеза установлено, что пациент родился от первой беременности, возраст матери на момент родов 22 года. Первая эякуляция была в 13 лет, первый коитус - в 14 лет, пубертатную гинекомастию отрицает. Брак первый, неродственный. Половая жизнь регулярная. Супруге 27 лет, здорова. Профессиональные вредности, прием лекарственных средств, алкоголя, наркотиков, контакт с анилиновыми красителями и др. отрицает. Экстрагенитальные заболевания, в том числе факт пересадки костного мозга, других органов и тканей, стволовых клеток пациент категорически отрицает.

При осмотре: телосложение нормостеническое, рост 168 см, масса тела 76 кг, индекс массы тела 26,9 кг/м². Оволосение по мужскому типу, наружные половые органы - без особенностей, при ультразвуковом осмотре: размеры правого яичка 25×18×15 мм, объем 6,8 см³, размеры левого яичка 25×17×14 мм, объем 6,0 см³. Выявлена киста придатка справа небольших размеров. Проведено исследование гормонального статуса: эстрадиол - 0,141 (0,029-0,194) нмоль/л, пролактин - 272,48 (60-900) мМЕ/л, общий тестостерон - 10,71 (5,9-38) нмоль/л, кортизол - 509,43 (140-600) нмоль/л, ЛГ - 6,22 (1,5-9) МЕ/л, ФСГ - 26,06 (0,8-13) МЕ/л, ТТГ - 0,77 (0,3-4) мМЕ/л, Т4 свободный - 15,0 (10-25) пмоль/л. Таким образом, у пациента был установлен повышенный уровень ФСГ, что свидетельствует о повреждении клеток герминогенного эпителия.

Выполнено цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови и установлен кариотип 46,ХХ[34]/46,ХY[66] (рис. 1).

Пациенту проведено предварительное медико-генетическое консультирование в связи с диагностикой мозаичного кариотипа. Обсуждался вопрос о природе мозаичного кариотипа (химеризм, мозаицизм при синдроме Клайнфельтера), прогнозе потомства и возможности проведения ЭКО с собственным биологическим материалом. Гипотеза мозаицизма при синдроме Клайнфельтера, когда даже в малом проценте клеток отсутствует клон 47,ХХY, показалась маловероятной, что и подтверждают наблюдения других авторов [18-20].

Для уточнения диагноза было рекомендовано провести молекулярно-цитогенетическое исследование (метод интерфазной FISH) буккального соскоба. В ходе диагностики проанализировано 100 интерфазных ядер клеток буккального эпителия. Количественное распределение клеток с женским и мужским кариотипами составило примерно 1:2 - nuc XX[31]/XY [69] (рис. 2).

Для подтверждения данной гипотезы у пациента, сибса мужского пола и их родителей были взяты образцы крови для проведения молекулярно-генетического исследования. Выполнен комплексный молекулярно-генетический анализ STR-маркеров ДНК, которые наследуются по известным схемам и у потомков представляют собой комбинацию признаков, характерных для каждого из родителей [21]. Системы данного типа нашли широкое применение в судебной экспертизе для идентификации личности и при установлении биологического родства. Анализ STR-маркеров активно используется в онкогематологических клиниках при диагностике искусственного химеризма [21, 22]. В случаях выявления спонтанного тетрагаметического химеризма STR-маркеры позволяют проводить качественный и полуколичественный анализ химерной ДНК.

Суть анализа заключалась в сравнительном исследовании полиморфных участков ДНК (аллелей) пробанда, сибса мужского пола и их биологических родителей в аутосомных STR-локусах и STR-локусах половых X- и Y-хромосом. В норме при исследовании аутосомных STR-маркеров в генотипе ребенка выявляется один материнский и один отцовский аллель. При генотипировании маркеров половой Х-хромосомы в норме генетический профиль мужчины представлен одним материнским аллелем (потомок мужского пола наследует Y-хромосому от отца и одну половую Х-хромосому от матери (генетический пол XY).

В ходе генетического анализа образцов ДНК было исследовано 23 микросателлитных аутосомных ДНК-маркера (табл. 1), 10 маркеров половой X-хромосомы (табл. 2) и 16 маркеров Y-хромосомы (данные не показаны).

Четыре аллеля были обнаружены в генотипе пробанда только для 2 аутосомных маркеров (SE33 и Penta E) из 23 исследованных (рис. 3, а).

Из исследованных нами 10 маркеров Х-хромо­сомы 3 аллеля были обнаружены для 3 локусов (HPRTB, DXS10103, DXS10134) в генотипе пробанда (рис. 4).

Во всех локусах Y-хромосомы генотипы пробанда и его сибса совпадают с генотипом их биологического отца (данные не представлены).

