Прогностические возможности профиля экспрессии генов в определении риска рецидивирования рака молочной железы после органосохраняющего лечения

По данным ВОЗ, рак молочной железы (РМЖ) занимает второе место в структуре заболеваемости среди всей онкопатологии, уступая первенство лишь раку легкого. С 2008 по 2012 г. в мире наблюдается стойкая тенденция к росту заболеваемости (на 20%) и смертности (на 14%) от РМЖ [1]. Широкое распространение заболевания обусловливает его огромную медико-социальную значимость. Хирургическое лечение РМЖ на ранних (I—II) стадиях возможно в двух вариантах: в виде радикальных мастэктомий и органосохраняющих операций (ОСО). В то же время существует группа клинико-морфологических факторов, значительно повышающих риск развития локальных рецидивов (ЛР) после ОСО. К ним относят размер опухоли более 5 см, мультицентрический рост, расположение опухоли в центральном квадранте, молодой возраст (до 35 лет), близкое расположение опухоли к краю резекции (менее 2 мм), степень дифференцировки (G2—3), наличие внутрипротоковой опухолевой инвазии [2—9]. При отсутствии этих неблагоприятных факторов органосохраняющие операции являются операциями выбора при ранних (I—II) стадиях РМЖ. Так, в Великобритании за период с 2005 по 2008 г. 58% первично выявленных опухолей молочной железы подвергалось органосохраняющему лечению (ОСЛ) [10]. Широкое внедрение ОСЛ в клиническую практику отражено в клинических рекомендациях по лечению РМЖ, таких как ESMO, NCCN и ряде национальных рекомендаций некоторых европейских стран. Проведение дистанционной лучевой терапии на ложе первичной опухоли и грудную стенку является обязательным условием при ОСО РМЖ, значительно снижающим риск развития Л.Р. Наиболее крупным исследованием по изучению влияния лучевой терапии на риск развития местных рецидивов при РМЖ является NSAPB B-6, в рамках которого показано снижение частоты ЛР с 39,2 до 14,3% при послеоперационном облучении грудной клетки и ложа опухоли [11]. Схожие закономерности выявляются и для рака in situ в рамках клинического протокола NSAPB B-17, где при добавлении к ОСО послеоперационной лучевой терапии достигается снижение частоты ЛР с 19,4 до 8,9% [12].

Размер опухоли является одним из главных критериев при решении целесообразности выполнения ОСО. При опухолях менее 1 см риск развития ЛР после ОСО не превышает 10% в течение 10 лет и 12% в течение 20 лет [13, 14]. При этом с увеличением размера опухоли повышается риск развития Л.Р. Так, в исследовании EORTC изучались пациентки с размером опухоли от 2 до 5 см, при этом 10-летний риск появления ЛР составил 19,7% [15].

Также описана связь частоты ЛР с иммуногистохимическими характеристиками опухоли, такими как наличие рецепторов эстрогена (РЭ), прогестерона (РП), экспрессия HER2/neu и Ki-67. В исследованиях K. Voduс, W.-J. Jia и N. Arvold и соавт. [16—18] показана высокая частота развития ЛР при HER2, экспрессирующем и «трижды негативном» подтипах РМЖ. Так, в исследовании K. Voduc и соавт. риски местного и регионарного рецидивов РМЖ после ОСО для люминального, А типа составили 8 и 3%, для HER2 экспрессирующего — 21 и 16%, для «трижды негативного» — 14% для каждого из видов рецидивирования соответственно. Интересным представляется исследование японских авторов [19], проведших сравнение иммуногистохимических факторов прогноза в первичной опухоли и рецидивах РМЖ. Авторы обнаружили, что высокий уровень Ki-67 в рецидивной опухоли имел корреляцию с уменьшением времени до возникновения отдаленных рецидивов.

