Актуальность исследования продиктована эпидемиологическими и медико-социальными факторами. В настоящее время практически повсеместно отмечается неуклонный рост числа нейродегенеративных и других заболеваний нервной системы. После достижения 65-летнего возраста частота развития болезни Альцгеймера (БоАл) удваивается каждые 4 года, достигая 30% в возрасте 80 лет и 50% в 85 лет. Основным фактором риска развития нейродегенеративных заболеваний является старение. Нарушения памяти и других когнитивных функций (агнозия, расстройство абстрактного мышления, затрудненная адаптация к изменяющимся ситуациям), характерные для деменций, в незначительной степени наблюдаются и при нормальном старении. Однако отличительные критерии нормы и патологии возрастных изменений головного мозга человека остаются малоизученными.

Целью настоящего исследования стало изучение метаболической активности нейронов и эстрогеновых рецепторов (ЭР) при старении в четырех возрастных группах согласно периодизации ВОЗ: 1) 25 лет—44 года (молодые); 2) 45—59 лет (средний возраст); 3) 60 лет—74 года (пожилые); 75—89 лет (старческий возраст) и при двух наиболее частых формах деменции (БоАл и сосудистом слабоумии — СС).

В качестве параметров метаболической активности изучали размеры ядер и перикарионов нейронов и их комплекса Гольджи (КГ), который выявляли с помощью поликлональных антител, распознающих белок средней цистерны. ЭР окрашивали поликлональными антителами, а их сплайсинговые варианты выделяли из замороженной ткани мозга с помощью молекулярно-биологических методик. Исследования проводили в структурах гипоталамуса и переднебазального мозга, имеющих отношение к регуляции памяти и других познавательных функций: холинергических структурах переднебазального мозга: базальное ядро Мейнерта (БЯМ) и вертикальное ядро диагонального поля Брока (ВЯДБ), а также гипоталамических ядрах: туберомамиллярном (ТМЯ), медиальном мамиллярном (ММЯ), супраоптическом (СОЯ), вентромедиальном (ВМЯ) и инфундибулярном (ИНФ), которые за исключением СОЯ и ИНФ участвуют в регуляции памяти и других когнитивных функций. БЯМ — источник холинергической иннервации новой коры, тогда как ВЯДБ направляет холинергические проекции в гиппокамп. Холинергический дефицит, возникающий на фоне поражения БЯМ, ВЯДБ и их проекций, развивается одним из первых при БоАл и считается ведущим в патогенезе этого заболевания. ТМЯ гипоталамуса человека — основной источник гистаминергических проекций, отвечающих за контроль памяти, эмоций, обучения и циклов сна и бодрствования. При БоАл в ТМЯ наблюдается гибель крупных нейронов, приводящая к гистаминергическому дефициту. ММЯ связано с гиппокампом посредством свода и участвует в регуляции памяти на недавние события. Характерные нейропатологические проявления БоАл — амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки, обнаружены в значительном количестве в БЯМ, ТМЯ и ММЯ. СОЯ, основной функцией которого является выработка вазопрессина, не участвует в контроле когнитивных функций и не поражается при БоАл.

Эстрогены влияют на формирование и функциональную активность нейронов, обеспечивают нейропротективные эффекты. С учетом появившихся в литературе сведении о превентивной роли эстрогенов в развитии нейродегенеративных заболеваний в случае раннего начала заместительной терапии следующим этапом работы стало изучение ЭР и их сплайсинговых вариантов в указанных структурах при старении, БоАл и СС.

Исследования проведены на посмертном материале мозга 95 человек при наличии соответствующего разрешения на аутопсию мозга и использование ткани мозга и медицинской информации в научных целях. В 54 контрольных случаях признаков когнитивных нарушений, неврологических и психиатрических расстройств не выявлено. По данным аутопсии, в этой когорте отсутствовали изменения, которые могли бы быть отнесены к какой-либо патологии мозга. Эту группу разделили на подгруппы моложе и старше 50 лет, т. е. среднего возраста менопаузы у женщин и начала андропаузы у мужчин и согласно возрастной периодизации ВОЗ на 4 группы: 1-я — молодые (25 лет—44 года), 2-я — средний возраст (45—59 лет), 3-я — пожилые (60 лет—74 года), 4-я — старческий возраст (75—89 лет). Диагноз БоАл был установлен при исключении других возможных причин деменции на основании истории болезни, данных медицинского обследования и лабораторных тестов согласно критериям Национального института неврологических и коммуникационных расстройств и ассоциации по изучению инсультов, болезни Альцгеймера и относящихся к ним заболеваний (NINCDS-ADRDA). Степень тяжести деменции оценивали по шкале Рейсберга. Клинический диагноз БоАл подтвержден данными нейропатологического исследования, в результате которого в случаях БоАл обнаружены множественные сенильные бляшки, нейрофибриллярные клубки и дистрофические нейриты в новой коре и гиппокампе. У пациентов с БоАл степень по шкале Браак составила 5—6, а у контрольных случаев — 0—1.

