Внутрипеченочный холангиоцеллюлярный рак (ВПХЦР) представляет собой второй по частоте распространенности первичный рак печени. Несколько недавних эпидемиологических исследований указывают на увеличение заболеваемости и смертности от ВПХЦР в мире [1—4]. Прогноз заболевания после хирургического лечения остается неудовлетворительным из-за позднего выявления, неэффективности стандартной терапии и сопутствующих заболеваний печени, таких как неалкогольная жировая болезнь и цирроз, которые могут ограничивать возможности терапии [5]. Изучение патогенеза заболевания и поиск эффективных методов лечения остаются актуальными.

Цель данной работы — оценка влияния наиболее часто встречающихся при ВПХЦР мутаций генов (KRAS, IDH1/2, NRAS, PIK3CA, MET, BRAF600, EGRF, ERBB2) на общую и безрецидивную выживаемость после проведенного хирургического лечения в российской популяции.

Материал и методы

Были проанализированы результаты хирургического лечения 33 пациентов, леченных в Национальном медицинском исследовательском центре хирургии им. А.В. Вишневского за период 2011—2019 гг. Средний возраст больных составил 60,8 года (31—74). В представленном исследовании число женщин преобладало с соотношением примерно 2:1 (23/10). Всем пациентам выполнена резекция печени различного объема — от бисегментэктомии до расширенной гемигепатэктомии.

Все пациенты после удаления первичной опухоли получали химиотерапию препаратами пиримидинового ряда и платины. Для оценки мутационного статуса опухоли было выполнено молекулярно-генетическое исследование удаленного операционного материала, фиксированного в формалине и заключенного в парафин с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в соответствии с протоколами использованных коммерческих наборов на приборе.

Выделение ДНК из опухолевой ткани проводили с использованием набора DNA Sample Preparation kit («Roche», Германия). Мутации 2-го экзона (кодоны 12 и 13) гена KRAS определяли при помощи набора реактивов Real-time-PCR-KRAS-7M («БиоЛинк», Россия) на амплификаторе real-time CFx96 («Bio-rad», США). Анализ мутаций гена EGFR выполняли на ПЦР-анализаторе Cobas z480 LightCycler («Roche», Германия) с использованием набора реактивов cobas EGFR Mutation Test v2 («Roche», Германия). Анализ мутации генов KRAS (ex.3-4), NRAS (ex.2-4), BRAF (ex.15), PICK3CA (ex.9-10, 20-21), MET (ex.14), IDH I (ex.4), IDH II (ex.4) провели с помощью ПЦР и последующего капиллярного электрофореза на приборе Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer («Thermo Fisher Scientific», США). Использованные пары комплементарных праймеров представлены в таблице. Амплификацию интересующих фрагментов ДНК выполняли на амплификаторе Терцик («ДНК-Технология», Россия). ПЦР-смесь: 9 мкл ddH₂O, 5 мкл 5х ПЦР буфера, 2,5 мкл 25 мМ MgCl₂, 2,5 мкл 25 мМ dNTP Mix, 1,5 мкл (10 пкмоль/мкл) каждого праймера, 0,3 мкл (5 е.а.) Taq-полимераза и 3 мкл ДНК. Условия ПЦР: 95 °C в течение 5 мин, 94 °C — 30 с, 60 °C — 30 с, 72 °C — 40 с (35 циклов), 72 °C — 5 мин. Этот этап исследования проводили в Лечебно-реабилитационном центре Минздрава России.

Клиническая характеристика пациентов

Ассоциации между молекулярными факторами и клинико-патологическими параметрами были оценены с помощью χ²-теста или точного критерия Фишера. При сравнении клинико-демографических характеристик в группах использовали критерий Манна—Уитни. Общая выживаемость после операции была рассчитана с использованием метода Каплана—Мейера; логарифмический тест был выполнен для сравнения кривых выживаемости, оценивали критерий Кокса—Ментела. Достоверность различий считали значимой при p<0,05. Все анализы были выполнены с использованием программного обеспечения Statistica 10.0.

Результаты и обсуждение

По данным разных авторов, при ВПХЦР наиболее часто встречающимися генетическими нарушениями являются мутации генов IDH1/2, KRAS, NRAS, что соответствует данным, полученным в настоящем исследовании.

