Введение

Стратегия коррекции состава кишечной микробиоты показала большие перспективы для лечения заболеваний [1]. В настоящее время установлена связь состава фекальной микробиоты толстой кишки с заболеваниями человека. Содержащиеся в неволе приматы представляют собой «гуманизированный» кишечный микробиом и могут восполнить недостаток данных для лучшего понимания микробного состава кишечника и заболеваний [2].

Исследования на биологических моделях имеют решающее значение для оценки реакция всего организма и исключают воздействие окружающей среды на результаты. Учитывая огромное влияние окружающей среды на микробиоту кишечника и степень, в которой микробиота кишечника участвует во множестве систем организма, биологические модели особенно полезны в этой области. Хотя такая модель, как грызуны, несомненно, полезны, они не могут воспроизвести состояние человека в той же степени, что и модели нечеловекообразных приматов, такие как хорошо изученные макаки резусы (Macaca mulatta). В отличие от исследований на людях, в исследованиях на нечеловекообразных приматах можно полностью описать рацион питания и историю болезни, а само исследование можно спланировать так, чтобы обеспечить всесторонний мониторинг субъектов и строгое соблюдение протокола. По сути исследования на макаках резусах могут быть направлены на устранение или уменьшение влияния факторов образа жизни на микробное сообщество [3]. Кроме того, в отличие от грызунов, макаки резусы демонстрируют модель поведения, питания и сна, которые повторяют человеческие, имеют продолжительность жизни, измеряемую десятилетиями, а также развиваются и стареют так же, как люди. Более того, последовательность нуклеотидов в геноме макак резус примерно на 93% идентична последовательности генома человека [4, 5], и это сходство распространяется на многочисленные аспекты их анатомии, физиологии, неврологии, эндокринологии, иммунологии и поведения [3, 6]. Широта использования обезьян, в частности макак резусов, в биомедицинских исследованиях демонстрирует их как релевантную модель для изучения кишечной микробиоты.

Исследования, изучающие различия в микробиоме кишечника у содержащихся в неволе и диких нечеловекообразных приматов, показали, что подобно микробиому человека, фекалии содержащихся в неволе макак резусов обогащены Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria [2, 7, 8].

В микробиоте кишечника диких макак резусов преобладают Firmicutes, Bacteroidetes и Spirochaetes. Было обнаружено, что разнообразие и богатство кишечной микробиоты были выше в засушливый сезон, чем в сезон дождей. В частности, в засушливый сезон были обнаружены более высокие доли Firmicutes, Tenericutes, Cyanobacteria и неклассифицированных бактерий на уровне типа и больше Coprococcus на уровне рода [9]. Также проводили исследование микробиоты кишечника содержащихся в заповеднике и диких популяций макак резус. Наиболее доминирующими типами были Firmicutes и Bacteroidetes, за ними следовали Actinobacteria, Spirochetes, Proteobacteria и Tenericutes [10]. На уровне типа Bacteroidetes, Spirochetes, WPS-2 и Fibrobacteres были более обогащены у дикой популяции, тогда как Firmicutes и Verrucomicrobia были более обогащены у популяции, содержащейся в заповеднике. Полученные данные соответствуют предыдущим данным, полученным у макак резусов, людей и других видов приматов, обитающих в разных средах [11—26]. Различия можно объяснить разницей в составе рациона, поскольку дикие макаки питаются исключительно натуральными продуктами, в отличие от макак, живущих в условиях неволи. В целом дикие животные имеют более высокое микробное разнообразие кишечника, чем животные в неволе, из-за более сложного состава рациона [17, 18].

В Висконсинском национальном исследовательском центре приматов было проведено исследование микробиоты кишечника макак резусов. Животных содержали в хорошо контролируемых условиях, аналогичных нашим. Результаты продемонстрировали ограниченное влияние возраста на микробиоту и отсутствие влияния половых различий. Возможность осуществления контроля за внешними факторами является преимуществом изучения микробиоты кишечника на макак резусах [3].

