Маркеры апоптоза и белки-регуляторы клеточного цикла при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки

В связи с увеличением частоты аденокарциномы шейки матки возникает повышенный интерес к изучению фоновых и предраковых изменений железистого эпителия. Особое место при этом занимает иммуногистохимическое исследование.

В литературе появилось значительное число публикаций, касающихся иммуногистохимического исследования при изменениях железистого эпителия шейки матки. Предполагается, что наибольшую диагностическую ценность имеют следующие маркеры: белки-регуляторы клеточного цикла и апоптоза (р16, р53), маркер пролиферативной активности Ki-67.

р16 является регулятором клеточного цикла. Данный белок ингибирует взаимодействие циклина D1 и циклинзависимых киназ 4 и 6 [1]. В отсутствие р16 циклинзависимые киназы связываются с циклином D1 и происходит фосфорилирование pRb (retinoblasroma protein), что ведет к его инактивации в контрольной точке G1/S и запуску пролиферации клетки [2].

При предраковых изменениях эпителия шейки матки происходит повышение экспрессии р16 [3—9]. Механизм остается не до конца ясным, но взаимодействие р16 с pRb является центральным элементом большинства концепций. Известна способность рRb осуществлять негативную регуляцию синтеза р16INK4A [3]. При этом, по данным некоторых авторов, экспрессия pRb уменьшается с нарастанием степени дисплазии, что подтверждает теорию гиперэкспрессии р16 вследствие инактивации pRb в клетках цервикального эпителия [4]. Важную роль в инактивации pRb играет вирус папилломы человека (ВПЧ) [5]. В настоящее время доказано участие ВПЧ в канцерогенезе аденокарцином шейки матки [6]. Таким образом, кажущаяся на первый взгляд парадоксальной для опухолевых клеток гиперэкспрессия белка р16INK4A при цервикальной аденокарциноме может служить индикатором злокачественной трансформации клеток железистого эпителия шейки матки.

Белок р53 является супрессором опухолевого роста. При повреждении ДНК р53 вызывает остановку клеточного цикла в точке G1 путем взаимодействия с pRb и активирует белки, ответственные за репарацию ДНК. Если репарация безуспешна, р53 индуцирует апоптоз. Таким образом, он контролирует переход клетки в S-фазу клеточного цикла, деление клетки, является транскрипционным фактором и играет важную роль в регуляции клеточного роста, репарации ДНК, индукции апоптоза.

Результаты исследований экспрессии р53 в нормальном эпителии и при предраковых изменениях противоречивы. Все доброкачественные изменения железистого эпителия обычно не содержат или экспрессируют в незначительном количестве р53 и р16 [7], в то время как аденокарцинома insitu (AIS) чаще всего имеет выраженную экспрессию р53 (>10% клеток), р16 (диффузно, >25% клеток) и высокий митотический индекс [8—12].

Значимым маркером для дифференциальной диагностики рака, предрака и доброкачественных неопухолевых изменений железистого эпителия является белок р27.

р27 — ингибитор циклинзависимой киназы, вызывает остановку клеточного цикла в фазе G1. В нормальных эпителиальных клетках при стимуляции TGFβ р27 вызывает остановку клеточного цикла в точке G1 [8]. p27 связан с комплексом циклин Е/CDK2 и, таким образом, может ингибировать фосфорилирование pRb. При гиперэкспрессии р27 блокируется переход клетки в S-фазу клеточного цикла [9]. Снижение экспрессии р27 или его отсутствие свидетельствует о более агрессивном клиническом поведении различных опухолей, в том числе рака молочной железы, легкого, толстой кишки, желудка и яичников [10].

B. Goff и соавт. [11], показали, что р27 активно экспрессируется в нормальной шейке матки как в строме, так и в эпителии. Y. Kim и соавт. [12] также сообщают о высоком уровне экспрессии р27 в нормальных тканях шейки матки. В некоторых работах было показано, что экспрессия р27 значительно ниже у пациентов с плоскоклеточным раком шейки матки по сравнению с нормальным или диспластическим плоским эпителием. Так, A. Sgambato и соавт. [8] выявили, что снижение уровня р27 происходит также и в предраковых изменениях плоского эпителия шейки матки, причем оно становилось более явным при прогрессии от слабой дисплазии к тяжелой и к инвазивному раку [9, 10]. Экспрессия р27 при фоновых и диспластических изменениях железистого эпителия шейки матки так же как и при аденокарциноме не изучена.

