Введение

История открытия. Стремительное развитие молекулярно-биологических технологий в последние годы открывает возможности их применения в терапии ранее неизлечимых заболеваний. Одной из них является технология «генетических ножниц», известная под названием CRISPR-Cas9. Эта технология получила развитие после того, как были открыты и затем тщательно изучены системы CRISPR-Cas бактерий и доказана защитная функция этих повторяющихся палиндромных структур [1, 2].

В 1987 г. группе японских ученых удалось выявить уникальные локусы CRISPR, сформированные палиндромными повторами в геноме бактерии Escherichia coli. Это открытие стало отправной точкой в развитии данного направления генетики. Ученые продолжали исследования в данной области, выявляя структурные и функциональные особенности CRISPR. В 1993 г. Франсиско Мохико выделил короткие палиндромные повторы, специфичные для CRISPR, и результаты их изучения определили название данной комплексной структуры (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) [1—3].

Позже, в 2002 г., в составе локусов CRISPR были определены гены, кодирующие CRISPR-ассоциированные белки (Cas). Системы CRISPR-Cas отличаются между собой составом cas генов, что позволило разработать используемую в настоящее время классификацию данных генетических структур. В 2013 г. показана возможность функционирования CRISPR не только в бактериальных, но и в эукариотических клетках. В 2020 г. Дженнифер Дудна и Эмманюэль Шарпантье были удостоены Нобелевской премии по химии за внедрение методов редактирования генов с помощью CRISPR-Cas9. Богатая история открытий, повышенный интерес мирового научного сообщества и многочисленные исследования демонстрируют актуальность технологии CRISPR-Cas9 в наши дни [3—5].

Структура и механизм действия CRISPR

Иммунная функция CRISPR-Cas состоит в узнавании специфических чужеродных нуклеотидных последовательностей и сохранении о них памяти с целью их последующей деградации при повторном проникновении в клетку. В структуре CRISPR-Cas начальным элементом цепи является функциональный участок генетической последовательности, кодирующий белки Cas, определяющие тип системы CRISPR-Cas. Далее в цепи бактериальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) последовательно расположены лидерная последовательность, включающая промотор и регулярно расположенные короткие палиндромные повторы, разделенные спейсерами. При повторном проникновении чужеродного генетического материала система CRISPR-Cas использует спейсеры как генетическую память для распознавания и уничтожения инфекции [1, 6—8].

Механизм иммунологической защиты CRISPR-Cas включает три последовательные стадии: адаптация, экспрессия и интерференция. При проникновении чужеродного агента в клетку хозяина начинается стадия адаптации, во время которой при участии Cas белков образуются фрагменты (короткие участки чужеродных последовательностей), получившие название спейсеров, дополняющие CRISPR-системы информацией о данном агенте. Адаптация осуществляется с помощью белков Cas1-Cas2 и мотива смежного с протоспейсером (protospacer adjacent motif, PAM). Белковый комплекс воздействует на двухцепочечную (dsDNA) ДНК фагов и плазмид, вызывая двухцепочечный разрыв (DSB) и высвобождение фрагмента чужеродного генома [2, 3, 9—11]. Реакцию деградации чужеродной ДНК поддерживает мультибелковый комплекс RecBCD, выступающий в роли хеликазы и нуклеазы. Предпочтение в выборе подвижных генетических элементов (mobile genetic elements, MGE) в цепи данных реакций играет важную роль в дифференцировке чужеродных и собственных генетических структур, позволяя избежать аутоагрессии [11—14].

Процесс интеграции спейсеров осуществляется с помощью фактора интеграции хозяина (IHF). IHF сворачивает ДНК хозяина в U-образную конфигурацию, после чего происходит интеграция спейсера в геном хозяина между лидерной последовательностью и 5’-фосфатом проксимального ряда повторов-спейсеров [5, 13—15].

В стадии экспрессии происходит транскрипция генетической информации с образованием длинного транскрипта pre-crRNA и его процессирование с образованием короткой зрелой crRNA (направляющей, или гидовой, РНК), содержащей последовательность спейсера и часть прилегающего повтора. Данный этап включает процесс синтеза белковых комплексов, которые будут взаимодействовать с чужеродными агентами на последующих этапах.

Наконец, интерференция — это последний этап иммунной защиты CRISPR-Cas. На этом этапе crRNA служит направляющей для белков Cas и осуществляет распознавание специфической последовательности-мишени в чужеродной ДНК или РНК. При распознавании мишени происходит активация каскада реакций, которые приводят к деградации структур чужеродных нуклеиновых кислот и защите клетки хозяина. Стоит отметить факт стратегической выгоды палиндромной структуры повторов CRISPR обеспечивающей высокую скорость транскрипции определенных спейсеров, что позволяет быстро и эффективно реагировать на ретроспективно актуальные инвазивные элементы [16—19].

