Проблема бесплодия имеет медицинское, социально-демографическое и экономическое значение в большинстве развитых стран мира. Для преодоления бесплодия в рамках впомогательных репродуктивных технологий используется экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) преовуляторных ооцитов и переноса дробящихся эмбрионов в полость матки пациентки [1]. Тем не менее частота развития беременности при ЭКО сравнительно низка — 25—30%, причем за последние годы этот показатель значительно не меняется [2]. Это связано с большим разнообразием факторов, влияющих на результат имплантации после пересадки эмбриона [3]. В их числе указываются низкий овариальный резерв, возраст супругов, избыточная масса тела, эндокринные нарушения в системе гипоталамус—гипофиз—яичники, надпочечниковой и тиреоидной системах, тромбофилия, снижение имплантационных свойств эндометрия, количество и качество переносимых эмбрионов, а также кратность переносов [4—6].

Считается, что неудачи ЭКО могут быть обусловлены как тромбогенностью самой медицинской технологии (эстроген-гестагеновая нагрузка), так и возможным наличием у женщин известных факторов тромбогенного риска и склонности к внутрисосудистому свертыванию крови/тромбофилии. Тем не менее анализ литературы показывает неоднозначность мнения специалистов относительно роли ряда мутаций и полиморфизмов генов — участников системы гемостаза и антифосфолипидного синдрома (АФС) в развитии бесплодия и неудач возникновения ЭКО [7—9]. Мы, как и ряд отечественных авторов [10, 11] считаем, что эти ассоциации существуют, но более перспективным подходом в этой области должен быть учет не столько наличия тех или иных врожденных и приобретенных факторов тромбогенного риска/тромбофилии, сколько мониторирование результатов «глобальных» методов исследования гемостаза, описывающих состояние тромботической готовности [12]. С этой точки зрения заслуживает внимания тест генерации тромбина (ТГТ). Последний, как известно, характеризует динамику и интенсивность образования тромбина в плазме крови — ключевого фермента гемостаза и относится к интегральным показателям состояния системы свертывания крови [13, 14]. Недавно опубликованы интересные данные об особенностях ТГТ во время прохождения процедуры ЭКО [15]. В этой работе полученные в 31 случае сдвиги в показателях теста были интерпретированы как следствие эстрогеновой нагрузки и синдрома гиперстимуляции яичников и расценены как важные для прогнозирования тромбоза и мониторирования ЭКО. Наряду с этим повышенный интерес исследователей сегодня вызывает снижение фибринолитической активности крови (гипофибринолиз), часто определяющееся при привычном невынашивании беременности, АФС, тромбозе глубоких вен нижних конечностей, приеме оральных контрацептивов и др. [16, 17]. Нарушения в этой системе рассматриваются как новые факты в объяснении механизмов патогенеза тромбозов [18]. Анализ системы фибринолиза при прохождении процедуры ЭКО чаще всего выявляет снижение фибринолитических реакций в связи с уменьшением активности тромбинактивируемого ингибитора фибринолиза (TAFI), тканевого активатора плазминогена (t-PA) и повышением уровня его ингибитора — ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1), зависящих от деятельности эндотелия кровеносных сосудов [16, 17].

Одной из методик, направленных на снижение тромбогенности и повышение эффективности ЭКО, может быть применение гепаринов [19, 20]. Однако пока не сформированы показания для отбора женщин, нуждающихся в гепаринопрофилактике в цикле ЭКО. Коррекция гипофибринолиза при ЭКО также представляет определенные трудности, поскольку в литературе нет описаний успешного применения соответствующей лекарственной терапии. Тем не менее в течение примерно 50 лет известно, что некоторые стимулы (венозная окклюзия, физическая нагрузка, десмопрессин) вызывают ускорение фибринолитических реакций, обусловленное быстрым увеличением активности t-PA в крови в связи с его усиленной секрецией эндотелием кровеносных сосудов. Наше внимание привлекли эффекты перемежающей пневматической компрессии (ППК), используемые для снижения частоты послеоперационного венозного тромбоза. О повышении фибринолитической активности крови и t-PA после механического воздействия на сосуды свидетельствуют результаты ряда авторов [21, 22]. В то же время данных о динамике активности PAI-1 при этом в литературе мы не нашли. Между тем именно соотношение активности этих важнейших участников фибринолитической системы определяет ее эффективность в целом. Как правило, ППК проводится на нижних конечностях, однако в некоторых работах получены хорошие результаты при компрессии рук [23], и хотя масса верхних конечностей меньше, чем нижних, показано, что вены предплечья содержат значительно больше t-PA, чем вены ног [24]. В нашей работе именно этот вариант ППК был использован с целью активации фибринолитических реакций при ЭКО и наличии соответствующих показаний.

