Введение
Лабораторный мониторинг необходим для своевременной диагностики и таргетной терапии нарушений системы гемостаза у новорожденных. Надежные и точные референтные интервалы (РИ) для клинико-лабораторных исследований являются неотъемлемой частью процесса корректной интерпретации результатов. РИ — показатель биологических свойств референтной популяции, полученный путем статистической обработки. Однако стоит помнить, что РИ не может служить критерием суждения о патологии — для этого используются пороговые значения [1]. Определение РИ у новорожденных затруднительно: во-первых, ввиду динамического изменения показателей системы гемостаза после рождения и до 6 мес согласно концепции развивающегося гемостаза [2]; во-вторых, из-за этических норм и сложности рекрутировать требуемое количество здоровых индивидуумов [3]; в-третьих, в связи с маленьким объемом получаемой пробы крови. В соответствии со стандартом ISO15189 лаборатория должна определять и периодически пересматривать РИ для каждого типа анализатора и используемых реагентов [4]. На текущий момент в научной литературе нет данных о параметрах плазменного гемостаза у здоровых новорожденных для коагулометров ACL TOP family.
Цель исследования — определить РИ параметров плазменного гемостаза в венозной крови у здоровых новорожденных, используя коагулометр ACL TOP 750.
Материал и методы
Исследование проведено на базе лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Обследованы 98 здоровых новорожденных в возрасте 2—4 сут жизни, дети находились под наблюдением в физиологических отделениях ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, не нуждались в лечебных мероприятиях и были выписаны из стационара в удовлетворительном состоянии. По желанию родителей было проведено расширенное лабораторное обследование в рамках программы «Я родился!». Письменное информированное добровольное согласие от родителей получено.
Критерии включения: дети, рожденные в доношенном сроке, с оценкой по шкале Апгар на 1-й минуте не менее 8 баллов, на 5-й минуте не менее 9 баллов.
Критерии исключения: недоношенность, малый вес к сроку гестации, задержка роста плода (ЗРП), врожденный порок сердца, вакуум-экстракция плода, травмы при рождении, гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН), врожденная инфекция, коагулопатия или тромбоз на момент обследования.
Взятие крови осуществлялось утром из периферической вены с помощью систем S-Monovette (Sarstedt, Германия) с антикоагулянтом цитратом натрия 3,2% (1,4 мл) в соотношении 1:9 (цитрат:кровь). Согласно правилам преаналитического этапа, первая порция крови никогда не использовалась для оценки системы гемостаза, так как содержащийся в ней тканевый фактор мог повлиять на полученные результаты [5]. В течение 45 мин от момента взятия крови центрифугированием была получена цитратная плазма — с использованием центрифуги СМ-6 (ELMI, Латвия) при 2000 g в течение 20 мин при 18—25°C. Коагулометрические исследования проводили с использованием бедной тромбоцитами (<10 000/мкл) плазмы (БТП). Хранение плазмы осуществлялось при температуре –80°C.
Анализ образцов плазмы соответствовал рутинной процедуре исследования системы гемостаза в лаборатории, при своевременном сервисном обслуживании прибора и удовлетворительных результатах внутрилабораторного и внешнего (RIQAS, Randox Laboratories Ltd., Великобритания) контроля качества. Все параметры плазменного гемостаза определяли на автоматическом анализаторе ACL TOP 750 (Instrumentation Laboratory, США), используя реагенты того же производителя. Определяемые показатели и использованные реагенты: протромбиновое время (ПВ) в секундах (с), МНО и протромбин по Квику в % (HemosIL Recombiplastin 2G); активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) в с (HemosIL SynthAsil); тромбиновое время (ТВ) в с (HemosIL Thrombin Time-8); фибриноген по Клаусу в г/л (HemosIL Q.F.A. Thrombin); высокочувствительный D-димер в нг/мл (HemosIL D-dimer HS 500); факторы свертывания V, VII и X в % — одностадийным, основанным на ПВ клоттинговым методом с использованием иммунодефицитной по факторам плазмы (HemosIL Factor V, VII, X) и ПВ-реагента (HemosIL RecombiPlasTin 2G); фактор VIII в % — одностадийным, основанным на АЧТВ клоттинговым методом с использованием иммунодефицитной по фактору VIII плазмы и АЧТВ-реагента; антиген фактора XIII в % (HemosIL Factor XIII Antigen); антиген фактора Виллебранда (vWF:Ag) в % (HemosIL von Willebrand Factor Antigen); ристоцетин-кофакторная активность фактора Виллебранда (vWF:RCo) в %, (HemosIL von Willebrand Factor RCo:WF); антитромбин в % (HemosIL Liquid Antithrombin ); протеин С в % (HemosIL Protein C); свободный протеин S в % (HemosIL Free Protein S); плазминоген в % (HemosIL Plasminogen); ингибитор плазмина в % (HemosIL Plasmin Inhibtor).