Исследование проводилось на архивном материале патологоанатомического отделения МНИОИ им. П.А. Герцена за 1999—2011 гг. В работе использован операционный и биопсийный материал от 118 пациенток с аденокарциномой шейки матки. В исследованном материале были выявлены различные сочетания доброкачественных фоновых и предраковых изменений. Распределение по характеру фоновых и предраковых изменений эпителия представлено в табл. 1.

Для проведения иммуногистохимического исследования использовалась панель моноклональных антител к белкам-регуляторам клеточного цикла (р16, мутантному р53, р27), маркеру пролиферативной активности (Ki-67). С парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм, которые монтировали на высокоадгезивные стекла («Menzel GmbH&Co KG», Германия). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи специализированной системы EnVision Flex («Dako», Дания). ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме с помощью автостейнера Dako. В каждой серии препаратов использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли.

Оценку реакции белков, экспрессирующихся в ядрах клеток (р53, р27, Ki-67) производили путем подсчета количества окрашенных ядер на 100 ядер препарата в 3 полях зрения (×40), выражая полученные результаты в процентах [13, 14]. Оценку реакции с р16 производили по системе, предлагаемой фирмой-производителем набора и широко используемой во многих исследованиях [15].

Анализ результатов проводили при помощи пакета программ STATISTICA 6.0, используя U-тест Манна—Уитни для двух независимых групп данных. Уровень значимости (p) принимали равным 0,05.

При изучении характера экспрессии белка р16 была выявлена ядерно-цитоплазматическая реакция. При доброкачественных изменениях железистого эпителия в подавляющем большинстве групп экспрессия маркера не выявлялась. Лишь в тубоэндометриоидной метаплазии (ТЭМ) и туннельных кластерах типа А и В отмечалась положительная реакция с р16. При проведении статистического сравнения значимых различий в экспрессии р16 обнаружено не было.

При дисплазии железистого эпителия I степени в 78,4% случаев окрашивание не выявлялось. В 6 (16,2%) случаях наблюдалась умеренная реакция с р16. Выраженная реакция с р16 отмечена лишь в 2 (5,4%) наблюдениях. Сходные результаты получены при дисплазии II степени: в 36 (63,1%) наблюдениях экспрессия р16 не выявлялась. Умеренная реакция наблюдалась в 24,6%, а выраженная экспрессия — в 12,3% случаев. Несмотря на то, что имеется тенденция к увеличению экспрессии маркера при дисплазии II степени, статистически значимых различий между дисплазией I и II степени не получено.

При дисплазии железистого эпителия III степени положительная экспрессия р16 выявлялась в 89,9%, при этом выраженная реакция отмечена в 30 (66,7%) случаях. При статистическом анализе выявлено, что экспрессия белка при дисплазии III степени значимо выше, чем при дисплазии II и I степени (р<0,05). При AIS железистого эпителия шейки матки маркер выявлялся в 89,1% случаев. При сравнении с данными при дисплазии III степени значимых различий не обнаружено (p>0,05), однако при сравнении с группами дисплазии I и II степени выявлена статистически значимая разница (p<0,05).

Данные по экспрессии маркера р16 при диспластических изменениях железистого эпителия и аденокарциноме шейки матки приведены в табл. 2.

Таким образом, значимое различие в экспрессии р16 выявлено между группами дисплазии I—II степени и дисплазии III/AIS, что косвенно подтверждает целесообразность разделения предраковых изменений железистого эпителия на 2 группы.