Последние достижения медицины связаны с углублением знаний о молекулярно-генетических особенностях РМЖ; биологических процессах, протекающих в нормальных и опухолевых клетках, механизмах их регуляции; путях активации опухолевого роста, а также выявлением новых прогностических маркеров и разработкой таргетной терапии. Оценивая генетические особенности опухоли можно определить вероятность развития рецидивов и прогнозировать выживаемость пациенток [20]. Разработаны и активно внедряются в клиническую практику такие генетические тесты, как oncotype DX и mammaprint, оценивающие риски отдаленного метастазирования и необходимость назначения системной химиотерапии [21]. Данные тесты позволяют комплексно оценить опухолевый потенциал, способность опухоли к отдаленному и регионарному метастазированию. Также в литературе встречаются работы, пытающиеся оценить связь генетических свойств опухоли с вероятностью развития ЛР [22, 23]. В исследовании E. Mamounas и соавт. [24] использовалась 21-генная сигнатура, при этом удалось выделить 3 группы риска развития ЛР у пациенток с РМЖ, при этом соотношение составило 4,3, 7,2 и 15,8% для групп низкого, среднего и высокого риска. D. Nuyten и соавт. [22] изучали уровень экспрессии генов на основе 70-генной сигнатуры, при этом удалось выделить группы низкого (5%) и высокого (29%) риска развития локорегионарных рецидивов. Чувствительность данного метода составила 87,5%, специфичность — 75%. Полученные положительные результаты создают предпосылки для более глубокого изучения проблемы локального рецидивирования при РМЖ.

Мы исследовали профиль экспрессии из 21 гена в ткани операционного материала рака молочной железы для оценки возможности построения модели прогноза ЛР.

В исследовании были изучены истории болезни и образцы опухолевой ткани 91 пациентки, перенесших комплексное органосохраняющее лечение по поводу РМЖ за период с 2003 по 2011 г. У 26 пациенток отмечено прогрессирование в виде ЛР, у 65 пациенток наблюдалась ремиссия более 5 лет. Средний возраст пациенток составил 47,7±9,5 года. При оценке размера опухоли pT1 (опухоли до 2 см) отмечены в 9 случаях возникновения ЛР и в 55 случаях ремиссии; pT2 (опухоли от 2 до 5 см) — в 17 случаях развития ЛР и в 10 случаях ремиссии. Мультицентрический опухолевый рост выявлен в 2 случаях при развитии ЛР и в 1 случае при ремиссии.

Анализировали уровень экспрессии мРНК генов Ki-67, STK-15, CCNB1, CCND1, MYC, MYBL2, P16INK4A, PTEN, BIRC5, BCL2, BAG1, TERT, NDRG1, ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1, MMP11, CTSL2, CD68. Выделение РНК из материала опухоли выполняли согласно инструкции с помощью наборов реагентов для выделения РНК RNeasy Plus Mini Kit («Qiagen», США). Реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили с использованием наборов НПО «ДНК Технология» согласно инструкции. Статистический анализ проводили при помощи программы StatSoft Statistica 10.

В исследовании был выполнен ретроспективный сравнительный анализ экспрессии 21 гена в образцах опухолей больных, у которых наблюдался местный рецидив в различные сроки после лечения, с группой ремиссии. Медиана наблюдения в группе пациентов с прогрессированием составила 75,1 мес, в группе прогрессирования — 43,6 мес. Для оценки различия уровней экспрессии генов использовали дисперсионный анализ. В табл. 1 представлены средние значения и достоверность различия средних уровней экспрессии исследованных генов.

Следует отметить, что увеличение уровня экспрессии генов в группе пациенток с ЛР наблюдается для Ki-67 (р<0,01), STK15 (р<0,02), CTSL2 (р<0,02) и CD68 (р<0,01). При этом отмечается статистически достоверное снижение уровня экспрессии для генов MYC (р<0,02), BAG1 (р<0,01), PGR (р<0,03) и ESR1 (р<0,05). Прослеживается закономерность, что увеличение уровня экспрессии в основном относится к группе генов, отвечающих за контроль клеточного деления и межклеточные взаимодействия, а снижение уровня экспрессии характерно для группы генов, ответственных за контроль процессов апоптоза и тканевую дифференцировку.

Обнаруженные статистически значимые различия позволили предположить существование биологических предпосылок, характеризующих высокий риск местного рецидивирования.

Используя клинические данные (размер опухоли, стадию заболевания) и 21-геннную сигнатуру произведен факторный анализ. Выделено 3 фактора, объясняющих 48% дисперсии общей выборки (табл. 2, рис. 1).

В представленной таблице и на графике видно, что первые 3 фактора объясняют 48% общей дисперсии выборки.

Цифровое значение используемых клинических признаков и данные экспрессии генов представлены в табл. 3.

