Флавоноиды, чья антиоксидантная активность препятствует развитию окислительного стресса, влияют на сигнальные и регуляторные клеточные системы [1]. Гипогликемические и гиполипидемические эффекты различных флавоноидов и их сочетаний в растительных экстрактах широко исследуются in vitro и in vivo, а также при клинических состояниях [2, 3]. Современные подходы, направленные на повышение всасывания и биодоступности полифенолов пищи, включают широкий спектр технологических решений, касающихся состава и физико-химических свойств пищевой матрицы, которая, являясь средством доставки полифенольных соединений, одновременно может повышать их устойчивость к ферментативному расщеплению в ЖКТ, возможность всасывания в биологически активной форме, биодоступность и, в конечном итоге, эффективность [4]. Пережевывание во рту инициирует высвобождение полифенолов из пищевой матрицы, а пищеварительные ферменты продолжают разрушать ее в желудке, тонкой и толстой кишке. На этот процесс влияет состояние различных отделов пищеварительной системы (рН, функционирование различных клеточных транспортеров, взаимодействие с микрофлорой кишечника) [5]. Высвобождение полифенолов из пищевой матрицы существенным образом зависит от переработки исходного растительного пищевого сырья, меняющего структуру стенок растительных клеток и их свойства [6], поскольку клеточные стенки растений в значительной степени устойчивы к деградации в верхнем отделе кишечника, препятствуя высвобождению биологически активных соединений [7].

Среди многих факторов, определяющих биодоступность полифенолов, особый интерес представляет их взаимодействие с другими нутриентами (как в составе матрицы, так и вне ее) [5, 8]. Образование комплексов полифенолов с белками существенным образом влияет на пути метаболизма, что модифицирует их биологическое действие.

Приведен краткий обзор исследований, касающихся факторов, влияющих на взаимодействия полифенол-белок, характеристики образующихся комплексов, и возможных перспектив включения их в состав специализированных пищевых продуктов.

Использованные базы данных PubMed; Google Scholar. Ключевые слова поиска: polyphenols bioavailability; enhancement of polyphenol bioavailability; polyphenol binding to proteins; polyphenol-protein complexes; polyphenol binding to food components.

В работе P. Bandyopadhyay и соавт. [9] обсуждаются возможности использования ряда современных аналитических методов (флюоресценции, кругового дихроизма, динамического светорассеивания, инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье, масс-спектрометрии, изотермической титрационной калориметрии и некоторых других) для характеристики процесса образования комплексов белок-полифенол. В этом же обзоре широко представлены количественные значения параметров, характеризующих связывание (константа связывания, свободная энергия, энтальпия), и конформационные изменения при взаимодействии различных индивидуальных полифенолов и белков. Взаимодействие полифенолов с белками зависит от структуры как полифенола, так и белка, а также рН раствора, ионной силы, температуры, соотношения полифенол/белок [10—12]. При связывании имеют место гидрофобные межплоскостные взаимодействия ароматических групп аминокислотных остатков белка и полифенолов и/или гидроксильных групп полифенолов с белковой цепью [9]. Такое связывание может явиться причиной изменения пространственной структуры белка и оказывать влияние на биодоступность обоих компонентов. Согласно ряду исследованиий [13—15], связывание полифенолов с различными белковыми цепями приводит к полному или частичному «разворачиванию» последних. Имеются сведения и о конформационном переходе белка слюны IB5 из «развернутого» в «свернутое» состояние при связывании эпигаллокатехин галлата (ЭГКГ), чем и обусловлено ощущение его «терпкого» вкуса [16, 17]. Для ряда полифенольных соединений характерно повышенное сродство к белкам с высоким содержанием пролина [10]. Установлено существенно более высокое значение константы связывания мономеров галлатов, таких как эпикатехин галлат (ЭКГ) и ЭГКГ, с поли (L-пролином), чем с бета-глобулином, альфа-казеином и бета-казеином [10, 18, 19]. Остатки пролина, распределенные по поверхности полости белка, действуют как сайты связывания для полифенолов. Аффинность различных белков к одним и тем же полифенольным соединениям зависит от особенностей их третичной структуры. Большая полость глобулярного белка сывороточного альбумина крупного рогатого скота (БСА) больше «подходит» для крупных молекул полифенолов (таких как ЭГКГ), чем для меньших по размеру молекул (например, катехина), поскольку последние не могут образовывать много связей в большой полости. С другой стороны, альфа-амилаза слюны человека (HSα-А), также являясь глобулярным белком, имеет мультидоменную структуру, причем каждый из доменов представляет собой полость небольшого объема, что способствует связыванию малых молекул полифенолов [20].