Цель настоящей работы — определение роли нарушений в системе гемостаза и гипофибринолиза в возникновении неудач ЭКО, а также оценке результатов их терапевтической коррекции.

В рамках проспективного анализа были получены данные о 327 женщинах, обратившихся в Центр сохранения и восстановления репродуктивной функции при Краевой клинической больнице Барнаула в период с 2010 по 2012 г. для прохождения программы ЭКО в связи с бесплодием. Представленное исследование было одобрено Региональным этическим комитетом Алтайского медицинского университета, и все участники дали свое информированное согласие.

Для индукции суперовуляции использовались стандартные протоколы (классический длинный протокол, протокол с антагонистами). Наступление беременности диагностировали путем определения гормона беременности β-хорионического гонадотропина человека (β-чХГ) на 14-е сутки после переноса эмбрионов.

Исследование состояло хронологически из двух этапов. На первом из них (наблюдательном) проведено обследование 163 женщин в цикле ЭКО, отобранных произвольно, методом случайной выборки (1-я группа). На втором этапе работы обследовались 164 женщины также произвольной выборки (2-я группа), из которых 98 пациенткам проводилась коррекция системы гемостаза и фибринолиза при определении соответствующих показаний — повышенной генерации тромбина и/или сниженной фибринолитической активности плазмы крови (управляемая группа, или группа с терапевтическим воздействием на гемостаз и фибринолиз) (рис. 1).

Критерием отбора пациенток в исследование стало бесплодие любой формы, не поддающееся традиционной терапии. Критерии исключения: соматические заболевания, являющиеся противопоказаниями для вынашивания беременности и родов, врожденные пороки развития или приобретенные деформации полости матки, при которых невозможна имплантация эмбрионов или вынашивание беременности; опухоли яичников, доброкачественные опухоли матки, требующие оперативного лечения, злокачественные новообразования.

Все пациентки принадлежали к европеоидной расе, их возраст составил от 21 года до 42 лет (табл. 1).

Имелось некоторое межгрупповое различие в клинической характеристике женщин, участвовавших в исследовании. Во 2-й группе было больше пациенток, страдающих хроническим эндометритом и имеющих более низкий овариальный резерв. Кроме того, среди причин бесплодия в данной группе преобладал мужской фактор.

Обследование проводилось 3 раза — за 1—2 дня до начала управляемой гиперстимуляции яичников и вступления в программу ЭКО (1-я точка наблюдений), за 2—3 дня до пункции фолликулов яичника (2-я точка наблюдений) и на 12—14-й день после переноса эмбрионов (3-я точка наблюдений), когда исход в части наступления беременности был определен с помощью оценки уровня β-чХГ.

Пробы венозной крови брали из локтевой вены в пробирки VACUETTE с буферным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Кровь центрифугировали при 1400 g в течение 15 мин при комнатной температуре. Пробы плазмы исследовались, как правило, в течение 2 ч после получения. Перед проведением иммуноферментного анализа и оценкой эндогенного тромбинового потенциала плазму хранили при –40 °С в течение от 1 сут до 1 мес.

Измерение эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) проводилось в тесте генерации тромбина (ТГТ). Показано, что ТГТ позволяет с высокой точностью измерять динамику как образования, так и инактивации тромбина [13, 14]. Для выполнения данного метода использовался планшетный флюориметр Fluoroskan Ascent ThermoFisher SCIENTIFIC (Финляндия), с программным обеспечением Thrombinoscope 3.0.0.26. Коагуляция исследуемой плазмы крови осуществлялась в присутствии 5 пмоль тканевого фактора и 4 мкмоль фосфолипидов, генерация тромбина регистрировалась посредством измерения сигнала флуорогенного субстрата Z-Gly-Gly-Arg-АМС. Определялись следующие показатели: ЭТП (эндогенный тромбиновый потенциал, нмоль/мин) — площадь под кривой генерации тромбина, учитывающей особенности инактивации этого фермента, и ПКТ (пиковая концентрация тромбина, нмоль/л) — максимальная концентрация тромбина в единицу времени.