В нашем исследовании распространенность этих и других (реже встречающихся) мутаций генов составила 27% KRAS (n=9), 24% IDH1/2 (n=8), 12% NRAS (n=4), 9% PIK3CA (n=3), 9% MET (n=3), 9% BRAF600 (n=3), 3% EGRF (n=1), 3% ERBB2 (n=1) (рис. 1).

Рис. 1. Распространенность мутаций генов при внутрипеченочной холангиокарциноме.

Проведена сравнительная характеристика пациентов по клинико-морфологическим показателям (см. таблицу). Несмотря на малые размеры выборки, полученные результаты представляют интерес.

Общая 3-летняя выживаемость в группе обследованных 33 пациентов составила 53% (рис. 2).

Рис. 2. Общая выживаемость в группе обследованных пациентов.

Общая 3-летняя выживаемость пациентов в зависимости от конкретных мутаций генов составила 84% — IDH1/2, 73% — KRAS, 48% — NRAS, 67% — BRAF600, при мутациях MET, PIK3CA, EGFR не достигнута. При наличии мутации ERBB2 пациентка наблюдается в течение 40 мес (рис. 3).

Рис. 3. Общая выживаемость пациентов в зависимости от наличия мутации гена.

При проведении анализа выживаемости после хирургического лечения было показано, что группа пациентов с мутацией генов IDH1/2 имела лучшую общую выживаемость по сравнению с пациентами с другими исследуемыми мутациями, а наиболее неблагоприятные результаты общей выживаемости выявлены для пациентов с мутацией гена MET. Анализ Каплана—Мейера с определением теста Кокса—Ментела, который более информативен при выборках малого размера, показал достоверную статистическую значимость p=0,0055 (p<0,05), что соответствует данным современных исследований [6, 7].

Также была проанализирована безрецидивная выживаемость в группах пациентов с разными мутациями. В отношении данного показателя были получены достоверно лучшие результаты для пациентов с мутацией генов IDH1/2. Однако для других мутаций достоверных различий не получено.

Безрецидивная 3-летняя выживаемость пациентов при различных мутациях составила 44% — IDH1/2, 45% — KRAS, 50% — NRAS, 34% — BRAF, пациентка с мутацией гена ERBB2 наблюдается в течение 40 мес (рецидив через 11 мес), при мутациях PIK3CA, MET, EGRF 3-летняя выживаемость не достигнута (рис. 4).

Рис. 4. Безрецидивная выживаемость у пациентов с различным мутационным статусом.

В настоящее время в связи с отсутствием высокоэффективных препаратов в лечении внутрипеченочной холангиокарциномы и неудовлетворительными результатами хирургического лечения [1] актуальными остаются исследования новых методов лечения, в том числе с применением высокотехнологичных методов.

Ниже описаны функции каждого из исследованных генов. Проведен сравнительный анализ данных современных зарубежных исследований и полученных результатов. Оценен прогноз пациентов с ВПХЦР после хирургического лечения. Описаны перспективы применения таргетной терапии.

Гены IDH1/2. Ген IDH кодирует синтез фермента IDH, который участвует в цикле Кребса, катализирует превращение изоцитрата в α-кетоглутарат. Мутации IDH усиливают образование 2-гидроксиглутарата (2-HG) из α-кетоглутарата, что ассоциировано с более высоким метилированием ДНК и в свою очередь способствует клеточной пролиферации, инвазии и неоангиогенезу [8].

В настоящей работе частота мутаций IDH1/2 составила 24%, и это вторая по распространенности мутация в когорте обследованных. Высокая распространенность мутаций этих генов в нашей группе пациентов согласуется с результатами других авторов [9].

Общая 3-летняя выживаемость для пациентов с IDH1/2 составила 84%, 3-летняя безрецидивная выживаемость — 44%.

В работе B. Ma и соавт. [6] получены результаты, аналогичные тем, что в нашем исследовании. Однофакторный и многофакторный анализы показали, что случаи комутации IDH1/2 значительно улучшили прогноз по сравнению со случаями дикого типа IDH1/2 с точки зрения безрецидивной (p=0,006) и общей (p=0,031) выживаемости в когорте пациентов с ВПХЦР. Дальнейший многофакторный анализ подтвердил, что мутация IDH1/2 была благоприятным независимым предиктором безрецидивной выживаемости. В настоящее время проводятся клинические испытания (NCT02073994; NCT02989857; NCT02746081; NCT03212274), направленные на ингибирование IDH1 в солидных опухолях, включая холангиокарциному [6, 10].

