Влияние метформина на продукцию провоспалительных цитокинов и инсулинорезистентность (NF-kB-сигнальный путь)

Инсулинорезистентность является основным признаком сахарного диабета 2-го типа (СД2) и ассоциируется с рядом метаболических и сердечно-сосудистых нарушений (дислипидемия, гипертензия, ожирение, особенно висцеральное, эндотелиальная дисфункция), каждое из которых является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний. Молекулярной основой развития инсулинорезистентности является нарушение проведения сигнала от инсулинового рецептора по фосфоинозитол-3-киназному пути с сохранением передачи сигнала по МАР-киназному [1]. МАР-киназный путь активирует NF-kB, обладающий многими провоспалительными эффектами. Кроме того, через NF-kB реализуется липотоксичность неэстерифицированных жирных кислот, внутриклеточных СoА-жирных кислот, некоторые эффекты ангиотензина II [2].

Таким образом, NF-kB-сигнальный путь является одним из ключевых пунктов внутриклеточной сигнализации, ответственных за развитие инсулинорезистентности, СД2, атеросклероза и артериальной гипертензии. В этой связи актуален поиск лекарственных препаратов, способных блокировать NF-kB-сигнализацию, особенно среди веществ, обладающих противовоспалительным и инсулинсенситайзерным эффектами. Одним из таких препаратов является метформин [3].

Цель данного исследования — оценка роли NF-kB-сигнального пути в реализации противовоспалительного и инсулинсенситайзерного действия метформина у больных с метаболическим синдромом (МС) и ишемической болезнью сердца (ИБС).

В исследование включены 18 мужчин в возрасте 45—65 лет, которые страдали ИБС на фоне МС. Исследование проводилось с 2008 по 2010 г. на базе 1-й городской клинической больницы Полтавы и Научно-исследовательского института генетических и иммунологических основ развития патологии и фармакогенетики Украинской медицинской стоматологической академии. Перед началом исследования было получено одобрение комиссии по биоэтике этого учреждения. Включение пациентов мужского пола объяснялось необходимостью устранения влияния различных гормональных изменений.

ИБС диагностировали по общепринятым критериям, а наличие МС устанавливали по критериям ВОЗ [4].

До включения в исследование все больные получали общепринятое лечение. Затем применялся стандартный комплекс медикаментозной терапии: изосорбида динитрат 20 мг 2 раза в день, ацетилсалициловая кислота 75 мг 1 раз в день на ночь, амлодипин 10 мг 1 раз в день, метапролол 25 мг 1 раз в день, аторвастатин 10 мг 1 раз в день утром, больные получали также рекомендации относительно диеты и образа жизни. Общепринятое лечение больные получали не менее 1 мес (до достижения стабильных показателей).

В 1-й день у всех пациентов брали пробы крови и проводили клиническое обследование. Затем в комплексную терапию 8 пациентов был включен метформин в дозе 500 мг 2 раза в день, т.е. впервые назначали пероральный сахарснижающий препарат (группа наблюдения). Повторное обследование выполнялось через 1 мес. Остальные 10 пациентов продолжали стандартное медикаментозное лечение (контрольная группа). Обследование включало: общий анализ крови, общий анализ мочи, определение глюкозы в крови и моче, биохимический анализ крови, определение общего холестерина, α-холестерина, триглицеридов, b-липопротеинов, общих липидов, УЗИ почек, УЗИ сердца, ЭКГ. Все методы были рутинными и использовались для верификации и установления тяжести основного заболевания, а также выявления сопутствующей патологии. Определяли концентрацию глюкозы и гликированного гемоглобина (HbA_1c) в крови («Био-Ла-Тест», Чехия) и проводили глюкозотолерантный тест (ГТТ). Концентрацию С-пептида в сыворотке определяли иммуноферментным методом («DRG International, Inc.», США). Регистрировали антропометрические показатели — рост (см), массу тела (кг), рассчитывали индекс массы тела (ИМТ, кг/м²).