Определение активности t-PA и PAI-1 осуществлялось методом иммуноферментного анализа с наборами реагентов t-PA Combi Actibind ELISA Kit и Actibind PAI-1 ELISA, «Тechnoclone» (Австрия), полученные данные сопоставляли между собой. С учетом того, что эти важные участники фибринолитических реакций являются антагонистами по отношению друг к другу и имеют общее происхождение (эндотелий кровеносных сосудов), рассчитывался индекс активирующей фибринолиз способности эндотелия (индекс АФСЭ) по формуле:

Определение времени лизиса сгустка (ВЛС). Использовалась модификация метода Kowarzyk and Buluk (1954), где в качестве активатора фибринолиза мы применяли каолин, активирующий контактную фазу свертывания и запускающий цепочку активации: фактор ХIIа→калликреин→плазмин (набор реагентов Фибринолиз-тест фирмы «Технология-Стандарт», Барнаул). Диапазон нормальных колебаний ВЛС в этой модификации составляет 8—12 мин.

Определение концентрации D-димеров в плазме крови проводилось с помощью набора реагентов D-dimer Red-700, «Helena Bioscience» (UK) и коагулометра SYSMEX CA-1500, «Sysmex» (Япония).

Определение мутаций и полиморфизмов генов, предрасполагающих к тромбозу, выполнялось методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на оборудовании ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия). Определялось носительство мутаций F5 Лейден (1691G>A), FII (20210G>A), полиморфизмов гена MTHFR (C677>Т) и гена ингибитора активатора плазминогена PAI 1 (5G>4G).

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программ Microsoft Offis Exel 2003 и Statistica 6.1. Результаты исследования оценивались методом вариационной статистики с применением критериев t-Стьюдента и Фишера. Статистически значимыми принимались различия при p<0,05.

В начале работы для нас было важным изучить сдвиги в системе гемостаза и фибринолиза, которые могли бы иметь значение для исходов ЭКО (в отношении наступления беременности) и установить тот их количественный уровень, который мог бы помочь в целях отбора группы женщин, нуждающихся в коррекции нарушений гемостатических и фибринолитических реакций. В результате было определено, что генерация тромбина в наблюдательной группе женщин в значительной степени увеличивается после начала контролируемой гиперстимуляции яичников в ответ на возрастание уровня эстрогенов в крови, что согласуется с недавно опубликованными данными [15]. При этом установлено, что степень повышения генерации тромбина различна при успешных и неуспешных исходах ЭКО (табл. 2).

Наиболее значимым неблагоприятным признаком был показатель ЭТП, границы диапазона которого при различных исходах ЭКО в середине цикла не пересекались даже при допущении интервала значений M±3SD (рис. 2).

Уровень D-димеров, известного маркера образования фибрина и фибринолиза, показал менее яркие различия в подгруппах 1.1 и 1.2, хотя и был несколько большим, по средним данным при неуспешном исходе ЭКО (см. табл. 2). Средние значения этого показателя у практически здоровых женщин фертильного возраста в условиях нашего центра составили 205,3 нг/мл (М±2SD 148,5—262,1 нг/мл). Соответственно полученные результаты уровня D-димеров на 2-й точке наблюдений находились в пределах допустимых значений или в незначительной мере превышали их. В связи с этим в дальнейшем мы не останавливались на низкоинформативных показателях данного теста.