Гены KRAS, NRAS, BRAF. Данные гены участвуют в регуляции сигнального пути RAS/RAF/MEK/ERK.

Каскад RAS/RAF/MEK/ERK включает серию цитоплазматических белков, которые осуществляют передачу сигнала от мембраны клетки к ядру посредством активности киназ MEK и ERK. Онкогенная активация этого пути обусловлена специфическими мутациями в киназных областях генов, которые вызывают конститутивную индукцию фосфорилирующей функции белков RAS, что в свою очередь способствует пролиферации, дифференцировке, миграции и метастазированию опухолей [11].

Мутации KRAS, NRAS, BRAF хорошо известны при различных видах рака, включая ВПХЦР, и представляют собой субстрат для таргетной терапии, которая применяется и исследуется в настоящее время [12].

По данным D. Walter и соавт. [13], KRAS и NRAS мутируют при ВПХЦР в 9,5 и 3,6% случаев соответственно. В настоящем исследовании частота встречаемости мутаций KRAS и NRAS составила 27 и 12%, а общая и безрецидивная выживаемость пациентов после хирургического лечения с мутацией гена KRAS — 73 и 45% соответственно.

По нашим данным, мутации гена KRAS ассоциировались с нейтральным влиянием на исход. Возможным объяснением может быть наличие сочетанных мутаций в когорте сравнения, повлиявших на прогноз.

В исследовании C. Churi [14], мутация гена KRAS является неблагоприятным фактором при ВПХЦР при проведении анализа выживаемости. Однако при многофакторном анализе мутация гена KRAS не была ассоциирована с неблагоприятными исходами.

В настоящее время наличие мутированного гена KRAS рассматривается как мишень для проведения персонализированной терапии. В частности, сообщалось о стабилизации ВПХЦР после предшествующего прогрессирования при использовании терапии ингибиторами МЕК [15]. Этот аспект требует дальнейшего изучения.

Другим участником сигнального пути RAS/RAF/MEK/ERK является киназа BRAF, кодируемая геном BRAF. Киназа BRAF также участвует в передаче внутриклеточных сигналов. В нашем исследовании мутация гена BRAFV600 встречалась у 9% обследованных пациентов. Согласно нескольким другим исследованиям, распространенность мутаций гена BRAF невелика (3,3%) и встречается именно при внутрипеченочной форме холангиоцеллюлярного рака [13].

Два из 3 пациентов живы, период наблюдения составил 56 и 27 мес после хирургического лечения на фоне таргетной терапии дабрафенибом. Один пациент умер. Рецидив заболевания произошел у всех пациентов через 6 мес после операции.

В нескольких клинических наблюдениях сообщается о полной ремиссии рецидивного ВПХЦР после хирургического лечения и проведения таргетной терапии ингибиторами BRAF V600. У пациентки, леченной в НМИЦ хирургии им. А.В. Вишневского, на фоне таргетной терапии дабрафенибом и траметинибом ингибиторы BRAF привели к полному ответу. Пациентка в течение 4 лет не имеет признаков рецидива [16, 17].

В настоящее время пероральное лекарственное средство, которое, по-видимому, избирательно связывается и ингибирует активность как дикого типа, так и мутированных форм BRAF, а именно PLX8394 используется в двух фазах I/II клинических испытаний у пациентов с распространенными опухолевыми поражениями, в том числе с ВПХЦР. Кроме того, обсуждаемые ранее регорафениб и сорафениб являются ингибиторами BRAF [18]. К тому же разработаны препараты для лечения онкологических заболеваний, вызванных мутациями BRAF. Два из них — вемурафениб и дабрафениб — были одобрены FDA к применению для лечения поздних стадий меланомы [19].

Ген MET. Ген MET кодирует cMet, называемый также тирозин-протеинкиназа Met, или фактор роста гепатоцитов рецептора (HGFR), обладает тирозинкиназной активностью и является необходимым для эмбрионального развития, органогенеза и заживления ран [20]. Он и его изоформы (NK1, NK2) являются единственными известными лигандами рецептора MET [6, 10]. Аномальная активация MET при раке коррелирует с плохим прогнозом, вызывает рост опухоли, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и метастазирование. Мутация гена MET определяется при многих типах злокачественных опухолей человека, включая рак почки, печени, желудка, груди и головного мозга [21, 22].