Статистический анализ выполнен с использованием программ Microsoft Excel 2016 и MedCalc v. 16.8.4. При определении РИ использовали Robast-метод, а для снижения влияния статистических выбросов на результаты исключали сильно отклоняющиеся значения (выбросы Тьюки). Для определения характера распределения данных выборки использовали критерий Шапиро—Уилка.
Результаты и обсуждение
В большинстве исследований для определения РИ параметров гемостаза у новорожденных в качестве биоматериала ввиду доступности использовалась пуповинная кровь [6]. Показано, что пуповинная кровь может использоваться в качестве объекта исследования только ПВ, АЧТВ, которые в меньшей степени подвержены локальной активации в сосудах плаценты, и антитромбина — в отличие от других параметров гемостаза [7]. Кроме того, в предыдущих исследованиях показано влияние способа родоразрешения (естественные роды или кесарево сечение) на уровни факторов свертывания и естественных антикоагулянтов в пуповинной крови [8]. Для снижения влияния внешних факторов на параметры системы гемостаза в качестве пробы мы использовали венозную кровь новорожденных, преимущественно (80%) рожденных через естественные родовые пути (табл. 1).
Таблица 1. Клиническая характеристика детей при рождении
| Показатель | Значение |
| Гестационный возраст, нед (Me 95% ДИ) | 40 (38,0—41,0) |
| Вес при рождении, г (Me 95% ДИ) | 3430 (2957,0—4116,8) |
| Рост при рождении, см (Me 95% ДИ) | 53 (50—56) |
| Мальчик (abs, %) | 46 (46,9) |
| Девочка (abs, %) | 52 (53,1) |
| Апгар 1-я мин (Me 95% ДИ) | 8 (8—8) |
| Апгар 5-я мин (Me 95% ДИ) | 9 (9—9) |
| Роды физиологические (abs, %) | 79 (79,6) |
| Кесарево сечение (abs, %) | 20 (20,4) |
| Время пребывания в стационаре, сут (Me 95% ДИ) | 3,0 (2,0—5,0) |
Руководствуясь рекомендациями CLSI и IFCC, мы использовали непрямой подход к определению РИ, так как источником референтных значений служил массив данных, имеющихся в медицинской информационной системе [1]. Используя такой подход получения РИ, необходимо исключить выбросы референтных значений, выходящие за нижнюю (Q1–1,5⋅IQR) и верхнюю (Q3+1,5⋅IQR) границы квартилей, где IQR=Q3—Q1 — межквартильный размах. С маленьким (менее 80) количеством референтных значений и отсутствием нормального распределения IFCC рекомендует использовать Robust-метод (CLSI С28-А3) [1].
Количество фибриногена у новорожденных немного ниже, чем у взрослых, а его функциональная незрелость отражается в пролонгировании ТВ. Фибриноген новорожденных (фетальный фибриноген), характеризующийся повышенным содержанием сиаловой кислоты, обладает сниженной активностью: сгусток менее прочный, чем у взрослого человека, и быстрее лизируется [9] (табл. 2).