Диагноз СС был установлен на основании критериев NINDS-AIREN. При нейропатологическом исследовании случаев СС обнаружены следующие изменения: 1) атеросклероз крупных сосудов основания мозга умеренной или выраженной степени; 2) диффузно расширенные желудочки мозга; 3) лакуны; 4) «старые» или «недавние» инфаркты; 5) некротические повреждения и атрофия извилин и окружающего белого вещества; 6) множественные кровоизлияния и их последствия; 7) разрежение и мацерация белого вещества; 8) état criblé в хвостатом ядре, покрышке, бледном шаре и таламусе. В височной, теменной, затылочной и иногда лобной коре, в поясной извилине, хвостатом ядре, покрышке, бледном шаре, внутренней и наружной капсуле, мозжечке и мосте обнаруживались инфаркты.

Методы исследования. Участки головного мозга, содержащие названные ядра, были зафиксированы в 4% растворе формальдегида в фосфатном буфере (pH 7,4) при комнатной температуре, залиты в парафин и нарезаны на серийные фронтальные срезы толщиной 6 мкм. С целью определения топографии ядер каждый 50-й срез был окрашен 0,5% раствором тионина.

В парафиновых срезах гипоталамуса и переднебазального мозга проводили иммуноцитохимическое окрашивание: 1) КГ с помощью поликлональных антител анти-HG-130, распознающих специфичный сиалогликопротеин средней цистерны КГ нейронов человека, пероксидазо-антипероксидазным методом; 2) эстрогеновых α-и β-рецепторов (ЭРα и ЭРβ) поликлональными антителами фирмы «Santa Cruz» авидин-биотиновым методом; 3) сплайсингового варианта МВ1 поликлональными антителами пероксидазо-антипероксидазным методом; 4) ароматазы поликлональными антителами пероксидазо-антипероксидазным методом; 5) соматостатина с использованием поликлональной антисыворотки, распознающей соматостатин 1—12 (S320), для определения границ ВМЯ; 6) нейрофибриллярных клубков антителами, выявляющими гиперфосфорилированный белок тау (AT8). Специфичность антител к КГ, ароматазе и МВ1 подтверждена результатами западного блоттинга на белковом экстракте фрагментов замороженной гипоталамической области.

Гибридизацию in situ мРНК вазопрессина (ВП) проводили с использованием меченной радиоактивной серой пробой ВП, состоявшей из 48 нуклеотидов, комплементарных основаниям 411—458 мРНК препровазопрессина.

Цепную полимеразную реакцию (ЦПР) проводили с целью определения экспрессии сплайсинговых вариантов мРНК ЭРα в мамиллярных телах (МТ) контрольных случаев и пациентов с БоАл. Экстракцию мРНК осуществляли из замороженных МТ с помощью тризола; 2 мкл копированной ДНК были использованы в качестве исходного материала для амплификации фрагментов: 1) от 1-го до 4-го экзона; 2) от 4-го до 8-го экзона; 3) от 2-го до 5-го экзона; 4) от 2-го до 4-го экзона; 5) от 3-го до 5-го экзона. Продукты ЦПР помещали в 2% агарозный гель с последующим электрофорезом и визуализацией в ультрафиолетовом свете. Выделенную и очищенную ДНК подвергали реамплификации с определением нуклеотидной последовательности. С целью количественной оценки экспрессии выявленных сплайсинговых вариантов учитывали показатели 3 референсных генов: рибосомального белка S27a (rS27a), фактора выпрямления 1α (EF1α) и E2D2 убиквитинконъюгирующего фермента Ube2d2. Относительные уровни транскрипции определяли по формуле: (эффективность экспрессии транскриптов гена ЭРα)–(порядок цикла)/(эффективность экспрессии референсных генов)–(порядок цикла).

Количественную оценку результатов морфологических исследований осуществляли главным образом с помощью компьютерной системы анализа изображений IBAS-KAT, соединенной с черно-белой камерой и микроскопом Zeiss. С использованием специальных программ проводили измерение площади сечения нейронов, площади нейронов, занимаемой иммуноцитохимически окрашенным КГ, количества нейронов, экспрессирующих ЭРα и ЭРβ.