Ограничения применения CRISPR-Cas9

Возможности применения системы CRISPR-Cas9 открывают широкие перспективы в клиническом ее применении. Однако перед внедрением данной технологии в практику необходимо преодолеть ряд связанных с ней проблем.

Самой актуальной проблемой является способ доставки CRISPR-Cas9 в целевую клетку. В настоящее время изучается множество вариантов реализации эффективной транспортировки компонентов системы. Одна из перспективных технологий — мРНК, представляющая собой компактную и удобную структуру с высокой активностью в редактировании генома и контролем объема целевой доставки данных структур в клетку. Другим вариантом является плазмидная ДНК, кодирующая белок Cas9. Данная технология является более габаритной и ограничена в целевом эффекте, однако она имеет преимущество относительно мРНК, являясь более стабильной и удобной на стадии ее проектирования [3, 12].

Стоит упомянуть вирусные и невирусные методы доставки, такие как электропорация, микроинъекция и липидные наночастицы. Однако терапевтическое применение таких технологий ограничено в связи с относительно низкой эффективностью доставки по сравнению, например, с вирусными векторами, такими как аденоассоциированный вирус (AAV), аденовирус и лентивирус. Достоинствами вирусных методов являются высокая специфичность и относительно низкая иммуногенность, однако ограничение емкости данных структур в 4,7 кбит/с является основной проблемой для эффективного транспорта CRISPR-Cas9, опосредованной AAV [3, 10, 12].

Также, одной из главных проблем, связанных с применением системы CRISPR-Cas9, является нецелевое действие «генетических ножниц», которое может привести к случайным патологическим мутациям. Для повышения специфичности системы были предприняты усилия, включая помещение гена Cas9 под контроль минимального промотора ВИЧ-1, опосредованного транскрипционным активатором (trans-activator of transcription, Tat), что позволило избежать нежелательной экспрессии Cas9. Также было продемонстрировано, что рибонуклеопротеин Cas9/gRNA (Cas9 RNP) может быть разрушен постфактум, что позволяет инактивировать активную белковую структуру после редактирования целевой ДНК, обеспечивая максимальную целевую и минимальную нецелевую активность. Однако имеются данные о том, что применение RNP в некоторых типах клеток может вызывать врожденные иммунопатологические реакции [9, 10, 13].

Возможности применения технологии CRISPR-Cas9

Перспективы применения системы CRISPR-Cas9 в медицине огромны для лечения многих заболеваний человека. Эту методику можно использовать для борьбы с вирусными инфекциями и корректирования генетических мутаций, которые риводят к развитию наследственных и приобретенных заболеваний, ранее считавшихся неизлечимыми. В настоящее время изучаются стратегии коррекции генетического материала у пациентов с онкологическими, неврологическими и аллергическими заболеваниями, сердечнососудистыми заболеваниями, наследственными болезнями крови и метаболическими расстройствами [10, 16, 19, 20].

Наследственные заболевания

Мышечная дистрофия Дюшенна

Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна — это наследуемое по рецессивному Х-сцепленному типу нервно-мышечное заболевание. Преимущественно поражает лиц мужского пола в детском возрасте и вызвано мутацией гена DMD, кодирующего белок дистрофин. Данная мутация приводит к качественному или количественному нарушению функции дистрофина.

В исследованиях прошлых лет была продемонстрирована эффективность использования технологии CRISPR-Cas9 для лечения мышечной дистрофии Дюшенна на модели мыши. В эксперименте ген DMD был подвергнут искусственной мутации посредством технологии CRISPR-Cas9 и помещен в зиготу. В результате эксперимента в зародышевой линии мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна была достигнута коррекция мутации гена DMD и у новорожденных мышей исправлен фенотип с эффективностью от 2 до 100% [20, 21].

Эти экспериментальные модели с индуцированными направленными мутациями или отредактированными мутациями в целевом гене могут служить важным источником информации для раскрытия механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования заболевания. Однако необходимо проведение дополнительных исследований для оценки безопасности и эффективности данного подхода на людях, а также получение всех необходимых разрешений для использования данной технологии в клинической практике [20—22].