Цель исследования — анализ таксономического состава кишечной микробиоты макак резусов различного возраста, содержащихся в условиях неволи.

Материал и методы

В исследовании были использованы 17 образцов фекалий клинически здоровых особей макак резус, содержащихся в неволе (помещении для содержания обезьян) (табл.).

Животные содержались в индивидуальных клетках (оборудованными кормушками и автоматическими поилками), на которых указаны номер животного. Пищевой рацион состоял из полнорационного гранулированного корма, хлеба, яиц и сочного корма (яблоки). Расчет корма проводили в зависимости от массы тела животного.

Таблица. Возрастные группы исследованных обезьян

Сбор образцов микробиоты кишечника проводили утром, после влажной уборки помещений, где содержались обезьяны, и тщательной обработки поддонов с использованием дезинфицирующих средств.

За животными наблюдали до получения фекальных образцов, которые собирали из поддонов в стерильные контейнеры. Материал доставляли в лабораторию, маркировали и замораживали при -70 °C, хранили при той же температуре.

Подготовка библиотек для секвенирования

Выделение тотальной ДНК проводили с помощью набора MagMAX DNA Multi-Sample Ultra 2.0 Kit (ThermoFisher Scientific, USA) и автоматической выделительной станции KingFisher Flex. Подготовку библиотек и их секвенирование осуществляли в соответствии с протоколом 16S Metagenomic Sequencing Library preparation для MiSeq, Illumina. Приготовление геномных библиотек проводили с использованием набора Tersus PCR kit (Evrogen, Россия), для амплификации вариабельного региона V3-V4 гена 16s рРНК использовали праймеры 341F и 801R, для баркодирования образцов использовали уникальные комбинации индексирующих праймеров, являющихся аналогами праймеров из набора Nextera XT Index kit v2. Процедуру секвенирования осуществляли с помощью инструмента MiSeq с использованием набора расходных материалов MiSeqReagent Kit v3 (600-cycle) (Illumina).

Биоинформатический анализ и статистическая обработка

Триммирование адаптерных последовательностей проводили с помощью Trimmomatic v0.39 [19]. Далее с помощью cutadapt v4.6 [20] отрезали последовательности праймеров, в последующий анализ брали только те прочтения, которые исходно содержали последовательности праймеров, как в R1, так и в R2.

Консенсусные последовательности ampliconsequencevariants (ASV) были получены с помощью программного пакета DADA2 v1.29.0 [21]. Модуль filterAndTrim запускался со следующими параметрами: truncLen=c(225,220), maxN=0, maxEE=2, truncQ=2. learnErrors, mergePairs и removeBimeraDenovo запускались со стандартными параметрами. Таксономия определяли с параметром minBoot=70 с использованием базы данных SILVA rRNA v138 [22]. Деконтаминацию последовательностей ASV осуществляли с помощью функции isContaminant (method=«frequency», conc=«Concentration») из программного пакета decontam [23]. В последующий анализ брали только те образцы, покрытие для которых было не менее 1000 прочтений. Для агломерации ASV до уровня вида использовали функцию tax_glom из пакета speedyseq.

Для определения альфа-разнообразия были использованы метрики Chao1 и критерии информационной энтропии Shannon и Simpson. Статистическую значимость между распределениями значений альфа разнообразия оценивали с помощью U-критерия Манна—Уитни.

Кластеризация образцов была получена с помощью PCoA с расстоянием Брея—Кертиса. Статистическую значимость определяли с помощью U-критерия Манна—Уитни (p-value <0.05).

Дифференциальную представленность ASV оценивали с помощью DESeq2 с тестом Вальда в качестве теста оценки правдоподобия [24]. Дифференциально представленными организмами считались те, для которых значение p-value< 0.05 и |Log2FoldChange| >2.

Визуализацию данных и проверку статистической значимости проводили с применением python3 и R.