Нормальное распределение данных изучали с помощью тестов Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Уилка. Различия оценивали с помощью одно- и двухфакторного теста ANOVA, а также с помощью тестов Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни. Для определения корреляции изучаемых показателей с различными параметрами использовали анализ линейной регрессии. Различия при p<0,05 считали достоверными.

Изменения метаболической активности нейронов при старении. При изучении морфометрических критериев метаболической активности нейронов (размеров ядер и перикарионов нейронов, а также иммунореактивного КГ) в большинстве изученных структур (БЯМ, СОЯ, ММЯ) выявлено увеличение этих показателей в группе людей пожилого возраста. В БЯМ увеличение метаболической активности начиналось раньше, и было заметно уже в группе людей среднего возраста. В ВЯДБ увеличение размеров КГ и перикарионов нейронов наблюдалось в группе людей старческого возраста.

В ВЯДБ у контрольных лиц старше 50 лет отмечено значительное увеличение размеров КГ при старении (r=0,814; p=0,002). В БЯМ достоверное увеличение размеров КГ с возрастом наблюдалось только у женщин (р=0,009) с отчетливым повышением в период перименопаузы, что свидетельствует об ингибирующем влиянии эстрогенов на метаболическую активность нейронов в этом ядре. В ТМЯ с возрастом увеличивались размеры перикарионов нейронов (r=0,374; p=0,046). После разделения на мужчин и женщин эта корреляция наблюдалась у мужчин (r=0,677; p=0,006) и отсутствовала у женщин (r=0,167; p=0,569). Размеры перикарионов (но не КГ) нейронов ТМЯ у пожилых мужчин (>60 лет) значительно превышали таковые у молодых мужчин (<60 лет) (F[1; 15]=27,415; p=0,0001). У молодых женщин этот параметр был больше, чем у молодых мужчин (F[2; 23]=6,736; p=0,006). Размеры перикарионов нейронов ТМЯ у молодых и пожилых женщин не различались (F[1; 14]=0,082; p=0,779). Отсутствие изменений площади перикарионов с возрастом у женщин и постепенное снижение уровня андрогенов у мужчин свидетельствуют, что именно снижение уровня андрогенов у мужчин лежит в основе увеличения размеров гистаминергических нейронов в ТМЯ. Интенсивность окраски КГ и размеры КГ нейронов ВМЯ у мужчин старше 50 лет оказались больше, чем у мужчин моложе 50 лет. Более интенсивное иммуномечение КГ отмечено и у молодых женщин по сравнению с молодыми мужчинами. С помощью двухфакторного теста ANOVA был показан достоверный эффект взаимодействия пола и возраста для размеров КГ в нейронах ВМЯ (основные эффекты (ME): F[2; 28]=0,158 и 0,214; p=0,695 и 0,648; эффект взаимодействия (IE): F[1; 28]=5,129; p=0,032), для пропорционального соотношения КГ и профильной площади нейронов (ME: F[2; 28]=0,013 и 1,862; p=0,910 и 0,185; IE: F[1; 28]=4,183; p=0,052). Соотношение площади КГ и площади перикарионов у молодых женщин было значительно больше, чем у молодых мужчин (ME: F[1; 15]=7,648; p=0,005), а у пожилых мужчин превышало таковое у молодых мужчин (ME: F[1; 12]=7,588; p=0,019). После разделения на мужчин и женщин достоверная корреляция соотношения КГ и площади перикариона с возрастом была обнаружена у мужчин (r=0,568; p=0,043) и отсутствовала у женщин (r=0,086; p=0,752). Так как относительный размер КГ к площади перикарионов был больше у молодых женщин по сравнению с молодыми мужчинами, а у пожилых мужчин больше, чем у молодых, уместно предположить ингибирующее влияние андрогенов на метаболическую активность нейронов ВМЯ человека. В ММЯ площадь КГ (p=0,032) и размеры перикарионов нейронов (p=0,025) у женщин после менопаузы оказались больше, чем у молодых женщин. При использовании теста линейной регрессии показано, что площадь КГ (r=0,465; p=0,034) и размеры перикарионов нейронов (r=0,593; p=0,005) достоверно увеличивались с возрастом в контрольной группе. После разделения на мужчин и женщин это увеличение оказалось типичным для женщин (для площади перикарионов (r=0,773; p=0,005), для КГ (r=562; p=0,072)) и практически отсутствовало в группе мужчин (для площади перикарионов (r=0,426; p=0,220), для размеров КГ (r=0,414; p=0,235)). Таким образом, метаболическая активность нейронов ММЯ, оцениваемая по размерам КГ и перикарионов нейронов, значительно увеличивалась с возрастом у женщин и не изменялась у мужчин. Аналогично предыдущим исследованиям в СОЯ (Т. Ishunina и соавт., 1999; Т. Ishunina, D. Swaab, 1999), эти данные предполагают ингибирующее действие эстрогенов на нейроны ММЯ, так как уровень эстрогенов в плазме снижается у женщин во время и после менопаузы, средний возраст которой составляет около 50 лет. В подтверждение этой гипотезы в настоящей работе были установлены достоверные различия площади КГ и размеров перикарионов нейронов у женщин старше 50 лет по сравнению с женщинами младшей возрастной группы — от 28 до 50 лет.

