Метастазы являются основной причиной смерти от рака. В процессе аноикоза опухолевые клетки отделяются от первичной опухоли и распространяются в отдаленные органы [1]. Трансфер этих клеток осуществляется через вторжение в сосудистую и/или лимфатическую системы. Движение биологических жидкостей по сосудам имеет свои особенности [2, 3], которые отличаются от классической гидродинамики, что нельзя не учитывать при изучении процессов метастазирования [4, 5].

Васкуляризация опухоли широко применяется в качестве достоверного показателя роста опухоли, метастазирования и выживаемости пациентов. В 1996 г. P. Vermeulen и соавт. [6] опубликовали первый международный консенсус в отношении методологии и критериев количественной оценки ангиогенеза солидных опухолей, а спустя 5 лет — второй [7], в котором были интегрированы новые понятия и механизмы опухолевой васкуляризации. Оба консенсуса были направлены на улучшение стандартизации количественного определения степени выраженности интратуморального ангиогенеза с целью применения в качестве прогностического показателя и как достоверный предиктор риска злокачественной трансформации предраковых поражений и ответа на лечение рака. В отличие от интратуморального ангиогенеза, формирование лимфатических сосудов de novo (неолимфангиогенез) и его роль в метастазировании опухолевых клеток лишь недавно стало центром исследований рака, что проявилось увеличением числа исследований, показывающих связь между выживаемостью пациентов и плотностью лимфатических сосудов различных типов опухолей.

Различия в степени выраженности неолимфангиогенеза у больных раком молочной железы (РМЖ) стали предпосылками в изучении взаимосвязи между лимфатической плотностью сосудов и выживаемостью пациенток. Однако в настоящее время для количественной оценки неолимфангиогенеза исследователи используют различные методы. Для оценки показателей неолимфангиогенеза у онкологических больных чаще всего используется ряд методов, основанных на взаимодействии антиген—антитело (иммуногистохимия, твердофазный иммуноферментный анализ и проточная цитометрия), а также метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [8].

Высокочувствительные варианты иммуногистохимического анализа позволяют с помощью моноклональных антител выявлять VEGFC, VEGFD, VEGFR3, а также характерные для эндотелия лимфатических сосудов антигены. Сегодня используется много коммерческих препаратов антител против VEGFC, VEGFD или VEGFR3 с разной чувствительностью и специфичностью, что не позволяет стандартизировать метод [8].

Биомаркер LYVE1, позволяющий дифференцировать лимфатические и кровеносные капилляры, был открыт в 1999 г. [9]. Бо́льшая часть исследований, посвященных изучению неолимфангиогенеза в опухолевой ткани, была проведена с применением антиLYVE1-антител. Однако снижение экспрессии LYVE1 в некоторых тканях при воспалительных реакциях, а также отсутствие этого маркера в отдельных опухолеассоциированных клетках эндотелия лимфатических сосудов показывает, что для более адекватной оценки неолимфангиогенеза необходимо использовать LYVE1 в комбинации с другими маркерами [10]. В последнее время выявлено более 30 белков, экспрессия которых является характерной для клеток, формирующих эндотелий лимфатических или кровеносных сосудов. Для оценки плотности лимфатических сосудов чаще других (помимо LYVE1) используют такие биомаркеры, как подопланин-2 и Prox1 либо их комбинации с другими специфическими молекулами в зависимости от типа исследуемой ткани [8].

К существенным недостаткам метода иммуногистохимии следует отнести субъективизм оценки конкретного исследователя и использование различных критериев учета антигенположительных клеток, что затрудняет сравнение результатов, полученных разными специалистами.

Применительно к неолимфангиогенезу метод проточной цитометрии позволяет выявлять популяции клеток, экспрессирующих антигены эндотелия лимфатических сосудов либо антигены, которые специфичны для предшественников таких клеток [8].

ПЦР предназначена для выявления в образце ткани заданной мРНК, а модификация этого метода позволяет определять содержание мРНК количественно. Следует отметить высокую специфичность выявления продуктов амплификации за счет использования специально подобранных праймеров, а также быстроту метода. С помощью метода ПЦР в реальном времени была выявлена корреляция между экспрессией VEGFC в опухолевой ткани пищевода и наличием метастазов в лимфатических узлах [11]. Следует, однако, заметить, что анализ методом ПЦР не позволяет определить, в каких именно клетках экспрессируется выявляемый ген (опухолевые клетки или примыкающие к ним клетки нормальных тканей). Кроме того, как известно, экспрессия гена на уровне мРНК не всегда отражает реальное содержание его белкового продукта [8].

При наличии определенных преимуществ у каждого из вышеописанных методов количественной оценки выраженности неолимфангиогенеза они не характеризуют степень выраженности реализованных в процессе неолимфангиогенеза лимфатических сосудов, которые и являются элементом логистики раковых клеток из первичного очага. То есть наличие факторов, ответственных за образование новых лимфатических сосудов, и их обратная корреляция с выживаемостью пациентов не доказывают наличия развитой сети лимфатических сосудов как логистического звена лимфогенного метастазирования.