Сложнее было определиться с пограничным уровнем значений, отражающих снижение активности фибринолитических реакций и позволяющих выявлять пациенток, нуждающихся в коррекции гипофибринолиза. Недавние важные работы в этом направлении свидетельствуют, что гипофибринолиз встречается у части женщин, проходящих процедуру ЭКО, но это нарушение имеет место изначально, а не возникает в процессе управляемой гормональной стимуляции [15, 16]. Мы получили схожие данные, согласно которым угнетение фибринолиза действительно свойственно части женщин еще до вступления в цикл ЭКО и мало меняется на его протяжении. С другой стороны, анализ динамики активности t-PA и PAI-1, индекса их интегральной оценки — АФСЭ и ВЛС в наших исследованиях выявил более значительные сдвиги при неудаче ЭКО, хотя разница средних значений изученных показателей была недостоверной (p>0,05) (cм. табл. 2). Тем не менее мы учли два обстоятельства. Первое — средние значения индекса АФСЭ, определенные нами в группе из 10 практически здоровых добровольцев женского пола (в возрасте от 20 до 23 лет), оказались равными (М±SD) 11,0±3,3%, второе — при неблагоприятном результате ЭКО в 1-й (наблюдательной) группе пациенток перед вхождением в ЭКО (1-я точка) сниженный индекс АФСЭ (менее 11%) был выявлен в 93,5% случаев (у 43 из 46 женщин) против 4,1% случаев (у 2 из 49) успешного наступления беременности (p<0,000001) (табл. 3).

Показания примененного варианта оценки ВЛС мы использовали в виде метода общего контроля за фибринолизом и не рассматривали в качестве потенциального критерия отбора женщин для прохождения терапевтического воздействия в связи со сложностями его межлабораторной стандартизации. Таким образом, при отборе женщин для прохождения ППК нами выбран расчетный показатель индекса АФСЭ, учитывающий соотношение активности t-PA и PAI-1 со значением менее 11%.

Возвращаясь к представленным выше данным, полученным при исследовании системы гемостаза и фибринолиза у пациенток 1-й (наблюдательной) группы (n=163), можно видеть значительное соответствие выявленных нарушений тем или иным результатам ЭКО (см. табл. 3). Неблагоприятные сдвиги в данных системах крови отмечались у 114 (70%) из 163 женщин 1-й группы. В целом, результативность цикла ЭКО была равной на этом этапе исследований (34,4%), однако определенные дефекты гемостаза и фибринолиза способствовали снижению числа эпизодов успешного наступления беременности с 95,9% (у 47 из 49 женщин подгруппы 1.1) до 7,9% (у 9 из 114 пациенток подгруппы 1.2), т.е. в 12,1 раза (p<0,000001).

Результаты терапевтического воздействия на систему гемостаза и фибринолиза, использованного для увеличения числа благоприятных исходов ЭКО

Коррекция системы гемостаза при избыточной генерации тромбина предусматривала в нашей работе проведение гепаринопрофилактики путем введения фраксипарина подкожно по 0,3 мл 2 раза в сутки на протяжении 12—14 дней. Решение о начале терапии основывалось на установлении факта сверхпорогового увеличения основных показателей генерации тромбина — ЭТП (более 1900 нмоль/мин) и/или ПКТ (более 360 нмоль/л), определенных на 2-й точке наблюдений.

Воздействие на сосудистую стенку с целью повышения активности фибринолиза проводилось с помощью ППК. В настоящем исследовании был использован прибор Пневмомассажер ПМ-01 (Россия) с наложением семикамерной компрессионной шины в область плеча в режиме волновой компрессии со следующими характеристиками: время поддержания давления в камерах манжеты от 5 до 90 с; давление сжатого воздуха, подаваемого в камеры, от 30 до 150 мм рт.ст., 45 циклов волновой компрессии с запоминанием на протяжении 30 мин. Компрессия выполнялась в виде курса из 8 сеансов (2 раза в неделю) с 30-минутным наложением манжеты аппарата на левую или правую руку. Основанием для начала такой терапии являлось снижение индекса АФСЭ ниже 11%, определенное у пациенток непосредственно перед началом программы ЭКО (1-я точка наблюдений).

По результатам проведенных исследований, общее число благоприятных исходов ЭКО во 2-й (управляемой) группе составило 41,5%, т.е. увеличилось всего на 7,1% в сравнении с аналогичным показателем в 1-й группе (34,4%; p<0,21) (см. табл. 3, табл. 4).