Эстрогены опосредуют свои эффекты через ЭР двух основных подтипов (ЭРα и ЭРβ). В клетках HeLa стимулирующие влияния эстрогенов обеспечиваются посредством ЭРα, тогда как ингибирующие — через ЭРβ. В собственных исследованиях увеличение экспрессии ЭРα и снижение экспрессии ЭРβ отмечено у женщин старше 50 лет в СОЯ, ММЯ и ВЯДБ, что свидетельствует об ассоциации экспрессии ядерных ЭРα с повышением метаболической активности нейронов у женщин в период пери- и постменопаузы. При БоАл достоверная положительная корреляция размеров КГ и перикарионов нейронов с экспрессией ядерных ЭРα отмечена в СОЯ и ММЯ.

Метаболическая активность нейронов при БоАл и СС. У пациентов с БоАл наблюдалась отчетливая тенденция к увеличению КГ нейронов ВЯДБ по сравнению с контрольными лицами (ME: F[1; 21]=3,508; p=0,077). Этот эффект оказался еще более значительным при разделении второй экспериментальной группы с учетом возраста 70 лет: (ME (главный эффект): F[2; 21]=3,820 (БоАл) и 1,521 (возраст 70 лет); p=0,067 и p=0,234 соответственно; IE (эффект взаимодействия двух факторов, влияющий на изучаемый показатель) между БоАл и возрастом 70 лет: F[1; 21]=5,612; p=0,030). Подобное разделение на 4 группы (пациенты с БоАл ≤70 лет, пациенты с БоАл >70 лет, контрольные лица ≤70 лет, контрольные лица >70 лет) по данным теста Краскела—Уоллиса справедливо (p=0,032). В этом случае площадь КГ достоверно больше у пациентов с БоАл, чем у контрольных лиц моложе 70 лет (p=0,030 по результатам теста Манна—Уитни и p=0,037 согласно тесту Бонферрони), а у контрольных лиц старше 70 лет больше, чем у людей от 56 до 70 лет (p=0,009 по результатам теста Манна—Уитни). Активизацию нейронов ВЯДБ при БоАл, проявляющуюся большими размерами КГ, можно объяснить увеличением ретроградного транспорта фактора роста нервов (NGF) в ВЯДБ вследствие повышения уровня NGF в гиппокампе.

В БЯМ и ТМЯ при БоАл выявлено достоверное уменьшение размеров КГ, а в БЯМ еще и сморщивание крупных холинергических нейронов. В СОЯ и ММЯ достоверных различий размеров КГ между пациентами с БоАл и пожилыми контрольными лицами не установлено.

У пациентов с СС показано уменьшение размеров КГ нейронов СОЯ, ИНФ ядра и ТМЯ. Напротив, в ВЯДБ наблюдалось увеличение размеров как КГ, так и перикарионов, указывающих на повышение метаболической активности нейронов. Значительных изменений иммунореактивности КГ в БЯМ и ММЯ не обнаружено. Ни в одном из изученных ядер значительных различий интенсивности окраски КГ между пациентами с СС и БоАл не выявлено за исключением некоторой тенденции в СОЯ, где у лиц с СС наблюдалась меньшая степень иммуномечения (p=0,065). При парном анализе (контрольный случай — случай с СС приблизительно одного и того же возраста) существенное снижение мРНК ВП в СОЯ установлено у пациентов с СС (p=0,021 для процента площади и p=0,002 для интенсивности). Нарушения синтеза вазопрессина в СОЯ могут лежать в основе самого частого клинического симптома СС — недержания мочи, а также иметь отношение к снижению артериального давления на поздних стадиях заболевания у этой группы людей. В БЯМ при СС наблюдаются уменьшение размеров перикарионов нейронов и увеличение количества глиальных клеток. Эти результаты подтверждают гипотезу, что при СС происходит поражение не только холинергических нервных волокон, но и самого источника этих проекций — БЯМ. Уменьшение размеров перикарионов нейронов БЯМ при СС указывает на снижение выработки холинергических маркеров, вследствие чего следует ожидать сокращения транспорта холинацетилтрансферазы и ацетилхолинэстеразы в кору головного мозга у пациентов с СС.