В нашей группе мутация гена MET наблюдалась в 9% случаев. В исследовании S. Wang [23] мутация гена MET была прогностическим фактором неблагоприятного исхода с меньшей продолжительностью безрецидивной выживаемости. MET-гиперэкспрессия была обнаружена в 10 (11,90%) случаях из 84 с ВПХЦР и связана с большим размером опухоли (>5 см) и сниженным уровнем общей выживаемости.

Хотя в настоящем исследовании экспрессия cMET коррелирует с неблагоприятным прогнозом, в некоторых работах сообщалось о противоречивых результатах [24].

По нашим данным, 3-летняя общая и безрецидивная выживаемость пациентов с мутацией гена MET после хирургического лечения не достигнута. Также наихудшая выживаемость отмечалась у пациентов с мутацией гена MET. Это может объяснить повышенный инвазивный потенциал таких опухолевых образований в связи с действием мутированного гена MET.

Клинико-патологические особенности гиперэкспрессии cMET, выявляемые при иммуногистохимическом исследовании и его амплификации, могут помочь в разработке персонализированного лечения ВПХЦР.

Препараты, которые специфически нацелены на cMET, показали многообещающие результаты в ранних доклинических исследованиях на клеточных линиях холангиокарциномы [24, 25].

Ген PIK3CA. Ген PIK3CA является важнейшим регулятором внутриклеточного сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, который играет одну из ключевых ролей в регуляции клеточного цикла. Активация PI3K фосфорилирует AKT, который транслоцируется в плазматическую мембрану и производит ряд нисходящих эффектов, включая активацию mTOR, который в свою очередь выполняет некоторые из наиболее важных транскрипционных функций [26]. Данный сигнальный путь физиологически ингибируется геном-супрессором PTEN, но при многих типах рака он остается гиперактивным, снижая апоптоз и обеспечивая пролиферацию.

По данным зарубежных авторов [13], мутация гена PIK3CA встречается в 4,4% ВПХЦР. В нашем исследовании распространенность мутации PI3K составила 9%.

Нарушение регуляции сигнального пути PI3K/ PTEN/Akt/mTOR играет ключевую роль в патогенезе ВПХЦР. Снижение экспрессии PTEN является независимым предиктором низкой общей выживаемости больных ВПХЦР в послеоперационном периоде [27].

В исследовании A. Ruzzenente и соавт. [28] мутация гена PIK3CA была ассоциирована с неблагоприятным прогнозом при ВПХЦР. Из обследованных 2 пациента наблюдаются 24 и 26 мес. Наступил 1 летальный исход через 37 мес.

В настоящее время различные ингибиторы компонентов данного сигнального пути используются для лечения различных опухолей. В частности, эверолимус — ингибитор mTOR был протестирован в комбинации с гемцитабином и цисплатином у пациентов с нечувствительными к химиотерапии солидными опухолями, включая 10 случаев холангиокарциномы. Среди них у 6 (60%) диагностирована стабилизация течения заболевания [29].

Ген ERBB2 (HER2). Человеческие рецепторы эпидермального фактора роста (HER, ERBB) составляют семейство поверхностных рецепторов клеток, вовлеченных в передачу сигналов, регулирующих нормальный рост и дифференцировку клеток. Семейство белков ERBB включает 4 мембранно-связанные тирозиновые протеинкиназы, одна из которых — рецептор эпидермального фактора роста ERBB2 (HER2).

Функция гена HER2 состоит в регуляции роста и размножения клеток. Наличие большого количества рецепторов HER2 на поверхности раковой клетки приводит к нарушению регуляции роста клеток. Опухоли быстрее растут, более агрессивны и меньше подвержены воздействию химио- и гормональной терапии [30].

Сверхэкспрессия и амплификация ERBB2 выявлялись в 4—6% профилированных холангиокарцином, по данным B.Weinberg и соавт. [24].

В настоящей работе распространенность мутации (амплификации) ERBB2 составила 3% (1 пациентка). Пациентка наблюдается в течение 40 мес, рецидив произошел через 11 мес после хирургического лечения.