Очевидно, что изменения в третичной структуре белковой макромолекулы при связывании полифенолов могут влиять на ее физиологическую активность. Имеется обширная литература [21—24] о денатурирующем действии полифенолов на различные ферменты, такие как тирозиназа, пероксидаза, трипсин, декарбоксилаза и некоторые другие.

Так, при изучении комплекса мирицетина с панкреатической α-амилазой человека было показано, что мирицетин образует в общей сложности 8 водородных связей в активном центре фермента. При этом 4 из них — это связи с ключевыми каталитическими аминокислотными остатками — Asp197, выступающим в качестве каталитического нуклеофила при гидролизе субстрата, и Glu233, играющего роль кислотно-основного катализатора при гидролизе субстрата. Кроме того, связывание мирицетина влияет на Asp300 — ключевой аминокислотный остаток активного центра, который оптимизирует ориентацию молекулы субстрата [25].

Наибольшую ингибирующую активность по отношению к липазе проявляют катехины, являясь эффективными ингибиторами данного фермента in vitro в наномолярных концентрациях [26—29]. В частности, показано, что ЭГКГ может выступать в роли неконкурентного ингибитора липазы с константой связывания k_a = 2,7·10⁴ моль/л. Комплекс полифенол-белок образуется за счет водородных связей и электростатических взаимодействий вне активного центра и влияет на активность липазы путем изменения ее третичной структуры [30].

Ингибирование амилазы, равно как и глюкозидазы, позволяет контролировать расщепление крахмала и постпрандиальную гликемию [31], что важно для больных сахарным диабетом, а ингибирование липазы потенциально может быть использовано в диетотерапии ожирения [32]. В то же время неблагоприятное ингибирующее действие полифенолов на ферменты пищеварительной системы, рассматриваемое как антиалиментарный фактор [9], может быть минимизировано использованием определенных белков, снижающих взаимодействие полифенол-белок. О таком эффекте свидетельствуют результаты исследования, в котором высокоочищенный белок слюны значительно повышал концентрацию ЭГКГ, необходимую для 50% ингибирования (Ic50) альфа-амилазы, химотрипсина, трипсина, лактазы [33].

Как известно, инкретины повышают уровень инсулина в плазме после приема пищи и улучшают гомеостаз глюкозы. Терапия, основанная на их применении, может сыграть свою роль в замедлении прогрессирования сахарного диабета 2-го типа [34]. В этом плане существенный практический интерес представляют скрининговые исследования in silico, направленные на выявление ингибиторной активности различных полифенолов пищи по отношению к ферментам, разрушающим инкретины.

Виртуальный скрининг широкого спектра химических соединений с целью установления их возможного взаимодействия с конкретными биологическими мишенями, играющими роль при развитии сахарного диабета 2-го типа, позволяет последовательно «отсеять» потенциально токсичные структуры, обладающие низкой способностью к всасыванию, распределению, метаболизации и выведению из организма, а затем отобрать структуры, обладающие наибольшим электростатическим и структурным сродством к мишени [35]. Испанские исследователи [36] показали возможности выявления in silico молекул природного происхождения, потенциально обладающих ингибиторной активностью по отношению к кишечному ферменту — дипептидилпептидазе IV (DPP-IV). Этот фермент расщепляет два наиболее мощных гормона инкретинового ряда: глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (ГИП) и глюкагоноподобный пептид (ГПП-1), секреция которых снижена у лиц, страдающих диабетом 2-го типа. Была предсказана высокая ингибирующая активность 446 из 89 165 молекул, встречающихся в природе, антидиабетические свойства которых ранее были неизвестны [37]. Был проведен скрининг натуральных экстрактов для определения тех, в составе которых присутствовал бы хотя бы один потенциальный ингибитор DPP-IV [35]. Наиболее примечательным, в контексте данной статьи, является наличие потенциального ингибитора DPP-IV (производного эпикатехина) в составе экстракта из косточек винограда. Методами молекулярного докинга и ингибиторного анализа in vitro показано, что ингибиторами DPP-IV являются антоцианы и другие полифенолы из ягод, цитрусовых, соевых бобов [38]. В частности, установлено, что ресвератрол является конкурентным ингибитором DPP-IV, а лютеолин и апегинин неконкурентно связываются с DPP-IV [39]. Эти исследования открывают новые возможности целенаправленного выбора полифенолов пищи для диетической коррекции и профилактики сахарного диабета 2-го типа.