Белок р53 не выявлялся при большинстве доброкачественных неопухолевых изменений железистого эпителия. Экспрессия р53 наблюдалась только в ТЭМ и при реактивных изменениях эпителия. При ТЭМ в 6 наблюдениях выявлялась выраженная ядерная экспрессия маркера в 10—50% клеток. В предраковых изменениях отмечалась тенденция к увеличению уровня экспрессии р53 с нарастанием степени дисплазии, однако статистически значимых различий между исследованными группами обнаружено не было. Интересно, что экспрессия р53 в AIS наблюдалась в тех случаях, где структуры инвазивной аденокарциномы демонстрировали высокую ядерную экспрессию р53. При статистическом сравнении реакции с р53 в группах ТЭМ и дисплазий значимых различий выявлено не было.

Белок р27 выявлялся в 48,1% случаев при ТЭМ. В туннельных кластерах типа В наблюдалась гетерогенная экспрессия маркера: в 5 (62,5%) случаях реакция не выявлялась, а в 3 (37,5%) определялась выраженная экспрессия белка. В незаращенных остатках мезонефроса интенсивность реакции была распределена в равных пропорциях. При микрогландулярной гиперплазии в 13 (76,5%) наблюдениях окрашивание не выявлялось, а в 4 (23,5%) — наблюдалась выраженная реакция. При предраковых изменениях железистого эпителия обнаружена гетерогенная экспрессия р27. При дисплазии эпителия I и II степени выявлена положительная реакция в 48,6 и 56,1% наблюдений соответственно. При дисплазии III степени и AIS отмечено значительное преобладание случаев с положительной экспрессией р27 (86,9%). Таким образом, более высокий уровень экспрессии р27 выявлялся при предраковых изменениях железистого эпителия, однако статистически значимых различий между доброкачественными и предраковыми изменениями не обнаружено.

Экспрессия Ki-67 при доброкачественных изменениях эпителия не превышала 5%. Статистически значимой разницы между группами не обнаружено (p>0,05). При дисплазии железистого эпителия I степени в 24 (64,9%) случаях наблюдалась положительная реакция, причем пролиферативная активность была низкой (менее 5% клеток). При дисплазии железистого эпителия II степени, как и при дисплазии I степени, экспрессия наблюдалась в 43 (75,4%) случаях, при этом в 20 (35,1%) из них преобладала умеренная реакция (6—20% клеток). При дисплазии III степени и AIS положительная экспрессия Ki-67 выявлялась в 100% наблюдений. Однако при AIS уровень пролиферативной активности был выше (более 60% клеток). Таким образом, при дисплазии I и II степени уровень экспрессии маркера Ki-67 значимо ниже, чем при дисплазии III степени и AIS (p<0,05).

Проведенное нами иммуногистохимическое исследование помогло в некоторой степени определить биологическую сущность, прогностическую значимость, дифференциальную диагностику предраковых и фоновых изменений железистого эпителия шейки матки. Среди изучаемых маркеров особый интерес представляют, на наш взгляд, p16 и Ki-67.

Экспрессия р16 нарастала с увеличением степени дисплазии, что соответствует данным литературы [3, 16]. При сравнении групп предраковых и фоновых изменений выявлено, что уровень экспрессии маркера при дисплазии I, II степени и доброкачественных изменениях не различается. Уровень экспрессии р16 был значимо выше при дисплазии III степени и AIS. С другой стороны, при дополнительной группировке и сравнении между собой дисплазии I—II степени и дисплазии III/AIS статистическое различие обнаруживается. Полученные результаты косвенно свидетельствуют о низком злокачественном потенциале дисплазии I—II степени, что соответствует современным представлениям, поскольку маркер р16 считается предиктором злокачественной трансформации [17].

Следует отметить, что положительная экспрессия р16 не во всех случаях свидетельствует о неопластическом характере процесса. Так, среди доброкачественных изменений железистого эпителия она отмечалась при ТЭМ и в туннельных кластерах типа А и В. Таким образом, только наличие р16 не является определяющим, следует обращать особое внимание на уровень его экспрессии.