Крупные рандомизированные контролируемые исследования по HER2-таргетной терапии продемонстрировали пользу для пациентов с HER2-положительным раком молочной железы и гастроэзофагеальным раком, но аналогичные исследования в отношении ВПХЦР не проводились. Это связано с тем, что распространенность амплификации HER2 чаще встречается при раке молочной железы, пищевода и желудка.

Тем не менее некоторые исследования показали, что HER2 может являться эффективной мишенью при холангиокарциноме [31, 32].

В исследование J. Hainsworth и соавт. [33] включены 7 пациентов с холангиокарциномой со сверхэкспрессией HER2, получавших HER2-таргетную терапию (трастузумаб и пертузумаб). При этом у 2 пациентов был частичный ответ, у 3 — стабилизация онкологического процесса >120 дней.

Ген EGFR. Ген EGFR кодирует белок EGFR (ErbB-1). Рецепторы EGFR (EGFR; ErbB-1; HER1) также входят в группу семейства тирозинкиназ. В отличие от других генов, активируясь в результате точечной мутации, EGFR запускает каскад нескольких сигнальных путей (в частности, RAS/RAF/MEK/ERK, PI3K/Akt/mTOR, JAK/STAT). Эти сигнальные пути (описаны ранее) играют важную роль в регуляции дифференцировки клеток, пролиферации, миграции и ангиогенеза.

По данным разных авторов [34—36], мутация EGFR наблюдалась в 10—15% холангиокарцином. Однако из-за небольшой выборки данные относительно преобладания распространенности внутрипеченочного или внепеченочного холангиоцеллюлярного рака противоречивы. Гиперэкспрессия EGFR, по-видимому, более распространена при ВПХЦР (11—27%) по сравнению с воротной холангиокарциномой [37, 38].

По нашим данным, частота мутации EGFR составила 3%. Прогностическая роль мутации гена EGFR обсуждается. Согласно одним данным, она является негативным предиктором общей выживаемости при ВПХЦР [39], по другим — становится перспективной мишенью для таргетной терапии и благоприятным фактором прогноза [40].

Результаты клинических исследований II фазы продемонстрировали эффективность анти-EGFR-терапии такими препаратами, как цетуксимаб (моноклональные антитела к EGFR) и эрлотиниб (ингибитор тирозинкиназного домена EGFR) отдельно или в сочетании с препаратами пиримидинового ряда и платины в терапии пациентов с прогрессирующим раком желчных протоков [8].

Заключение

Заболеваемость ВПХЦР растет во всем мире. Отсутствие специфических симптомов, а также их позднее выявление приводят к поздней диагностике заболевания, когда терапевтические стратегии неэффективны. Для улучшения результатов хирургического лечения пациентов необходимо детальное понимание молекулярно-генетических аспектов (патогенеза) заболевания. ВПХЦР отличается выраженной гетерогенностью мутационного статуса. Наиболее часто встречаются мутации генов KRAS, IDH1/2, NRAS, PIK3CA, MET, BRAF600, EGRF, ERBB. При этом к мутациям благоприятного прогноза можно отнести мутации генов IDH1/2, в то же время мутации генов MET, PIK3CA являются факторами неблагоприятного прогноза в отношении общей и безрецидивной выживаемости. В отношении влияния мутации гена KRAS на выживаемость больных после хирургического лечения продолжаются дискуссии. По результатам нашего исследования, мутация гена KRAS не оказала негативного влияния на прогноз. На результаты хирургического лечения большое влияние оказывают молекулярно-генетические нарушения, лежащие в основе патогенеза данного заболевания. Проведение молекулярно-генетического профилирования опухоли позволяет расширить понимание мутационного статуса ВПХЦР, а также выявить потенциальные мишени для молекулярно-ориентированной терапии. С другой стороны, сведения, полученные благодаря проводимым молекулярно-генетическим исследованиям, показали, что существуют различные генетические подтипы ВПХЦР, что требует индивидуального подхода к терапии каждого пациента.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования — Б.Н. Гурмиков, А.А. Грицкевич, А.В. Чжао

Сбор и обработка материала — Б.Н. Гурмиков, Л.А. Маринова

Статистическая обработка — Ю.А. Коваленко

Написание текста — Б.Н. Гурмиков

Редактирование — А.А. Пайчадзе, А.В. Чжао

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.