Помимо уточнения природы мозаицизма, было решено провести исследование спермы в динамике для решения вопроса о возможности выполнения ЭКО/ИКСИ.

При регистрации спермограммы в нативной сперме сперматозоиды не обнаружены (объем 5 мл). После обработки (центрифугирование 15 мин при 3000 g) в осадке обнаружены единичные подвижные сперматозоиды с нормальной морфологией и большое количество лейкоцитов. Установлен диагноз: криптозооспермия, лейкоцитоспермия. Пациент обследован на инфекции, передаваемые половым путем.

Для оценки прогноза потомства был исследован состав половых хромосом сперматозоидов методом FISH и установлено примерно равное соотношение гамет, несущих Х- и Y-хромосомы: nuc X[34]/Y [27] (рис. 5).

Учитывая воспалительный характер спермограммы, было назначено следующее лечение: юнидокс, трихопол по схеме. Через 1 мес спермограмму повторили, лейкоцитов не обнаружено, а количество сперматозоидов не изменилось. Назначен поддерживающий курс витаминопрофилактики: апилак, трентал, ликарет. При динамическом контроле спермограммы установлена устойчивая криптозооспермия. Назначен еще один курс витаминопрофилактики: анилак, фолиевая кислота, спематон. По завершении курса проведен контрольный анализ спермы, который показал возможность проведения ЭКО/ ИКСИ с собственными сперматозоидами.

Супруга пациента направлена к врачу-репродуктологу. Пациентка прошла инфекционный и гормональный скрининг. С учетом возраста пациентки (27 лет) и выраженного овариального резерва (по 8 антральных фолликулов в каждом яичнике) был выбран протокол с антагонистом и рекомбинантным ФСГ (гонал Ф) дозой 112,5 МЕ. Стимуляция начата на 3-й день менструального цикла, длительность стимуляции составила 8 дней. На 11-й день цикла введен триггер финального созревания ооцитов (овитрель, 250 мкг). На 13-й день цикла под внутривенным наркозом последовательно аспирированы 14 фолликулов, получено 13 ооцитов, из которых 3 были Gv, 1 - MI, 9 - MII. Проведена процедура ИКСИ, получено 9 эмбрионов с нормальным оплодотворением. У 8 эмбрионов наблюдалось деление без фрагментации. На 5-й день культивирования развилось 5 бластоцист и 3 морулы. На 18-й день цикла под контролем ультразвука в среднюю часть полости матки катетером Cook Sydney пациентке перенесены 2 бластоцисты (3AA и 3AB) [23]. Оставшиеся эмбрионы витрифицированы.

Поддержка посттрансфертного периода осуществлялась интравагинальным введением препарата Крайнон 8% ежедневно по одному аппликатору на ночь. На 14-е сутки эмбриотрансфера по уровню β-ХГ в крови 185,2 мЕД/мл диагностирована беременность раннего срока, посттрансфертная поддержка продолжена в тех же дозах. На 21-е сутки эмбриотрансфера в полости матки визуализировано одно плодное яйцо. Посттрансфертная поддержка препаратом Крайнон продолжена до 11-12 нед беременности.

На 11-й неделе беременности проведен пренатальный скрининг беременных на выявление группы рис­ка по синдрому Дауна. Риск оказался низким и составил по синдрому Дауна 1:8293, по синдрому Эдвардса 1:177225, по синдрому Патау 1:802603. При ультразвуковом осмотре патологии у плода не выявлено. В данный момент беременность успешно пролонгирует.

Для исключения истинного гермафродитизма пробанду выполнена магнитно-резонансная томография (МРТ) органов малого таза. По задней стенке мочевого пузыря позади предстательной железы (форма, размеры обычные) определяется объемное образование размером 67×45×22 мм, разделяющееся кзади на две равные части в виде «ласточкиного хвоста», с четкими ровными контурами. По структуре и локализации вышеописанное образование сходно с яичниками. Таким образом, МРТ подтвердило наличие истинного гермафродитизма у нашего пациента, которому была рекомендована консультация онколога для решения вопроса по удалению дополнительных (женских) гонад.

По данным литературы [24], индивидуумы с кариотипом 46,ХХ/46,ХY часто имеют истинный гермафродитизм, который клинически проявляется двойственными гениталиями. Многие из этих пациентов подвергаются хирургическому лечению в детстве или реконструктивным операциям в пубертатном периоде.