Цель исследования — оценить влияние реализованного перитуморального постнатального индуцированного неолимфангиогенеза на выживаемость при РМЖ.

Исследование выполнено на базе НИИ онкологии Башкирского государственного медицинского университета и Республиканского клинического онкологического диспансера Минздрава Республики Башкортостан с 2009 по 2014 г.

Исследовали комплексы тканей аксиллярной области, взятые у 100 женщин во время хирургического вмешательства по поводу РМЖ IIIB стадии в 2009 г.

Выделение лимфатических узлов и сосудов из тканей аксиллярной области производили с помощью ультразвукового аппарата LySonix 3000 с PulseSelect оригинальным методом, разработанным профессором Ш.Х. Ганцевым (рис. 1).

Документальную фиксацию микроанатомических препаратов лимфатического коллектора аксиллярной области производили цифровой камерой Canon EOS 5D Mark II (21,1-мегапиксельная CMOS-матрица размером 24×36 мм и максимальная чувствительность ISO до 25 600). При съемке использовали автоматическую калибровку показателей ISO. Степень выраженности реализованных лимфатических сосудов в процессе неолимфангиогенеза определяли путем подсчета количества «фокусов» перитуморального постнатального индуцированного неолимфангиогенеза. За точку «фокуса» принимали анастомоз между отдельными лимфатическими сосудами. Для субъективного удобства анализировались инвертированные по цвету фотоснимки с целью улучшения контрастности изображения (рис. 2).

Маркеры «фокусов» наносили на отдельный графический слой в программе Adobe Photoshop CC и затем извлекали в отдельный файл с белым фоном. Количество «фокусов» подсчитывали в автоматическом режиме с помощью программы Image Pro plus 6.0 (рис. 3). Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием стандартных программных продуктов MS Excel 2013 и программ Statistica 10.0. В качестве руководства для статистической обработки использовали материалы Статистического анализа медицинских данных [12].

Для статистической обработки была произведена выборка данных пациенток, умерших от РМЖ в течение 5 лет с момента операции.

Для исследования взаимосвязи признаков вычисляли коэффициенты корреляции методом параметрического анализа по Пирсону. Метод Пирсона более адекватен в данном случае, так как анализируемые данные являются количественными. Нормальность рядов данных определяли с помощью пакета Statistica 10.0.

За период наблюдения (2009—2014 гг.) от прогрессии основного заболевания (РМЖ) из 100 пациенток умерли 16. Для этих пациенток была произведена маркировка «фокусов» перитуморального постнатального индуцированного неолимфангиогенеза, а также рассчитана продолжительность жизни после радикального хирургического лечения. Полученные результаты представлены в таблице.

Распределение значений количества «фокусов» перитуморального постнатального индуцированного неолимфангиогенеза и продолжительность жизни после радикального хирургического лечения при РМЖ в корреляционном поле представлено на рис. 4.

Таким образом, параметрическому корреляционному анализу Пирсона были подвергнуты 16 пар признаков, коэффициент корреляции (r) составил 0,87, коэффициент детерминации (R²) — 0,7488, p=0,000015, что свидетельствует о высокой прямой корреляционной зависимости выживаемости пациенток от количества «фокусов» перитуморального постнатального индуцированного неолимфангиогенеза при РМЖ IIIB стадии.

Определение прогностического потенциала реализованного неолимфангиогенеза на течение опухолевого процесса может иметь уточняющее значение в индивидуальной тактике при РМЖ, а также расширить понимание его роли в канцерогенезе. Лимфатическая система, безусловно, является важным компонентом метастазирования опухолей. Несмотря на то что в последнее время зарубежные исследователи значительное внимание уделяют молекулярным механизмам метастазирования и его сопровождающим процессам, вопросы гидродинамической логистики лимфы как средства трансфера раковых клеток требуют дополнительного изучения. Противостояние метастазированию является одним из ключевых моментов в лечении онкологических больных. Дальнейшее понимание роли постнатального индуцированного неолимфангиогенеза в метастазировании опухолей важно как для прогноза онкологического заболевания, так и для разработки новых лекарственных препаратов, обладающих антиметастатической активностью.

1. При РМЖ IIIB стадии имеется статистически значимая прямая корреляция между количеством «фокусов» перитуморального постнатального индуцированного неолимфангиогенеза и продолжительностью жизни после радикального хирургического лечения (r=0,87; R²=0,7488; p=0,000015).

2. Реализованные лимфатические сосуды в процессе перитуморального индуцированного неолимфангиогенеза являются показателем состояния компенсаторно-защитных ресурсов при РМЖ.

3. Макроанатомические исследования реализованных лимфатических сосудов в процессе перитуморального индуцированного неолимфангиогенеза дополняют оценку состояния перитуморального лимфатического бассейна при раке.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ш. Х.Г.

Сбор и обработка материала: Ш. Р.К., Д.С.Т.

Написание текста: Ш. Р.К.

Редактирование: Р.Ш.И.

Конфликт интересов отсутствует.