Однако необходимо учесть, что 40 пациенток (подгруппа 2.2.4) не прошли предложенную нами терапию, хотя показания к ней имелись по приведенным выше критериям. Если суммировать исходы ЭКО у всех участвовавших в исследовании женщин с показаниями для проведения лечения (табл. 5),

Таким образом, обоснованное назначение низкомолекулярного гепарина при высокой генерации тромбина на 2-м этапе исследований способствовало увеличению числа случаев наступления беременности в 6,4 раза (p<0,0001), изолированное применение курса ППК — в 3,0 раза (p<0,007), а сочетание гепаринопрофилактики с ППК — в 6,5 раза (p<0,0001).

Эволюция показателей, отражающих дефекты гемостатических и фибринолитических реакций пациенток, нуждающихся в терапевтическом воздействии, освещена в табл. 6—8.

Очевидно, что предпринятое лечение оказывало благоприятное воздействие на интенсивность генерации тромбина и фибринолиз, причем индекс АФСЭ, отражающий фибринолизактивирующую способность сосудистой стенки, увеличился примерно в 2 раза.

Найдено, что при изолированном воздействии ППК у женщин с исходным, до вхождения в цикл ЭКО гипофибринолизом имелось резкое увеличение индекса АФСЭ. Примечательно отметить, что вазокомпрессия приводила не только к достоверно выраженному повышению активности t-PA, но и к снижению активности PAI-1 в конце цикла ЭКО. Следующая находка заключалась в том, что применение ППК приводило к усилению генерации тромбина, что наиболее четко прослеживалось по показателю ПКТ.

Обобщая полученные результаты, можно отметить, что избыточная генерация тромбина и угнетение фибринолитических реакций, наблюдаемые в 3 (у 77,1% обратившихся женщин) из 4 случаев, фатально снижают эффективность ЭКО, и эти сдвиги имеют сопоставимое значение в сравнении с традиционными для репродуктологии факторами риска. В этом наше исследование подтверждает ряд недавних сообщений, посвященных данной проблеме [15—17, 25]. Тем не менее мы продвинулись вперед, поскольку были установлены сверхпороговые значения ряда лабораторных параметров, позволяющих не только отслеживать повышенную склонность к свертыванию крови и/или гипофибринолизу [12], но и на их основе отбирать пациенток с высоким риском неудачи ЭКО для проведения терапевтической коррекции выявленных нарушений. В итоге, с учетом данных теста калиброванной тромбографии (по показателям ЭТП и ПКТ) женщинам назначался фраксипарин, что привело не только к эффективному снижению генерации тромбина, но и к значительному увеличению (в 6,4 раза) положительных исходов ЭКО.

Нами впервые предложен и опробован метод и режим ППК для коррекции гипофибринолиза у женщин в цикле ЭКО. Показано, что вазокомпрессия в этих случаях приводит к увеличению активности t-PA и снижению активности PAI-1, что отчетливо проявлялось резким увеличением расчетного индекса АФСЭ, ускорением ВЛС и увеличением числа положительных исходов данной репродуктивной технологии в 3 раза. Тем не менее была не вполне понятна причина динамического снижения активности PAI-1 в ходе проведения курса ППК, хотя это и явилось благоприятным результатом вазокомпрессии. Негативным последствием ППК оказался феномен повышения генерации тромбина, не описаный ранее. Проведенные расчеты показали, что ППК во всех случаях должна сочетаться с назначением гепаринов, что позволит получать оптимальные клинические результаты. В нашей работе комбинирование вазокомпрессии с профилактическими дозами низкомолекулярного гепарина действительно способствовало увеличению числа наступивших беременностей в 6,5 раза (с 7,1 до 45,9%), причем в наиболее проблемной группе пациенток.

Среди всех обследованных только у 7 (2,2%) женщин выявлены редкие мутации — F5 Лейден (1691G>A) и F II (20210G>A), ассоциирующиеся с тромбозами, неудачами беременности и репродуктивных технологий. Поэтому мы не смогли определить их роль для исходов ЭКО. Более часто встречающиеся полиморфизмы гена MTHFR (C677>Т) и гена PAI-1 (5G>4G) по сравнению с результатами исследования [26] не показали своей значимости.

Выполненные исследования свидетельствуют, что существуют возможности прогресса в улучшении результатов ЭКО на основе выявления и коррекции патологии гемостаза и фибринолиза. Приведенные данные могут послужить основой для выработки новых рекомендаций и стандартов, позволяющих улучшить эффективность современных репродуктивных технологий.