Болезнь Паркинсона, также известная как дрожательный паралич, является нейродегенеративным заболеванием, которое прогрессирует в результате нейровоспалительной реакции. Данная реакция вызвана экзогенными нейротоксинами и гиперреактивностью нейроглиальной системы, ведущими к аутоиммунному процессу. Наиболее интенсивная реакция происходит в стриато-паллидарной системе и черной субстанции ретикулярной формации. В результате нейровоспалительной реакции клетки нейроглии приобретают амебоподобную форму и начинают продуцировать избыточное количество провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS), 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), ряд интерлейкинов (IL-12, IL-6 IL-1β и IL-1) и глиальный фибриллярный кислый белок (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP). В результате этого процесса нейроны погибают, замещаясь клетками нейроглии, что приводит к развитию реактивного глиоза. Данные изменения усугубляются активацией фактора транскрипции NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) и белковой киназы C delta (PKCδ), что ускоряет гибель нейронов [23].

Результаты исследований группы ученых из Университета Беркли (University of California, Berkeley) и Калифорнийского института технологии (California Institute of Technology) показали подходы к редактированию ядерного и митохондриального генома с использованием CRISPR-Cas9. При использовании экспрессируемого gRNAs Cas9, нацеленного на циклооксигеназу 1 и 3 (Cox1 и Cox3 — это гены, кодирующие ферменты циклооксигеназы 1 и 3, соответственно), происходит целевая инициация расщепления определенных локусов митохондриальной ДНК. В результате эксперимента с применением этой методики было обнаружено, что нокаут взрослого пролифератора пероксисомного рецептора γ (PPAR γ), коактиватора белка-1α (PGC-1α) и главного регулятора биогенеза митохондриальных заболеваний приводит к гибели дофаминергических нейронов [23].

Также в данных исследованиях подчеркивается важность семейства белков прокинетина 2 (PK2) в митохондриальном биогенезе и защите митохондрий от нейродегенеративных процессов [23, 25]. Увеличенные уровни PK2 в посмертном мозге при болезни Паркинсона являются следствием прижизненного защитного эффекта в ответ на нейродегенерацию, а повышение уровня PGC-1α и BCL2, достигнутое через экспрессию PK2, способствует сохранению митохондриальной биоактивности в ответ на нейротоксический стресс. Кроме того, продемонстрированная в эксперименте на глиальных клетка, AAV-опосредованная доставка PK2 может снижать биогенные процессы реактивных астроцитов и увеличивать экспрессию генов астроцитов A2 с альтернативным нейропротекторным фенотипом, что противостоит нейровоспалению, вызванному реактивными астроцитами A1. Это открывает новые перспективы в изучении связи между дисфункцией митохондрий и аутоиммунным нейровоспалением, а также позволяет более точно определить роль PK2 в этих процессах. Также важно отметить, что эти исследования демонстрируют эффективность CRISPR-Cas9 в исследовании сложных механизмов, связанных с биологией клеток и заболеваниями [24, 25].

Стоит обратить внимание на белок синуклеин альфа (Synuclein Alpha, SNCA), который играет важную роль в возникновении спорадической болезни Паркинсона. Существуют данные о том, что благодаря изменению гена, связанного с этим белком, возможно предотвратить развитие болезни. Однако использование метода CRISPR-Cas9 в комбинации с человеческими индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (hiPSC) может привести к восстановлению мутации A53T в hiPSC, не навредив при этом процессу дифференциации дофаминергических нейронов, отвечающих за продуцирование гормона дофамина [23].

Еще одним важным белком является насыщенная лейцином повторная киназа 2 (LRRK2), связанная с возникновением болезни Паркинсона. Мутации G2019S и R1441C в этом гене могут привести к нарушениям митохондриального биосинтеза. Был проведен эксперимент с использованием метода CRISPR-Cas9 для замещения всей области повторения в hiPSC репрезентативными аллелями Rep1—257, Rep1—259, Rep1—261 и Rep1—263 с целью инактивации мутаций G2019S и R1441C в гене LRRK2. Эти аллели также способствовали повышению экспрессии белка SNCA, что дает надежду на успех в дальнейших исследованиях в данной области [23—25].

Нейродегенеративное заболевание болезнь Альцгеймера (БА) проявляется постепенным началом расстройств памяти и высших мозговых функций в пресенильном или старческом возрасте, приводя к деменции, и характеризуется нейропатологическими, нейровизуализационными и биохимическими признаками. Патогенез БА связан с накоплением белка β-амилоида (Aβ), аномальных нейрофибриллярных клубков и повреждением митохондрий нейронов, что приводит к их гибели [20, 26]. БА — наиболее известное нейродегенеративное заболевание, для которого не существует удовлетворительной терапии безопасной и эффективной для пациентов. Существующие лекарства, одобренные FDA, обеспечивают только временное облегчение некоторых симптомов [27].