У нашего пациента наружные половые органы сформированы правильно, по мужскому типу, однако при проведении МРТ установлен истинный гермафродитизм. Чтобы дифференцировать химеризм от мозаицизма у пробанда, проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ образцов ДНК пробанда, его сибса и их родителей. По результатам генетического анализа в генотипе пробанда выявлено в 2 аутосомных локусах (SE33, PentaE) максимально возможное число аллелей - 4, два из которых получены от матери, а два других имели отцовскую природу происхождения. Еще в 4 аутосомных локусах (D3S158, D7S820, D10S1248, D22S1045) выявлен дополнительный третий аллель. Из 3 выявленных у пробанда аллелей в 2 аутосомных локусах D7S820 и D22S1045 природа третьего аллеля является материнской, тогда как для локуса D10S1248 третий аллель имеет отцовскую природу происхождения. Для локуса D3S1358 природа третьего аллеля не идентифицирована: аллель мог быть получен либо от отца, либо от матери.

При исследовании маркеров Х-хромосомы пробанда максимально возможное число аллелей - 3, было выявлено в 3 локусах (HPRTB, DXS10103, DXS10134): из них 2 аллеля материнского происхождения, 1 - отцовского. Для 3 маркеров (DXS10148, DXS10135, DXS10079) один из 2 аллелей, выявленных в генотипе пробанда, унаследован от отца, а второй от матери. Для маркеров DXS8378, DXS7423, DXS7132 природа второго аллеля не идентифицирована (либо материнское, либо отцовское происхождение).

Таким образом, молекулярно-биологическими методами в генотипе пробанда установлен генетический вклад как отцовских, так и материнских аллелей, что позволяет поставить пациенту диагноз тетрагаметического химеризма [25, 26]. Генетических изменений по аутосомным STR-локусам, а также по локусам Х- и Y-хромосом у родного брата пробанда не выявлено.

К настоящему времени описано около 30 клинических наблюдений химеризма c дискордантностью по половым хромосомам. Среди всех опубликованных случаев единичными являются описания взрослых пациентов без видимых аномалий, обследованных в связи с бесплодием.

Мы нашли похожее на наше клиническое наблюдение мужчины-химеры, обследованного в связи с бесплодием японскими коллегами в 2005 и 2012 г. [25, 27]. Истинный гермафродитизм у пациента был диагностирован в детстве, выполнены гистерэктомия и оофорэктомия слева, а тестикула справа была спущена в мошонку. По достижении половозрелого возраста пациент обратился в центр ЭКО в связи с бесплодием. При наружном осмотре выявлено: половой член маленький, объем правого яичка около 10 мл, при пальпации мягкой консистенции. Левое яичко отсутствует. Проведено исследование гормонального статуса: эстрадиол - 20 (20-59) нг/мл, пролактин - 3,8 (1,5-9,7) нг/мл, тестостерон - 321 (205-1100) нг/дл, ЛГ - 10 (1,3-5,2) мМЕ/мл, ФСГ - 42 (2,9-8,2) мМЕ/мл. Проведена биопсия яичка и получено малое количество неподвижных сперматозоидов, которые были заморожены. Проведены три попытки ЭКО/ ИКСИ с размороженными сперматозоидами. В результате последней попытки наступила беременность, завершившаяся рождением здоровой девочки [25]. Через 2 года после рождения ребенка супружеская пара повторно обратилась для проведения процедуры ЭКО. Паре проведено консультирование, в ходе которого была изложена информация о невозможности выполнения повторной биопсии яичка из-за малого объема последнего. ЭКО было выполнено с размороженными сперматозоидами, полученными при первой (единственной) биопсии [27]. Получены 4 яйцеклетки, две из которых оплодотворены размороженными сперматозоидами, на 3-й день выполнен перенос 2 эмбрионов. Наступила одноплодная беременность, завершившаяся рождением здоровой девочки. Пациенту сделано кариотипирование лимфоцитов периферической крови и FISH-исследование клеток биоптата яичек. Кариотип клеток крови - 46,XX[28]/46,XY [2], исследование биоптата методом FISH показало следующее соотношение клеток: XX[18]/XY[82] [27]. Соотношение клеток с мужским и женским кариотипом оказалось различным в крови и яичке. Таким образом, при очень маленьком клоне клеток 46,ХХ в тестикулах пациенты могут быть мускулинны и фертильны [28].

При истинном гермафродитизме у индивидуумов с женским фенотипом при наличии клона 46,ХХ в гонадах внутренние и наружные половые органы могут быть развиты правильно [29]. Было опубликовано клиническое наблюдение женщины с истинным гермафродитизмом, у которой диагноз оставлен в детском возрасте и произведена резекция гонад, описанных как овотестис. В возрасте 14 мес выполнено удаление гонады справа; диагностирована гонадобластома, при микроскопии - дисгерминома. В 29 лет пациентка забеременела и родила здорового ребенка. Через год после родов у нее была диагностирована большая опухоль оставшейся гонады (овотестис) слева. Опухоль также оказалась дисгерминомой, происходящей из гонадобластомы [30]. M. Verp и соавт. [31] также описали беременность у пациентки - химеры с овотестисами, завершившуюся рождением ребенка. Распределение материнского и отцовского материала, как и в нашем наблюдении, оказалось 2:2.