Снижение метаболической активности ассоциируется с повышением плотности глиальных клеток и в других изученных структурах при БоАл и С.С. Плотность глиальных клеток при СС существенно выше, чем в контрольной группе: р=0,0006 для БЯМ, р=0,017 для СОЯ, р=0,005 для ТМЯ и р=0,001 для ММЯ. Плотность нейронов повышена в СОЯ (р=0,004) и в меньшей степени в БЯМ (р=0,05), что свидетельствует о сморщивании этих структур при СС. В ТМЯ (р=0,197) и ММЯ (р=0,22) достоверных различий по плотности расположения нейроцитов не установлено, а нейроглиальный индекс повышен: р=0,008 для ТМЯ и р=0,035 для ММЯ. При БоАл наиболее поражено БЯМ. Здесь достоверно снижена плотность нейронов (р=0,003), наблюдаются их сморщивание и сокращение численности. Плотность расположения глиальных клеток во всех изученных ядрах при БоАл достоверно повышена: р=0,004 для БЯМ, р=0,045 для СОЯ, р=0,013 для ТМЯ и р=0,005 для ММЯ. В СОЯ (р=0,009) и ММЯ (р=0,005) плотность нейронов у пациентов с БоАл выше, чем у контрольных случаев, что свидетельствует о сморщивании этих структур. Сморщивание СОЯ можно объяснить давлением со стороны увеличенного третьего желудочка мозга, а уменьшение объема ММЯ при БоАл описано ранее. Нейроглиальный индекс при БоАл повышен в БЯМ, ТМЯ и ММЯ. Установленные различия по плотности расположения нейронов и глиальных клеток в структурах переднебазального мозга и гипоталамуса при БоАл и СС свидетельствуют о различной степени поражения изученных ядер при двух формах деменции и разных механизмах их патогенеза.

БоАл чаще встречается у женщин. При этом у получавших заместительную терапию эстрогенами отмечено значительное снижение риска развития БоАл. У женщин с установленным диагнозом БоАл подтверждено, что уменьшение уровня эстрогенов является важным фактором патогенеза этого заболевания. В ряде работ показана связь между низким уровнем свободных эстрогенов и риском развития БоАл. Следует отметить, что на взаимосвязь между БоАл и эстрогенами может влиять и полиморфизм ЭР.

У пациентов с БоАл было установлено достоверное увеличение числа нейронов с ядерными ЭРα в БЯМ (главный эффект (ГЭ) теста ANOVA: F[1; 23]= 9,992; p=0,005), в ВЯДБ (ME (главный эффект): F[1; 21]=9,415; p=0,006 по данным ANOVA и p=0,013 согласно тесту Манна—Уитни) и в ММЯ (F[1; 22]= 12,415; p=0,002). В СОЯ процент ВП нейронов с ядерными ЭРα был выше у мужчин с БоАл, чем у мужчин контрольной группы (F[2; 23]=4,278; p=0,028). При этом интенсивность окраски ядерных ЭРα была выше у всех случаев с БоАл по сравнению с контрольной группой. В ММЯ при анализе сочетанного влияния БоАл и пола пациентов пропорция нейронов ММЯ с ядерными ЭРα также оказалась выше у мужчин с БоАл по сравнению с мужчинами контрольной группы (F[2; 16]=4,744; p=0,028), и такая же тенденция в меньшей степени отмечена у женщин (F[2; 16]=3,342; p=0,065).

Чтобы ответить на вопрос о специфичности феномена увеличения экспрессии ядерного ЭРα для БоАл, было проведено сравнительное иммуноцитохимическое исследование ЭРα в ядрах гипоталамуса и переднебазального мозга при БоАл, СС и у контрольных лиц. Статистически значимых различий по интенсивности окраски ядерных ЭРα между контрольными и случаями с СС в изучаемых ядрах не обнаружено. Достоверность увеличения интенсивности окраски ядерных ЭРα при БоАл была подтверждена в ВЯДБ, БЯМ, СОЯ и ММЯ. Более выраженным это увеличение оказалось в группе мужчин с БоАл. При этом статистически значимых различий по интенсивности окраски ЭРα между случаями с СС и БоАл не обнаружено за исключением БЯМ, в котором сравниваемый показатель (интенсивность окрашивания ядерных ЭРα) в группе с БоАл (p=0,020) оказался выше, чем при С.С. Таким образом, феномен увеличения ядерных ЭРα специфичен для БоАл, но закономерной связи с нейропатологическими проявлениями этого заболевания не имеет.