В генной терапии БА можно обратить внимание на три гена — APP, MAPT и APOE, которые связаны с прогрессированием заболевания. Однако необходимы дополнительные исследования для оценки эффективности и безопасности генной терапии для БА. Генная терапия при БА с использованием технологии CRISPR-Cas9 направлена на регуляцию экспрессии белка Aβ и может быть достигнута несколькими способами. Исследователи показали, что инсерционно-делеционные вирусные мутации (InDel) аллелей APP с помощью технологии CRISPR-Cas9 могут снизить экспрессию белка Aβ. Другой целью генной терапии является регуляция γ-секретазы протеазы, большого внутримембранного белкового комплекса, который регулируется γ-секретазным активирующим белком (GSAP). Снижение экспрессии GSAP значительно снижает уровень Aβ. Функции γ-секретазы регулируются экспрессией ключевых компонентов комплекса — GSAP и PSEN2. Изменения в метаболизме амилоидов вызывают увеличение соотношения Aβ42/40 и уровней Aβ42 и/или снижение синтеза Aβ40 [28—30].

Онкология

Недавние исследования, направленные на изучение природы опухолевого роста, демонстрируют корреляцию между развитием онкологического процесса и мутациями генов регуляторов сигнальных путей. Традиционные методы медикаментозной терапии, применяемые в наши дни, обладают лишь компенсаторной способностью, в то время как методы генной инженерии имеют потенциал для коррекции генетических мутаций, которые приводят к онкогенезу. Еще одним противоопухолевым аспектом в медицине является противодействие иммунным механизмам опухолевого процесса. Появление терапии блокад иммунных контрольных точек (ICB), таких как блокатор запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), его лиганда 1 (PD-L1) или цитотоксического антигена-4 Т-лимфоцитов (CTLA-4), привело к революции в методах лечения многих типов опухолей. На сегодняшний день препараты, такие как ипилимумаб (анти-CTLA-4), пембролизумаб, ниволумаб (анти-PD-1) и атезолизумаб (анти-PD-L1), были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для клинического использования [31].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в иммунотерапии рака, в этой области все еще существует множество проблем, таких как низкий уровень ответа на лечение и приобретение опухолью резистентности к препарату, что определяет необходимость приложения дополнительных усилий в вопросе выяснения механизмов, лежащих в основе чувствительности или устойчивости к противоопухолевому иммунному ответу, и разработки более эффективных иммунотерапевтических стратегий. Недавно технология CRISPR-Cas9 была успешно применена для исключения потенциальных факторов, регулирующих противоиммунные механизмы опухоли, тем самым обеспечивая новую парадигму обнаружения мишеней.

В докладе об исследованиях, проведенных в прошлом году, ученые сообщили о том, как они нацелились на уничтожение вируса Эпштейн-Барра (EBV) в клетках пациента, которые были получены из лимфомы Беркитта с инфекцией EBV. Опухолевые клетки показали снижение пролиферации в результате воздействия CRISPR, нацеленных на EBV. Кроме того, CRISPR могут целенаправленно уничтожать онкогены E6 или E7 вируса папилломы человека, которые интегрированы в геном клеток карциномы шейки матки. Эти онкогены вызывают деградацию гена супрессора опухоли P53 и дестабилизацию белка ретинобластомы, что приводит к развитию различных типов рака. Нокаут E6 и E7 CRISPR был связан с повышением уровня белка P53 и Rb, а также увеличением гибели раковых клеток [20, 31, 32].

Заключение

Генные манипуляции, которые когда-то казались фантастикой, теперь стали реальностью. Труднодоступные нейродегенеративные заболевания могут быть излечены генной терапией благодаря достижениям в области векторных систем. Генные манипуляции, совмещенные с современными технологиями доставки генов в клетки центральной нервной системы, обещают изменить подходы к клиническому лечению как наследственных, так и спорадических нейродегенеративных заболеваний, а также предоставляют новые возможности для лечения ряда редких и генетических заболеваний. Однако остаются нерешенные проблемы, включая разработку более эффективных векторных систем, тщательную оценку безопасности современных инструментов генных манипуляций, а также прозрачность и сотрудничество между членами научно-исследовательского сообщества. Совершенствование методов использования «генетических ножниц» и поиск эффективных переносчиков для доставки генов приближают нас к новой эре в медицине.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.