Результаты и обсуждение

Описание микробного сообщества

В результате проведенного метагеномного секвенирования включенных в исследование 17 образцов, накоплен общий массив данных объемом 369 Mb (Мегабаз) и с медианным покрытием образца, равным 40397 прочтений. После проведения всех процедур фильтрации, описанных в разделе «Материалы и методы», была сформирована подгруппа образцов (n=15), покрытие которых составило не менее 1000 отфильтрованных прочтений. В эту подгруппу вошли 9 образцов от старых особей, 4 — от молодых и 2 — от детенышей. Всего в анализируемом массиве данных было обнаружено 190 уникальных видов бактерий: в группе детенышей 70 уникальных видов, в группе молодых — 92 и 114 в группе старых обезьян.

Для визуализации композиции бактериальной флоры была построена тепловая карта с агломерацией массива до уровня вида (рис.1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_025_add.zip). Деревья на графике были построены с помощью алгоритма агломеративной кластеризации. Использовалось корреляционное расстояние для кластеризации образцов и евклидово расстояние для кластеризации видов.

Большая часть бактерий представлена отделами Firmicutes, Bacteriodetes и Actinobacteriota (рис.2, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_025_add.zip), которые являются доминирующими в кишечнике у людей [28]. Для оценки вариации мажорных составляющих микробного сообщества были построены боксплоты с распределением значений относительной представленности трансформированных с помощью clr (см. рис. 2, е-ж). Представители отдела Actinobacteriota визуально уменьшаются по возрастным группам, их максимальная представленность наблюдается в группе детенышей, а минимальная в группе старых макак. Отличия между группой молодых и старых макак являются статистически значимыми (p-value< 0.05). Максимальная доля бактерий отдела Firmicutes достигается в группе молодых макак, медианы значений clr в группе детенышей и старых макак практически не отличается. Отдел Bacteriodetes увеличиваются в представленности по возрастным группам и статистически значимо отличаются в группах молодых и старых макак (p-value< 0.05). Отдельно было оценено отношение относительных представленностей Firmicutes к Bacteriodetes, где статистически значимо различаются распределения значений между группами молодых и старых макак (p-value< 0.05). Результаты сходятся с опубликованными в работе [3] за исключением группы макак детенышей. Однако результаты, полученные для группы детенышей, могут отличаться вследствие малого количества анализируемых образцов.

Оценку меры альфа разнообразия проводили с помощью трех метрик: Chao1 richness, Shannonentropy и Simpsonentropy (рис.3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_026_add.zip).

Наименьшие значения Shannonentropy и Simpsonentropy наблюдались в группе детенышей, наибольшие в группе старых макак. Значения Chao1 richness имеют восходящий тренд по возрастным группам (наименьшие значения наблюдаются в группе детенышей, наибольшие в группе старых). Отличия между группой детенышей и любой другой группой нельзя считать достоверными, поскольку в группе макаки детеныши представлены всего 2 точками. Однако, предварительно, общий тренд говорит о повышении внутреннего бактериального разнообразия в группе молодых относительно детенышей. Вероятно, это связано с более разнообразным питанием и колонизацией кишечника внешней бактериальной флорой. Статистически значимых отличий между группами выявлено не было.

Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными литературными данными, в которых также показано, что альфа разнообразие также склонно сначала повышаться по возрастным группам, а после снижаться [3]. Однако полученные в настоящей работе значения разнообразия отличаются от опубликованных в работе [3], что, вероятно, является следствием отличий в методике питания.

Групповые отличия

Для кластеризации образцов был получен PCoA график на расстоянии Брея-Кертиса для относительной представленности индивидуальных видов бактерий (рис. 4,а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_026_add.zip). По 1 координате наблюдается относительно большой процент объясненной дисперсии (41,4%), что в большей степени обусловливается сильными межвозрастными отличиями на составе микробиоты. Причем, образцы макак из группы детенышей мало отличаются от группы молодых особей. Все это дополнительно подтверждается деревьями агломеративный кластеризации образцов на рис.1.