Низкая биодоступность различных полифенольных соединений может быть следствием «выведения» их метаболитов из эпителиацитов обратно в просвет кишечника семейством АВС-транспортеров (ATP Binding Cassette), в том числе Р-гликопротеина (Р-gp) и белка резистентности к терапии рака молочной железы (BCRP), расположенных на апикальной мембране клетки [40—44]. Совместное поступление ингибиторов этих клеточных транспортеров и полифенолов способствует «удерживанию» последних в клетке [40, 45]. Привлекают внимание возможности использования ингибирующего влияния одних флавоноидов на функционирование транспортеров кишечных клеток для повышения биодоступности других флавоноидов [46]. Это было продемонстрировано в опытах in vitro [47], с добавлением изофлавонов (генистеина, дайдзеина и биоханина) к клеточной культуре MDK2, что приводило к увеличению содержания в клетках [³Н]-ЭГКГ. Изофлавоны взаимодействовали с так называемыми «белками, ассоциированными с множественной лекарственной устойчивостью» (MPR), являющимися АТФ-зависимыми эффлюксными транспортерами.

Толстая кишка является основным местом всасывания полифенолов, а ферменты, продуцируемые микрофлорой толстой кишки, играют главную роль в катаболизме этих соединений. Образующиеся метаболиты всасываются и через воротную вену, транспортируются в печень, где подвергаются реакциям конъюгации; конъюгированные метаболиты транспортируются в кровоток и выводятся с мочой, а невсосавшиеся метаболиты выводятся с фекалиями. Эти представления могут быть проиллюстрированы, результатами исследования метаболизма полифенольных соединений у здоровых добровольцев и пациентов с выведенной илеостомой [48]. При одноразовом приеме здоровыми добровольцами 350 мл сока грейпфрута (528 микромолей полифенольных соединений) концентрации метаболитов в плазме варьировали от 1 до 355 нмоль/л, а экскреция с мочой — от 0,3% для антоцианинов до 24% для метаболитов от введенного количества. При введении того же самого сока через илеостому 40% от исходного количества полифенольных соединений, вытекающих из подвздошной кишки, было обнаружено в интактной форме за 24 ч наблюдения. Эти данные свидетельствовали о том, что у здоровых добровольцев полифенольные соединения перемещались из тонкой кишки в толстую, где подвергались действию микробиоты, в результате чего расщеплялись до простых феноловых кислот, перед тем как всосаться и поступить через портальную вену в кровоток или экскретироваться с мочой.