При сравнительной оценке основными компонентами 1-го фактора являются гены PGR, ESR1, BAG1, BCL2, HER2; 2-го фактора — Ki-67, MYBL2, STK15 и для 3-го фактора — показатели, оценивающие поражение регионарных лимфатических узлов (л/у) (количество, соотношение между нормальными и метастатически пораженными лимфатическими узлами, стадия заболевания). Остальные компоненты занимают промежуточное значение. Если сравнить полученные данные с уровнем экспрессии соответствующих генов при прогрессировании и ремиссии (см. табл. 1), становится ясно, что 1-й фактор объединил гены, уровень экспрессии которых снижается при прогрессировании (кроме HER2, значение этого гена одинаково для группы прогрессирования и ремиссии), тогда как 2-й фактор объясняет повышение экспрессии объединяемых генов. Выявляемая закономерность соответствует биологической функции исследуемых генов. Фактор 1 сгруппировал гены, ответственные за дифференцировку, поддержание клеточного гомеостаза и апоптоз. Фактор 2 объединил гены опухолевой агрессии. Фактор 3 описывает изменения клинических показателей, оценивающих лимфатический статус (рис. 2).

Мы использовали выявленные различия в уровне экспрессии генов для создания прогностической модели с целью определения вероятности возникновения ЛР после органосохраняющих операций на основе дискриминантного анализа. При этом применили те же критерии, что и при построении факторного анализа. Полученные дискриминантные функции позволяют распознать ЛР для 73% пациенток с ЛР (верно классифицировано 19 пациенток с прогрессированием из 26) и исключить развитие местного рецидива в 92,3% случаев (верно классифицировано 60 пациенток без прогрессирования из 65). Общая диагностическая ценность представленной модели составляет 86,8% (табл. 4).

Полученные нами данные позволяют предположить, что появление местного рецидива после ОСО РМЖ может быть связано с молекулярным фенотипом опухоли. При развитии ЛР мы получили статистически значимое повышение уровня экспрессии маркеров пролиферации и межклеточных взаимодействий. При этом отмечается снижение экспрессии маркеров дифференцировки и апоптоза. Выявленные закономерности в изменении уровня экспрессии генов при развитии ЛР указывают на биологическую активность данных опухолей. В то же время необходимо учитывать такие морфологические признаки, как размер опухоли, ее локализацию (в центральном квадранте), степень лимфогенной диссеминации, которые влияют на частоту развития местного рецидива после органосохраняющих операций [25]. Также известно, что размер опухоли коррелирует с уровнем пролиферативной активности опухолевых клеток, со степенью их дифференцировки, уровнем экспрессии иммуногистохимических маркеров (рецепторы эстрогена, прогестерона, маммаглобина и т. д.) [26]. Сопоставление особенностей экспрессионного профиля опухоли с ее морфологической картиной, а также с исходом заболевания дает возможность прогнозировать результаты лечения и более обоснованно оценивать риск развития рецидива заболевания в случае выбора той или иной тактики лечения.

Использование экспрессионных данных для решения разных задач прогноза широко исследуется в настоящее время в различных областях молекулярной диагностики и особенно в онкологии. Ряд генетических сигнатур используется в клинической практике и научных исследованиях [27—30]. Как правило, эти методы не учитывают характер проведенного хирургического лечения и нацелены на определение риска отдаленного метастазирования. Мы использовали анализ экспрессионных данных для решения конкретной задачи — прогноза ЛР при экономных резекциях молочной железы. Использование 21-генной сигнатуры при построении дискриминантного анализа позволило нам разработать математическую модель, распознающую ЛР в 73% случаев в исходной выборке пациенток и позволяющую исключить развитие местного рецидива в 92,3% случаев. Эти результаты позволяют высказать предположение о возможном практическом их применении после проведения валидации полученной модели на расширенной группе больных.

Применение алгоритма позволит оптимизировать программы комплексного и комбинированного лечения пациенток с РМЖ, включающие органосохраняющий вариант хирургического этапа лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Б.В.К., Ч.В.Д.

Сбор и обработка материала: П.М.А., Т.И.Д., З.М.В, К.Е.А.

Статистическая обработка данных: П.М.А., Т.И.Д.

Написание текста: П.М.А., Т.И.Д.

Редактирование: Б.В.К., Ч.В.Д., К.Е.А.

Конфликт интересов отсутствует.