Плоскоклеточный рак кожи является распространенным типом злокачественного новообразования кожи. При этом ультрафиолетовое излучение рассматривается как один из основных этиологических факторов данной патологии [1]. К ключевым механизмам повреждающего действия ультрафиолетового излучения относится повышение продукции активных форм кислорода, которые могут приводить к возникновению мутаций, обеспечивая изменения функционирования онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста [2].
К наиболее важным компонентам антиоксидантной системы в коже относятся три фермента — каталаза, тиоредоксинредуктаза и глутатионпероксидаза. Каталаза катализирует превращение перекиси водорода в воду и кислород [3]. Описан полиморфизм гена каталазы в промоторной области (–262C>T), который приводит к нарушению связывания транскрипционных факторов и вызывает снижение экспрессии гена каталазы, а также дальнейшее изменение активности фермента [4]. Показано, что данный полиморфизм ассоциирован с повышением риска развития рака молочной железы [5]. С учетом роли ультрафиолетового излучения в развитии плоскоклеточного рака нами было выполнено исследование для выяснения возможной связи между вариантами генотипа по каталазе и риском развития плоскоклеточного рака кожи. Целью настоящей работы являлось определение частоты распределения полиморфных вариантов гена каталазы у здоровых людей — жителей Красноярского края, а также у больных плоскоклеточным раком кожи для выявления взаимосвязи между полиморфизмом (–262C>T) и заболеваемостью этим видом новообразования.
Материалы и методы
Данное исследование было одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» и выполнено с использованием 50 образцов биоптатов кожи, полученных от больных плоскоклеточным раком кожи. В качестве контроля исследования полиморфизма использовали 103 образца венозной крови лиц, у которых на данный момент не было диагностировано заболеваний, в том числе связанных с нарушением окислительно-восстановительных процессов (сахарный диабет, атеросклероз), а также онкологических. Для выявления точковой мутации (–262C>T) в гене каталазы использовали метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).
Для получения ДНК из биоптатов кожи производили предварительную депарафинизацию образцов ксилолом по стандартной методике. После депарафинизации образцы ткани заливали лизирующим раствором (комплект реагентов ДНК-сорб В, «AmpliSens», Россия) и инкубировали в течение ночи при температуре 55 °С. Для получения ДНК из мононуклеаров периферической крови образцы крови центрифугировали при 2700 об/мин в течение 15 мин, осторожно отбирали клетки дозатором и переносили в микроцентрифужную пробирку. Дальнейшее выделение ДНК осуществляли при помощи комплекта реагентов ДНК-сорб В («AmpliSens», Россия).
Праймеры 5’-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATAT-3’ и 5’-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3’ (ООО «Сибэнзим», Новосибирск) были созданы по последовательности, описанной R. Zarbock и соавт. [6] для представления сайта рестрикции EcoR V в диком аллеле (GATATC). Амплификация проводилась на амплификаторе BIS Termocycler в объеме 25 мкл, содержащем ПЦР буфер, 1,5 ммоль/л MgCl2 (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), 0,2 мкмоль/л каждого праймера, 0,1 ммоль/л dNTPs (5х dNTPs mix, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), 0,625 единиц TaqF полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и около 50 нг выделенной ДНК. Условия ПЦР, также описанные R. Zarbock и соавт. [6], были изменены в сторону увеличения количества циклов до 40: первоначальная денатурация при 95 °С — 15 мин, и 40 циклов денатурации при 94 °С — 1 мин, отжига праймеров при 68 °С — 1 мин, элонгация при 72 °С — 1 мин и 15 мин при 72 °С для конечной элонгации. Длина полученного ПЦР-продукта составляла 190 п.н. Полученные ампликоны переосаждались по стандартной методике и подвергались рестрикции с помощью рестриктазы EcoR V при температуре 37 °С в течение 20 ч. В случае отсутствия в гене каталазы мутации в положении –262 ПЦР-продукты содержали цитозин в качестве 36-го нуклеотида и разрезались на фрагменты массой 157 и 33 п.н. При наличии мутации (предположительно, замены С –262Т) сайт узнавания рестриктазой нарушался, и продукт длиной 190 п.н. оставался неразрезанным. Эффективность рестрикции определяли методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле.
Для статистического расчета соответствия распределения генотипов закону Харди—Вайнберга использовали программное обеспечение MS Excel 2007 («Microsoft»). Расчет достоверности p осуществляли при помощи программного обеспечения WolframAlpha (http://www.wolframalpha.com/). Для оценки относительных шансов (Odds ratio, OR) и 95% доверительного интервала (Confidence Interval, CI) использовали программу GraphPad InStat v 3.10 (www.graphpad.com).
Результаты
После рестрикции эндонуклеазой EcoR V гомозиготу C/C определяли на электрофорезе как укороченный фрагмент ДНК длиной 157 п.н. Среди 103 исследованных лиц гомозигота С/С была выявлена у 71 человека.
Полиморфизм С/Т, определяемый как частичное разрезание фрагмента ДНК с выявлением в полиакриламидном геле приблизительно равного количества фрагментов укороченных и исходных ампликонов (157 и 190 п.н. соответственно), был выявлен у 26 человек. Вариант Т/Т обнаруживался по отсутствию рестрикции ферментом EcoR V, в результате чего на электрофорезе выявлялся лишь цельный амплифицированный фрагмент длиной 190 п.н. Такая гомозиготная мутация обнаружилась у 6 человек.
В случае плоскоклеточного рака из 50 образцов биоптатов лишь 3 показали полиморфизм С/Т. Образцов с генотипом Т/Т обнаружено не было (рисунок).
Общее распределение генотипов в популяции жителей Красноярска соответствует равновесию Харди—Вайнберга при χ2=2,67 и достоверности p=0,10.
Отношение рисков развития плоскоклеточного рака кожи в исследуемых группах составило 0,14 при 95% доверительном интервале 0,04—0,45 и достоверности p=1·10–4. Таким образом, наличие полиморфизма (–262C>T) в промоторной части гена каталазы в положении –262 показало достоверное снижение риска развития плоскоклеточного рака.
Обсуждение
Известно, что у носителей мутантного аллеля — Т/Т определяется снижение уровня фермента каталазы в меланоцитах, что приводит к их повреждению активными формами кислорода с последующей гибелью, вызывая снижение уровня меланина в коже и появление депигментированных пятен [7].
В нашем исследовании выявлено, что носители мутантного аллеля гена каталазы в меньшей степени подвержены развитию плоскоклеточного рака кожи, что может быть обусловлено сниженным уровнем антиоксидантной активности каталазы и обеспечивать более быструю гибель поврежденных клеток в условиях окислительного стресса. В то же время у носителей генотипа С/С под воздействием активных форм кислорода может наблюдаться сохранение мутированных клеток, которые затем могут формировать клон опухолевых клеток. Дальнейшее исследование роли полиморфизма каталазы, а также других компонентов антиоксидантной системы необходимо для оптимизации профилактики развития эпителиальных опухолей кожи, радиорезистентности, а также выяснения особенностей функционирования данных белков.
Заключение
У носителей мутантного аллеля гена каталазы Т/Т регистрируется пониженная вероятность развития плоскоклеточного рака кожи, что может быть обусловлено гибелью поврежденных кератиноцитов без дальнейшей их опухолевой трансформации в отличие от лиц — носителей генотипа Т/Т.