Данные клинические случаи демонстрируют возможность сохранения фертильности у пациентов с истинным гермафродитизмом при кариотипе 46,XX/46,XY. Однако следует помнить о высоком риске малигнизации измененных гонад у пациентов с Y-хромосомой, имеющих женский фенотип, в таких случаях целесообразно рекомендовать им своевременные профилактические мероприятия.

Среди всех описанных в литературе случаев химеризма в 4 наблюдениях была выявлена дополнительная 21-я хромосома.

T. Sawai и соавт. [32] наблюдали новорожденного с маленьким половым членом, промежностной гипоспадией и гонадами, расположенными в мошонке. Кариотипирование проведено по лимфоцитам периферической крови и фибробластам и получен кариотип 47,XY,+21/46,XX в соотношении клеточных линий 5:294 и 7:178 соответственно. Молекулярно-генетический анализ показал различное происхождение двух клеточных линий.

В ЮАР было проведено исследование большой группы чернокожих южноафриканцев с истинным гермафродитизмом для обнаружения мозаицизма/химеризма. Выявлено 3 случая химеризма. В первом наблюдении, как и у японских коллег, описан ребенок с кариотипом 47,XY,+21/46,XX, являющийся тетрагаметической химерой. В результате молекулярных исследований установлены 2 отцовских и 2 материнских аллеля. Два других пациента имели карио­тип 46,XX/46,XY, у одного из которых химеризм был установлен по результатам молекулярно-генетического исследования, у другого ДНК тестирование не проводилось [33].

Несмотря на уникальность события и сложность диагностики, в литературе упоминается о пренатальном выявлении химеризма.

Так, в одном из наблюдений при кариотипировании амниотической жидкости у плода установлен хромосомный набор 47,XX+21/46,XY. Показанием для инвазивной пренатальной диагностики стала визуализация при ультразвуковом исследовании сандалевидной щели между I и II пальцем стопы у плода. Видимых пороков развития не установлено, гениталии были сформированы по мужскому типу. Молекулярно-генетическое исследование показало соотношение отцовского и материнского материала 2:1, дополнительная хромосома 21 оказалась отцовской [34]. Авторы сделали вывод, что в данном случае химеризм сформировался в результате партеногенетического деления гаплоидной яйцеклетки на две идентичные гаметы с последующим оплодотворением двумя различными сперматозоидами, несущими хромосомные наборы 24,Х,+21 и 23,Y [34, 35]. Показанием для кариотипирования стал ультразвуковой маркер по синдрому Дауна. Таким образом, пренатальная диагностика химеризма может стать случайной находкой [26, 33].

C. Chen и соавт. [36] описали пренатальную диагностику химеризма у плода с двойственными гениталиями, что типично для химеризма. Амниоцентез был выполнен 2 раза и диагноз подтвержден кордоцентезом. Получены кариотипы 46,XX [12] /46,XY [9], 46,XX [15]/46,XY [12] и 46,XX [27]/46,XY [15] соответственно. Родился ребенок с массой тела 3625 г с клиторомегалией, увеличенными большими половыми губами, сросшимися малыми половыми губами и отверстием в урогенитальном синусе. Проведено цитогенетическое исследование экстраэмбриональной ткани и кожи ребенка, и полученные кариотипы согласовались с пренатальными результатами. Молекулярно-генетическое исследование продемонстрировало распределение отцовского и материнского материала 2:1.

Y. Cui и соавт. [10] в 2004 г. описали случай истинного гермафродитизма у тетрагаметической химеры и проанализировали возможные варианты его происхождения. Анализ хромосом выполнен по лимфоцитам периферической крови, фибробластам кожи и тканям биоптата гонад с использованием метода FISH. Во всех культурах клеток на интерфазных ядрах выявлены клоны клеток с XX и XY хромосомами. Клеточная линия 46,ХY преобладала во всех тканях, кроме биоптата гонад желтого цвета. Соотношение материнского и отцовского материала составило 1:2. Два вида ткани из биоптата гонад были тестированы гистопатологически. Ткань желтого цвета оказалась яичниковой, а белого - тестис.

Таким образом, наше клиническое наблюдение подтверждает, что пациенты с кариотипом 46,XX/46,XY могут быть фертильны и иметь успешные беременности с использованием методов вспомогательных репродуктивных технологий. Комплексное исследование, включающее цитогенетический, молекулярно-цитогенетический анализы различных тканей и молекулярно-генетическое тестирование коротких повторяющихся последовательностей ДНК, помогает установить природу двойственного кариотипа. Такое обследование необходимо проводить во всех случаях истинного мозаицизма и гермафродитизма.