Принимая во внимание, что в большинстве случаев главным эндокринным регулятором ЭРα является его лиганд 17β-эстрадиол, который вызывает снижение синтеза как белка, так и мРНК ЭРα по авторегуляторной обратной связи, мы изучили вероятность того, что увеличение ядерных ЭРα при БоАл обусловлено изменениями локального уровня эстрогенов вследствие нарушения местного синтеза эстрогенов. Чтобы ответить на этот вопрос, была изучена экспрессия ароматазы — ключевого фермента в биосинтезе эстрогенов. В то время как в БЯМ при БоАл уровень ароматазы увеличен, в большинстве гипоталамических ядер, например в СОЯ, ИНФ и ММЯ он уменьшен, а в ВЯДБ и ТМЯ не изменен. В гипоталамических СОЯ, ИНФ и ММЯ при БоАл обнаружена обратная зависимость между ЭРα и ароматазой. Очевидно, что в этой области мозга понижение уровня локально синтезированных эстрогенов (оцениваемых косвенно по иммунореактивности ароматазы) и эстрогенов плазмы приводит к увеличению экспрессии ядерных ЭРα по механизму положительной обратной связи. Не исключено, что увеличение экспрессии ядерных ЭРα может быть своеобразным защитно-компенсаторным механизмом, так как большинство нейропротекторных эффектов эстрогенов осуществляется именно через рецепторы этого подтипа. Следует учитывать и возможность того, что ЭРα накапливаются в ядрах нейронов при БоАл вследствие нарушения деградации в протеасоме. Для проверки этой гипотезы холинергические ядра у лиц с БоАл, в которых обнаружено значительное повышение экспрессии ЭРα, были окрашены на убиквитин В+1 (УБВ+1) — маркер сниженной активности протеасомы, характеризующейся неэффективной деградацией аберрантных белков. Иммунореактивный УБВ+1 выявлялся в виде компактных телец округлой формы, напоминающих нейрофибриллярные клубки. Наиболее интенсивным окрашивание УБВ+1 оказалось в БЯМ и ТМЯ при БоАл. Значительно меньшее количество нейронов, экспрессирующих УБВ+1, было обнаружено в ВЯДБ и ММЯ, где характер окрашивания был более диффузным с преимущественной локализацией в цитоплазме. УБВ+1 и ядерные ЭРα не всегда локализуются совместно в одном и том же нейроне. Даже в случае обнаружения в одних и тех же нейронах ЭРα и УБВ+1 находятся в различных компартментах цитоплазмы. Таким образом, дисфункция протеасомы не проясняет механизм увеличения экспрессии ЭРα при БоАл.

Наличие и даже повышение экспрессии ЭРα в гипоталамусе и переднебазальном мозге делает эти структуры потенциальными мишенями для терапии эстрогенами при БоАл. Однако, учитывая данные литературы об отсутствии отчетливых положительных эффектов от назначения эстрогенов при БоАл в нескольких клинических исследованиях, следующим этапом работы стало исследование мРНК ЭРα для выявления сплайсинговых вариантов, которые могли бы объяснить изменение чувствительности нервной ткани к эстрогенам при старении и БоАл.

Основным сплайсинговым вариантом мРНК ЭРα в ММЯ у пациентов с БоАл и контрольных лиц является изоформа Δ7. Так как 7-й экзон кодирует значительную часть домена для связывания с гормонами, вариант D7 не связывается с эстрогенами и не инициирует транскрипцию. Несмотря на это, D7 подавляет сигнализацию эстрогенов, осуществляемую классическими ЭР, и таким образом является доминантным негативным вариантом. В мамиллярных телах при БоАл наблюдалось уменьшение пропорционального отношения Δ7 к классической форме рецептора, что свидетельствует об уменьшении эффективности альтернативного сплайсинга при этом заболевании. Помимо D7 выделены изоформа D4 с делецией 4-го экзона, кодирующего часть домена для связывания с лигандами, и вариант Δ2, у которого поврежден домен для связывания с ДНК. Как и в случае с Δ7, эти варианты не инициирует транскрипцию и не связывают меченый эстрадиол. Таким образом, значительная часть ЭРα в ММЯ у пожилых людей не связывается с эстрогенами и не активизирует транскрипцию через эстрогенчувствительные элементы, что объясняет отсутствие эффектов при назначении эстрогенов пожилым женщинам и пациенткам с БоАл.