Метаболические превращения различных полифенольных соединений под действием ферментов микрофлоры толстой кишки являются предметом многочисленных исследований. Показано, что ферменты, продуцируемые бактериями Clostridium orbiscindens и Eubacterium ramulus, способны разрушать С-кольцо в кверцетине и нарингенине. Enterococcus casseliflavus продуцирует фермент, дегликозилирующий кверцетин-3-глюкозид [49]. Катаболизм (-)эпикатехина начинается с разрыва C-кольца, что приводит к образованию 1-(3’, 4’)-дигидроксифенил-3-(2’, 4’, 6’-тригидрокси)пропан-2-ола, который в свою очередь превращается в 5-(3’, 4’)-дигидроксифенил-валеролактон. На следующем этапе валеролактоновое кольцо деградирует до 5-(3’, 4’)-дигидроксифенилвалериановой кислоты, а затем подвергается бета-окислению до 3-гидроксифенилпропионовой кислоты. Альфа-окисление этого соединения приводит к образованию 3-гидроксифенилуксусной кислоты. В процессе деградации ЭГКГ и ЭКГ галлоильный фрагмент удаляется под действием эстеразы и образующаяся галловая кислота декарбоксилируется до пирогаллола [50]. In vitro при инкубировании сока грейпфрута с образцами фекалий были обнаружены значительные количества 16 различных метаболитов в форме ароматических и фенольных соединений [51]. Взаимодействуя с кишечной микрофлорой, интактные полифенолы и их метаболиты могут благоприятно влиять на состояние самой микробиоты. В опытах in vitro грамположительные анаэробные бактерии Eubacterium ramulus, изолированные из фекалий человека, используют кверцетин в качестве субстрата роста, что приводит к образованию 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты как главного продукта ферментации. Это же подтверждают испытания с привлечением добровольцев: потребление высоких доз кверцетина и рутина стимулировало рост популяции E. ramulus в фекальной флоре [52]. О возможности профилактического эффекта полифенолов, связанного с состоянием кишечной микрофлоры, свидетельствует исследование, в котором 3-недельное добавление 0,5% полифенолов к высокожировой диете крыс снижало содержание в фекалиях вторичных желчных кислот — факторов риска рака толстой кишки [53].

Повышение биодоступности флавоноидов — это магистральный путь создания высокоэффективных специализированных пищевых продуктов антидиабетической направленности. В отличие от экспериментов in vitro (в основном на культурах клеток) результаты клинических исследований априори существенно зависят от биодоступности полифенольных соединений, что в ряде случаев не позволяет достигать благоприятных эффектов. Действительно, после обычного приема пищи концентрация метаболитов фенольных соединений в крови редко превышает 1 нМ, хотя в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) может превышать 1 мМ [4]. Согласно многочисленным публикациям [54], новые, обладающие большей биодоступностью рецептуры полифенольных соединений и обогащенных полифенолами экстрактов лучше защищены от деградации в пищеварительном тракте и характеризуются более высокой стабильностью и повышенной фармакологической активностью по сравнению с традиционными композициями. Взаимодействие полифенолов с пищевыми белками, пищеварительными ферментами и клеточными транспортерами белковой природы в ЖКТ интенсивно изучается, но, к сожалению, в отечественной литературе [5, 9, 55] эти вопросы отражены явно недостаточно. Для прогнозирования возможного изменения биодоступности как белков, так и полифенолов, представляют существенный интерес исследования их взаимодействий на молекулярном уровне и соответствующих структурных изменений. Связывание полифенолов белками зависит от первичной структуры белковой макромолекулы, пространственного распределения аминокислотных остатков, ответственных за связывание полифенолов, и ряда условий, при которых происходит взаимодействие. Исследования in silico возможного ингибирования дипептидилпептидазы-IV и двусторонних взаимодействий с микробиотой кишечника, открывают потенциальные, возможности использования полифенолов пищи для диетотерапии и диетопрофилактики нарушений углеводного обмена.

Источник финансирования. Поисково-аналитическая работа по подготовке рукописи проведена в рамках реализации научной программы, поддержанной грантом Российского научного фонда (грант РНФ № 14−36−00041).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: анализ информации, написание текста — Мазо В.К., Кочеткова А.А., Саркисян В.А.; сбор и обработка информации, перевод иностранных статей — Петров Н.А. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы, подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Сведения об авторах

*Петров Никита Александрович [Nikita A. Petrov]; адрес: Россия, 109240 Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 [address: 2/14 Ustiinskiy proezd, Moscow, 109240, Russia]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-9755-6002; eLibrary SPIN: 4195-9733; e-mail: petrov-nikita-y@mail.ru

Мазо Владимир Кимович — д.б.н., проф. [Vladimir K. Mazo, PhD, professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-3237-7967; eLibrary SPIN: 4142-4720; e-mail: mazo@ion.ru

Саркисян Варужан Амбарцумович — к.б.н. [Varuzhan A. Sarkisyan, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-5911-610X; eLibrary SPIN: 3597-2337; e-mail: sarkisyan@ion.ru

Кочеткова Алла Алексеевна — д.тех.н., проф. [Alla A. Kochetkova, PhD, professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-9821-192X; eLibrary SPIN: 6350-7998; e-mail: kochetkova@ion.ru