Воспалительную реакцию оценивали по концентрации ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α, определяемой иммуноферментным методом (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Для определения экспрессии NF-kB СD40+-клетками суспензию мононуклеаров периферической крови инкубировали с моноклональными антителами (мкАТ) к поверхностным антигенам CD40. К 50 мкл суспензии (105 клеток) добавляли 5 мкл мкАТ, меченых FITC, против CD40 («Caltag», США) и инкубировали 20 мин при 4 °С. Затем клетки отмывали, центрифугируя с 1 мл ФСБ при 1500 об/мин в течение 5 мин. Ресуспендированные клетки фиксировали раствором («Caltag», США) 20 мин при 4 °С. Пермеабилизацию проводили в присутствии мкАТ против субъединицы р65 молекулы NF-kB («BD Biosciences Pharmingen», США) в течение 40 мин при 4 °С. После одноразового отмывания к ресуспендированным клеткам добавляли вторые мкАТ, меченные РЕ («Caltag», США). После 20-минутной инкубации клетки отмывали и добавляли 0,5 мл ФСБ. Исследования выполнены на проточном цитофлюориметре EPIX LX-MCL («Beckman Coulter», США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программы STATISTICA 6.0 («StatSoft», США) с расчетом выборочного среднего, выборочного стандартного отклонения, вероятности полученных результатов для попарносвязанных величин (t). Данные приведены в виде выборочного среднего (М), выборочного стандартного отклонения (S/D), нижней и верхней квартили. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

У всех 18 пациентов имело место нарушение толерантности к глюкозе, ИМТ превышал 30 кг/м² и регистрировался один из дополнительных критериев МС (артериальная гипертензия, повышение уровня триглицеридов >1,7 ммоль/л или уровень холестерина ЛПВП <0,9 ммоль/л). Из общей группы больных с МС и ИБС были отобраны 8 пациентов с четкими признаками ожирения (ИМТ=34,12±5,12 кг/м²), нарушения углеводного обмена и инсулинорезистентностью (уровень С-пептида =15,97±2,59 нг/мл, HbA_1c 6,54±2,19 мкмоль фруктозы/г Hb) и системного воспаления (повышение концентраций ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8 и ФНО-α в сыворотке в 2—3 раза).

В то же время исходные уровни ИМТ, HbA_1c, C-пептида и исследованных цитокинов в группе наблюдения не отличались от таковых в контрольной группе (p>0,05) (рис. 1, 2).

Включение в комплекс терапии метформина и лечение приводили через 1 мес к снижению ИМТ до 33,16±4,77 кг/м² (р=0,00049) и концентрации С-пептида 12,7±4,1 нг/мл (р=0,006); уровень HbA_1c уменьшился слабо (до 5,44±1,93 мкмоль фруктозы/г Hb, р>0,05). Отчетливо снизилась концентрация провоспалительных цитокинов в сыворотке: ИЛ-1β — 2,11±0,68 пг/мл (р=0,00005), ИЛ-6 — 16,57±16,65 пг/мл (р=0,000), ИЛ-8 — 7,97±11,4 пг/мл (р=0,00104) и ФНО-α — 5,7±3,8 пг/мл (р=0,00467) (рис. 3).

В контрольной группе, пациенты которой не принимали метформин, не отмечалось достоверных изменений изученных показателей.

В группе наблюдения до включения в терапию метформина концентрация общего холестерина составляла 6,5±1,12 ммоль/л, холестерина ЛПВП — 1,27±0,16 ммоль/л, общих липидов — 4,67±0,97 г/л, триглицеридов — 1,76±0,59 ммоль/л, β-липопротеидов — 2,29±0,57 г/л. Через 1 мес терапии с включением метформина уровни всех этих показателей изменились незначительно (р>0,05). Аналогичные недостоверные сдвиги наблюдались нами и в контрольной группе.