В настоящей работе удалось впервые выделить из ММЯ контрольного лица с БоАл транскрипт из 800 азотистых оснований с делецией 168 нуклеотидов внутри 1-го экзона, комплементарных последовательности между нуклеотидами 573 и 741 мРНК ЭРα человека (GenBank AY750962). Утраченная последовательность соответствует экзонному интрону типа U2. Основываясь на работах с удалением различных фрагментов домена A/B ЭРα в фибробластах куриных эмбрионов и дрожжевых моделях, уместно предположить, что образующийся белок будет характеризоваться снижением трансактивационной функции 1 приблизительно в 4 раза. С помощью поликлональных антител, распознающих специфичный сплайсинговый сайт нового варианта, значительное количество нейронов с МВ1 обнаружено в ядрах моста, дорсальном двигательном ядре блуждающего нерва в продолговатом мозге, двигательных ядрах передних рогов спинного мозга и ТМЯ гипоталамуса. Последующая количественная оценка изменений интенсивности окрашивания МВ1 в различных возрастных группах и при БоАл осуществлялась в гистаминергическом ТМЯ. В качестве параметра, отражающего уровень экспрессии МВ1 на уровне белка, использовалось определение удельной доли профильной площади нейронов ТМЯ, занятой иммунореактивным МВ1. Средний процент профильной площади нейронов ТМЯ, занятой МВ1, увеличивался с возрастом у женщин (r=0,640; p=0,002) и не изменялся при старении у мужчин (r= –0,133; p=0,556). После разделения группы женщин с учетом среднестатистического возраста наступления менопаузы оказалось, что иммуноцитохимическая экспрессия МВ1 выше у женщин после менопаузы (10 случаев в возрасте 58—94 лет), чем у молодых женщин (7 случаев в возрасте 21—46 лет; p=0,008). Таким образом, у женщин при снижении уровня эстрогенов в климактерическом периоде происходит накопление сплайсинговых форм ЭРα.

1. Возрастные изменения метаболической активности нейронов ядер гипоталамуса человека, оцениваемой с помощью цитоархитектонических показателей (размеров аппарата Гольджи и перикарионов), характеризуются гендерными особенностями и ассоциируются с изменениями экспрессии рецепторов к половым стероидам. Так, метаболическая активность нейронов вентромедиального и туберомамиллярного ядер выше у молодых женщин по сравнению с молодыми мужчинами и увеличивается с возрастом у мужчин, что свидетельствует об ингибирующем влиянии андрогенов на эти ядра. В то же время метаболическая активность нейронов базального ядра Мейнерта, супраоптического и медиального мамиллярного ядер возрастает у женщин после менопаузы, демонстрируя наличие ингибирующих эффектов эстрогенов, опосредуемых через эстрогеновые β-рецепторы и стимулирующих через эстрогеновые α-рецепторы. Следует отметить отсутствие тенденции к снижению метаболической активности нейронов гипоталамуса и переднебазального мозга при старении. Напротив, в большинстве ядер наблюдается возрастная активизация, которая по всей видимости связана со снижением уровня циркулирующих эстрогенов и андрогенов.

2. При анализе данных, согласно возрастной классификации ВОЗ, увеличение метаболической активности в большинстве изученных структур (базальное ядро Мейнерта, туберомамиллярное, медиальное мамиллярное и супраоптическое ядра) установлено в группе пожилых людей в возрасте 60—74 лет. Отмеченные морфометрические изменения могут носить защитно-адаптационный характер, позволяющий предотвратить или задержать развитие нейродегенеративных процессов. В базальном ядре Мейнерта, которое в более значительной степени поражается при болезни Альцгеймера (сморщивание крупных нейронов, наличие значительного количества нейрофибриллярных клубков и амилоидных бляшек), эти защитные механизмы включаются раньше у лиц среднего возраста 45—59 лет. Следует отметить, что периодизация ВОЗ в данном случае не только отражает возрастные нормы размеров комплекса Гольджи, ядер и перикарионов нейронов, но и указывает на конкретный возрастной период запуска защитно-приспособительных реакций.

3. При болезни Альцгеймера единой закономерности в изменении метаболической активности нейронов ядер гипоталамуса и переднебазального мозга не наблюдается. В базальном ядре Мейнерта и туберомамиллярном ядре при этой форме деменции выявлено уменьшение размеров комплекса Гольджи нейронов. В медиальном мамиллярном ядре, туберальном латеральном, супраоптическом ядре и нонапептидергических нейронах паравентрикулярного ядра изменений метаболической активности при болезни Альцгеймера не обнаружено. В вертикальном ядре диагонального поля Брока площадь комплекса Гольджи достоверно больше у пациентов с болезнью Альцгеймера, чем у контрольных лиц моложе 70 лет, а у контрольных лиц старше 70 лет больше, чем у лиц в возрасте от 56 до 70 лет.