Таблица 2. Референтные значения параметров плазменного гемостаза у новорожденных Me (Q5—Q95)
| Показатель | Объем выборки | Медиана, Me | РИ (дети), Q5—Q95 | ДИ нижнего квартиля (90%) | ДИ верхнего квартиля (90%) |
| АЧТВ, с | 55 | 42,0 | 25,6—57,5 | 20,5—31,2 | 51,9—62,9 |
| ПВ, с | 57 | 14,4 | 10,8—17,8 | 10,1—11,6 | 17,0—18,5 |
| Протромбин по Квику, % | 57 | 70 | 41,4—100,8 | 33,4—49,6 | 91,5—109,2 |
| МНО | 57 | 1,26 | 0,91—1,59 | 0,83—1,00 | 1,50—1,67 |
| Фибриноген, г/л | 61 | 2,53 | 1,51—3,57 | 1,28—1,71 | 3,29—3,81 |
| ТВ8, с | 36 | 23,9 | 20,2—27,2 | 19,2—21,2 | 26,3—27,9 |
| D-димер, нг/мл | 52 | 3352,3 | 1046—14729^ | 771,6—1181,8 | 5970,5—31446,9 |
| PLG, % | 34 | 48 | 30,0—66,9 | 23,7—34,6 | 61,3—71,8 |
| PI, % | 26 | 99,5 | 83,3—118,6 | 78,4—88,0 | 112,2—123,6 |
| АТ, % | 40 | 50,2 | 28,6—73,1 | 21,4—36,4 | 64,9—80,6 |
| PrC, % | 29 | 30,4 | 11,6—51,2 | 6,2—16,8 | 44,6—57,1 |
| PrS, % | 26 | 58,1 | 30,1—85,2 | 21,7—39,4 | 75,9—93,7 |
| vWF:Ag, % I, II, III, IV гр. кр. | 41 | 117,6 | 45,3—184,5 | 28,5—63,9 | 166,9—201,2 |
| vWF:Ag, % I гр. кр. | 16 | 123,3 | 63,9—187,1 | 35,7—91,2 | 159,8—206,9 |
| vWF:Ag, % II, III, IV гр.кр | 25 | 112,9 | 31,6—190,5 | 9,2—54,8 | 162,2—218,6 |
| Фактор VIII, % | 35 | 86,0 | 43,1—133,3 | 33,8—53,9 | 119,4—145,6 |
| Фактор XIII, % | 29 | 67,3 | 46,6—84,8 | 41,8—52,5 | 79,3—89,4 |
Примечание. 100% активность факторов свертывания соответствует МЕ/дл; ^ — Q10—Q90.
В первые дни жизни уровни большинства факторов свертывания крови в плазме крови детей были примерно в два раза ниже, чем у взрослых [10]. Увеличенные ПВ и АЧТВ обусловлены низким уровнем витамин К-зависимых факторов [11]. Фактор VII почти взрослого уровня достигает на 5-й день, в то время как ф. II, факторы IX и X повышаются относительно позже [12]. Ранее показано, что у недоношенных новорожденных уровень факторов свертывания ниже, чем у доношенных, но значения, соответствующие взрослым, независимо от срока гестации при рождении обычно достигаются в возрасте от нескольких месяцев до 16 лет [12, 13]. Одновременно со сниженной активностью факторов свертывания отмечается сниженная активность естественных антикоагулянтов: антитромбина, протеина C и протеина S. У новорожденных антитромбин представлен двумя изоформами: нативной и латентной, которая составляет 30% от значений у взрослых и ассоциирована с тяжелыми спонтанными тромбозами [14]. Протеин C при рождении присутствует в эмбриональной форме, хотя его физиологические различия остаются неясными [11]. Низкие уровни протеина S обусловлены незначительным количеством белка-переносчика (C4b-связывающего белка) у новорожденных, но уравновешиваются высокой концентрацией свободного протеина S [15]. Состояние неонатальной фибринолитической системы недостаточно изучено. По данным разных авторов, ее расценивают как незрелую [16], со сниженной функцией [17] или функционально адекватную [18], некоторые утверждают, что фибринолиз может быть увеличен по сравнению со значениями для взрослых [11]. При рождении и в неонатальном периоде уровень плазминогена обычно низкий (50—66% от значений взрослых), что приводит к относительно гипофибринолитическому состоянию [11], однако уровень D-димера (показатель степени активного фибринолиза) у новорожденных в первые 3 дня повышен до 8 раз от нормы взрослого человека [19]. Вероятно, во время прохождения через родовые пути, адаптации кровообращения или кратковременного гипоксического состояния у новорожденных активируются эндотелий, коагуляционная и фибринолитическая системы, результатом чего является более высокий уровень D-димера и фактор Виллебранда по сравнению со взрослыми [20]. В нашем исследовании фактора Виллебранда соответствовал среднему уровню у взрослых и был одинаковым у детей с I и II, III или IV группой крови (Р=0,4383). Высокий уровень активности фактора Виллебранда и циркулирование крупных мультимеров компенсируют относительную неонатальную гипофункцию тромбоцитов [21].
Заключение
Компоненты системы гемостаза новорожденных при сохранении в целом сбалансированного и физиологического гемостаза демонстрируют как количественные, так и качественные возрастные различия, что определяет необходимость получения РИ, соответствующих возрасту ребенка. Рассчитанные нами РИ параметров гемостаза позволят корректно интерпретировать результаты гемостазиологического обследования, полученные в лабораториях на коагулометрах ACL TOP family с использованием реагентов Instrumentation Laboratory.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.