Содержание внутриклеточного NF-kB определяли в CD40+-клетках. Молекула CD40 экспрессируется В-клетками различной степени зрелости, моноцитами и дендритными клетками. Взаимодействия CD40/CD40L играют важную роль в поражении сосудистой стенки при атеросклерозе [5, 6].

Как видно из данных, представленных на рис. 3, а, число CD40+-клеток, экспрессирующих NF-kB у пациентов с МС и ИБС до начала лечения и применения метформина, составило 72,43±17,09 (нижний квартиль — 57,5; верхний — 86,95). Применение метформина привело к увеличению числа клеток, экспрессирующих NF-kB, до 92,17±4,48 (р=0,00000). При этом наблюдалось не только увеличение относительного числа клеток, но и снижение дисперсии результатов (нижний квартиль — 88,45; верхний — 94,9). В контрольной группе относительное число клеток, экспрессировавших NF-kB, до начала периода наблюдения не отличалось от показателей группы наблюдения. Через 1 мес комплексной медикаментозной терапии без включения метформина не отмечали достоверные изменения числа этих клеток, отсутствовали NF-kB (рис. 3, б).

NF-kB-комплекс состоит из субъединиц р50 (NF-kB1) и р65 (REL-A). Субъединица р65 содержит область из 300 аминокислот, гомологичную протоонкогенному продукту Rel (RH-домен). RH-домен включает мотивы для димеризации, перемещения в ядро и присоединения к специфическим последовательностям ДНК. Кроме того, субъединица p65 содержит трансактивационный домен, ответственный за взаимодействие с ингибитором IkB, в котором присутствуют участки фосфорилирования. Образование комплекса NF-kB/IkB предотвращает ядерную транслокацию и активность NF-kB. В ответ на такие стимулы, как цитокины, липополисахариды, повреждение ДНК и вирусные инфекции, IkB фосфорилируется по критическим остаткам, что вызывает диссоциацию комплекса, позволяя свободным гетеродимерам NF-kB поступать в ядро клеток. Оптимальная активация NF-kB требует фосфорилирования и трансактивационного домена р65. В ядре активированный NF-kB присоединяется к kВ сайтам промоторов и энхансеров и функционирует, стимулируя транскрипцию генов [7].

Недавно показано, что метформин в концентрации 100—1000 мкмоль/л ингибирует фосфорилирование IkB-киназы и деградацию IkBα в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Этот эффект связан со способностью метформина увеличивать фосфорилирование АМР-активированной киназы с участием РI3-киназы [8, 9]. Такая способность метформина ставит его в ряд препаратов с потенциальной противоопухолевой активностью, в частности при раке молочной железы [10].

Таким образом, у пациентов с МС и ИБС наряду с повышением массы тела и инсулинорезистентностью наблюдается увеличение продукции провоспалительных цитокинов, которые реализуют свои эффекты с участием NF-kB-сигнального пути. При этом формируется «порочный круг»: инсулинорезистентность — ожирение — системное воспаление — ремоделирование тканей — артериальная гипертензия — гиперинсулинемия — липотоксичность; компоненты этого круга могут взаимодействовать в различных последовательностях, приводя к активации NF-kB.

Такое состояние мы предлагаем называть прекондиционированием NF-kB-сигнального пути, приводящим к развитию и поддержанию метаболического синдрома.

Включение метформина в комплексную терапию больных МС и ИБС приводит к блокаде активации NF-kB под действием эндогенных провоспалительных цитокинов (на примере CD40+-мононуклеаров периферической крови) путем стабилизации комплексов NF-kB/IkB за счет ингибирования фосфорилирования IkB-киназы. Этот эффект метформина прерывает порочный круг, воздействуя на его ключевое звено — активацию NF-kB.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования: И.П. Кайдашев.

Сбор и обработка материала: И.П. Кайдашев, А.В. Лавренко, Н.Л. Куценко, Л.А. Куценко, Т.В. Мамонтова.

Статистическая обработка данных: Т.В. Мамонтова.

Написание текста: А.В. Лавренко, И.П. Кайдашев.

Редактирование: И.П. Кайдашев