Вариации внутри группы старых макак значительно меньше по сравнению с группами молодых и детенышей. Этот тезис дополнительно подтверждается на рис.3, б, на котором представлены боксплоты для медианных расстояний Брея—Кертиса для всех образцов внутри возрастной группы. Статистически значимые отличия между распределениями медианных расстояний Брея—Кертиса были обнаружены между группой старых и молодых макак (p-value< 0.05).

Оценка дифференциальной представленности

Оценку дифференциальной представленности бактерий проводили только в сравнении групп образцов молодых и старых макак, поскольку в группе макак детенышей было всего два образца. При использовании инструмента DESeq2 дифференциально представленными считались только те организмы, которые имели значения |log2FoldChange| > 2 и p-value< 0.05 (рис. 5, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_026_add.zip).

Среди выявленных дифференциально представленных таксонов в микробиоте кишечника взрослых особей по сравнению с группой старых животных наблюдается повышенная представленность Faecalibacterium, Blautia, Eubacterium, которые относятся к группе бутират-продуцирующих бактерий, обеспечивающих энергией колоноциты, оказывающие противовоспалительное и противоопухолевое действие, а также усиливающие регенерацию кишечного эпителия у людей [25, 26], что указывает на отсутствие нарушений состояния местного иммунитета кишечника.

При этом в микробиоте кишечника старых особей наблюдается повышенная представленность Streptococcus и Lachnospiraceae, которые можно интерпретировать как маркеры воспаления [27, 28].

Оценку дифференциальной представленности между группами детенышей и старых, и детенышей и молодых не проводили в связи с малым количеством образцов в группе. Стоит отметить, что в полученных результатах наблюдаются большие значения размера эффекта. Это, по-видимому, также объясняется сильными межвозрастными отличиями.

Проведенный анализ данных 16S рРНК метагеномного секвенирования кишечной микробиоты макак резусов показал, что в анализируемой группе образцов доминируют бактерии, относящиеся к отделу Firmicutes, Bacteriodetes и Actinobacteriota, которые также являются доминирующими у людей. Однако их соотношение меняется в разных возрастных группах. Во всех возрастных группах мажорная часть бактериальной флоры принадлежала к отряду Firmicutes. Однако Actinobacteriota в большей степени была представлена в образцах макак детенышей, снижаясь с увеличением возраста животного. Также с возрастом наблюдалось снижение соотношения Firmicutes/Bacteriodetes.

В результате анализа было выявлено, что альфа разнообразие микробиоты кишечника у разных возрастных групп макак резусов не имеет статистически значимых отличий. В то же время наибольшие абсолютные значения альфа разнообразия наблюдались в группе молодых особей. Наблюдаемые отличия между группами макак в большей степени объясняются межвозрастными различиями. При этом вариации внутри групп детенышей и молодых меньше, чем в группе старых.

Заключение

Результаты проведенного секвенирования микробиоты кишечника обезьян продемонстрировали сходство ее состава с микробиотой кишечника человека, особенности возрастных изменений таксономического состава кишечной микробиоты макак резусов, что в определенной степени позволяет их использовать в качестве модели для изучения возрастной динамики кишечной микробиоты человека, перспективно для проведения возрастных исследований различных веществ, композиций и других факторов воздействия на организм человека, потенциально способных положительно или отрицательно влиять на его микробиоту.

Финансирование работы

Работа выполнена в рамках НИР (рег.№1ф.-МП.2) ФГБУ Курчатовского комплекса медицинской приматологии НИЦ «Курчатовский институт».

Благодарности

Результат секвенирования получен с использованием научного оборудования ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России ЦКП «Геномика, протеомика, метаболомика» (https://rcpcm.org/?p=2806).

Соблюдение этических стандартов

Информация о соблюдении стандартов работы с животными. Проводился сбор биоматериала (образцы фекалий) у обезьян в соответствии с ГОСТ 33218-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными: Правилами содержания и ухода за нечеловекообразными приматами.

Информация об исследованиях, где в качестве объектов выступали люди. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.