4. Метаболическая активность нейронов супраоптического, туберомамиллярного, инфундибулярного ядер гипоталамуса и базального ядра Мейнерта переднебазального мозга уменьшается при сосудистой деменции. Эти изменения могут быть связаны с нарушением кровоснабжения головного мозга при этой форме слабоумия.

5. Установленные различия в плотности расположения нейронов и глиальных клеток в структурах переднебазального мозга и гипоталамуса при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии свидетельствуют о различной степени поражения изученных ядер при двух формах деменции и разных компенсаторных механизмах их патогенеза. Наличие глиоза показано в базальном ядре Мейнерта, супраоптическом ядре, туберомамиллярном ядре и медиальном мамиллярном ядре при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии. Самая высокая степень глиоза выявлена в базальном ядре Мейнерта, причем при болезни Альцгеймера она выше, чем при сосудистом слабоумии. Снижение метаболической активности нейронов при болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии ассоциируется с компенсаторным увеличением числа глиальных клеток. Признаки снижения объема структуры мозга без нейродегенеративных изменений (сморщивание) показаны для супраоптическом ядре и медиальном мамиллярном ядре при болезни Альцгеймера и для базального ядра Мейнерта и супраоптического ядра при сосудистом слабоумии. Из всех изученных структур гибель нейронов характерна только для базального ядра Мейнерта при болезни Альцгеймера. При сосудистом слабоумии снижения плотности нейроцитов не обнаружено.

6. При болезни Альцгеймера в ядрах нейронов гипоталамуса и переднебазального мозга наблюдается увеличение экспрессии эстрогеновых α-рецепторов. Этот феномен может быть рекомендован в качестве одного из диагностических критериев болезни Альцгеймера в патогистологической практике. Увеличение экспрессии ядерных эстрогеновых α-рецепторов в гипоталамусе и переднебазальном мозге при болезни Альцгеймера может быть связано с изменениями локального биосинтеза эстрогенов и нарушением деградации рецепторов в протеасоме. Однако взаимосвязи этого феномена с нейропатологическими изменениями болезни Альцгеймера (амилоидными бляшками и нейрофибриллярными клубками) не установлено. Достоверного увеличения содержания этого рецептора при сосудистом слабоумии не выявлено. Изменения экспрессии другого подтипа эстрогеновых рецепторов — β отчетливой закономерностью не отличались. Так, процентное содержание нейронов с цитоплазматическими эстрогеновыми β-рецепторами увеличивалось при болезни Альцгеймера в базальном ядре Мейнерта и туберомамиллярном ядре гипоталамуса, тогда как во всех остальных изученных ядрах этот показатель не изменялся.

7. При болезни Альцгеймера наблюдается снижение иммуноцитохимической экспрессии ароматазы (ключевого фермента в биосинтезе эстрогенов) в ядрах гипоталамуса (супраоптическом, инфундибулярном, медиальном мамиллярном) и ее повышение в нейронах базального ядра Мейнерта. Ввиду сокращения численности крупных нейронов в базальном ядре Мейнерта при болезни Альцгеймера полученные результаты предполагают локальный дефицит эстрогенов в гипоталамусе и переднебазальном мозге при болезни Альцгеймера. При сосудистой деменции наиболее значительные различия в экспрессии ароматазы установлены в базальном ядре Мейнерта (увеличение) и супраоптическом ядре (снижение). Таким образом, при сосудистом слабоумии характер изменений в содержании ароматазы в определенной степени совпадает с таковым при болезни Альцгеймера.

8. В медиальном мамиллярном ядре пожилых людей наблюдается высокий уровень экспрессии доминантно-негативного сплайсингового варианта Δ7, характеризующегося выпадением 7-го экзона, который кодирует значительную часть домена для связывания с лигандами. Наличие в медиальном мамиллярном ядре мутантных форм эстрогеновых α-рецепторов (Δ7, Δ4, Δ2, МВ1) с повреждениями основных функциональных доменов предполагает отсутствие или снижение эффективности действия эстрогенов.

9. МВ1 — новый сплайсинговый вариант эстрогеновых α-рецепторов, изолированный из каудального гипоталамуса, характеризующийся выпадением 168 нуклеотидов в 1-м экзоне, соответствующих экзонному интрону U2. Экспрессия МВ1 увеличивается у женщин в пери- и постменопаузе, что свидетельствует о накоплении мутантных форм эстрогеновых α-рецепторов в ядрах гипоталамуса при снижении уровня циркулирующих эстрогенов.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Ишунина Татьяна Александровна — к.м.н., доцент, каф. гистологии, эмбриологии, цитологии, ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России e-mail: ishunina@gmail.com