Экспрессия р53 при предраковых изменениях имела тенденцию к увеличению с повышением степени дисплазии, однако статистически значимых различий между изучаемыми группами не обнаружено. Интересно, что экспрессия р53 в AIS наблюдалась в тех случаях, где структуры инвазивной аденокарциномы демонстрировали высокую ядерную экспрессию р53. Такой характер экспрессии может свидетельствовать о том, что р53 играет лишь второстепенную роль в развитии предраковых изменений железистого эпителия шейки матки и включается в канцерогенез не всегда. Многими исследователями [25—27] показано, что в различных инвазивных опухолях, в том числе и аденокарциномах шейки матки, р53 является маркером агрессивности опухоли. Возможно, тот факт, что высокая экспрессия р53 в AIS выявляется в тех случаях, где инвазивный компонент экспрессирует р53 свидетельствует о высоком потенциале прогрессии AIS в инвазивный рак. Не исключено, что высокий уровень с р53 в AIS может быть косвенным признаком агрессивности будущей опухоли, а также предиктором развития определенного гистологического варианта, так как опухоли с высокой экспрессией р53 чаще имели строение серозных, низкодифференцированных аденоплоскоклеточных и низкодифференцированных эндометриоидных аденокарцином. Однако сведения в литературе по этому поводу отсутствуют. Данный вопрос требует более тщательного изучения.

При доброкачественных изменениях эпителия экспрессия р53 наблюдалась только в ТЭМ и при реактивных изменениях эпителия без значимых различий между группами.

Маркер р27 наряду с р53 в нашем исследовании показал устойчивую тенденцию к увеличению экспрессии при повышении степени дисплазии. Однако статистически значимых различий между группами не обнаружено. Этот факт весьма интересен, поскольку для предраковых изменений плоского эпителия шейки матки описана обратная тенденция — с повышением степени дисплазии плоского эпителия экспрессия маркера снижается [18]. Возможно, повышение уровня экспрессии р27 имеет механизм, сходный с р53, однако это требует дальнейшего изучения.

Маркер пролиферации Ki-67 при AIS железистого эпителия шейки матки выявлялся в 100% случаев, при этом в 39 (84,8%) наблюдениях имела место выраженная экспрессия. При дисплазии III степени получены сходные результаты, тогда как при сравнении с дисплазией I и II степени выявлена статистически значимая разница (p<0,05). Таким образом, при дисплазии I и II степени уровень пролиферативной активности значительно ниже, чем при дисплазии III степени и AIS. Также обращает на себя внимание поступательное увеличение уровня экспрессии маркера при повышении степени дисплазии, что свидетельствует о постепенном накоплении генетических повреждений, ведущих к бесконтрольному делению клеток, и подтверждает теорию о том, что диспластические изменения являются последовательными ступенями канцерогенеза аденокарцином шейки матки. Уровень экспрессии Ki-67 является важным прогностическим фактором, позволяющим оценить злокачественный потенциал предраковых изменений железистого эпителия шейки матки [19, 20]. Полученные нами результаты показали, что значимо более высокая экспрессия маркера Ki-67 при дисплазии III степени и AIS характеризует эти поражения как более агрессивные по сравнению с дисплазией I—II степени и свидетельствует о более высоком риске прогрессии в инвазивный рак.

Ввиду того, что различия между дисплазией I и II степени определяются только степенью ядерной атипии, которую бывает иногда очень трудно оценить, а иммуногистохимические характеристики (низкая пролиферативная активность и низкая экспрессия р16), свидетельствуют о низком потенциале малигнизации, объединение их в одну группу, как это предлагается рядом исследователей [21, 22], вполне оправданно. Название данной объединенной группы может обсуждаться. Некоторые авторы предлагают термин «железистая атипия» [23], однако мы полагаем, что термин «дисплазия» необходимо сохранить, поскольку он лучше отражает биологическую сущность процесса.

Также представляется логичным объединение в одну категорию дисплазии железистого эпителия III степени и AIS. Данные поражения имеют множество общих характеристик: высокую степень ядерной атипии, наличие большого количества митозов, в том числе и атипичных, нарушение рядности эпителиального пласта. Кроме того, отмечается сходная экспрессия белков р16 и Ki-67.

Разделение предраковых изменений железистого эпителия на две группы значительно упростит практическую работу, позволит определить более четкие морфологические и иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики, а также уточнит прогностическую значимость и облегчит выбор лечебной тактики.