Коронавирусы (CoV, Coronoviridae) — это семейство вирусов, содержащих в качестве генетического материала одноцепочечную (+) РНК, со специфическими гликопротеидными шипами (спайками) вокруг вирусного капсида, которые при электронном микроскопировании похожи на солнечную корону [1]. Семейство коронавирусов делится на несколько подсемейств, включающих четыре рода (от альфа- до дельты-), которые потенциально патогенны для различных видов млекопитающих, включая человека [2]. За последние 20 лет, кроме ранее известных видов из семейства коронавирусов, патогенных для человека, входящих в структуру сезонных ОРВИ, были описаны новые более патогенные виды: SARS-CoV, описанный в 2002 г., который в 2002—2003 гг. явился причиной вспышки атипичной пневмонии в Китае; MERS-CoV, который в 2012 г. вызвал вспышку ближневосточного респираторного синдрома в Саудовской Аравии и в 2015 г. — в Южной Корее (MERS) и новый коронавирус SARS-CoV-2, который вызвал вспышку болезни, названной COVID-19, в китайской провинции Ухань, которая на настоящее время переросла в глобальную пандемию [3]. Достаточно высокая степень передачи нового коронавируса (средний индекс репродукции 2.2) и потенциальная тяжесть последствий респираторного заболевания, вызываемого данным вирусом, превратили его в главнейшую медицинскую проблему 2020 г. [1, 4].

Изучение факторов патогенности коронавируса SARS-CoV-2 показало, что в клетки человека он проникает через рецепторы к ангиотензинпревращающему ферменту 2-го типа (ACE2), который достаточно широко представлен в различных тканях: он экспрессируется в легких на уровне альвеол, кишечнике, гонадах, почках и т.д. [5]. Поэтому потенциально при новой коронавирусной инфекции могут поражаться не только дыхательные пути, но и другие ткани и органы [1, 5, 6]. С диагностической точки зрения это означает, что вирусная РНК может детектироваться не только в биоматериале из дыхательных путей (назофарингеальные соскобы, БАЛ, мокрота), но и в других биологических жидкостях (фекалии, моча, кровь) [1, 5, 7, 8].

В настоящее время референсным методом диагностики новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с обратной транскрипцией вирусной РНК [9]. Из-за достаточно стремительного распространения нового коронавируса по миру особое значение приобретает максимально широкий охват данным молекулярно-генетическим тестированием населения различных стран для эффективного проведения противоэпидемических мероприятий [9]. Например, показано, что до начала глобального ограничения сообщения с Китаем как первичного источника пандемии количество недиагностированных случаев инфицирования SaRS-CoV-2 составило примерно 79% от общего количества, что сыграло ключевую роль в перерастании локальной вспышки коронавирусной инфекции в глобальную пандемию [10]. Показателен опыт стран, где именно за счет широкого охвата тестами максимального числа человек удалось снизить скорость эпидемического распространения SARS-CoV-2, например в Южной Корее [11, 12]. Схожие подходы к тестированию были использованы в Сингапуре, Гонконге и на Тайване [13, 14]. Кроме широкого охвата тестирования населения, также важным является быстрое получение результата молекулярно-генетического тестирования, особенно у индивидов с бессимптомным носительством SARS-CoV-2 [9]. Быстрая молекулярно-генетическая дифференциальная диагностика COVID-19 с другими респираторными патологиями, в том числе с сезонными ОРВИ и гриппом, позволяет максимально исключить внутрибольничное распространение инфекции, что является важным фактором сдерживания эпидемического процесса [15, 16].

Правильная оценка результатов молекулярно-генетического тестирования должна учитывать стадийность развития патологического процесса при инфицировании SARS-CoV-2 [9, 17]. На рисунке показана схема постановки диагностических задач на различных стадиях развития инфекционного патологического процесса новой коронавирусной инфекции.

Постановка диагностических задач на выявление SARS-CoV-2 у индивидуумов с подозрением на новую коронавирусную инфекцию на различных стадиях заболевания.

Тесты, подходящие для одной стадии мониторинга за пациентом (например, для его эпидемиологического надзора), могут совершенно не подходить для другой стадии (быстрый скрининг пациентов с симптомами COVID-19 для помещения их в карантинную палату с последующей защитой контактирующих с ними медработников СИЗ). Для получения результатов тестирования, способных повлиять на определенное диагностическое решение, врачи должны рассматривать каждый из них с точки зрения определенной диагностической задачи. На данный момент используются в основном тесты для ПЦР-диагностики, однако использование в дальнейшем иммунологических тестов для выявления специфических антител классов IgM и IgG к SARS-CoV-2 может иметь решающее значение для эпидемического наблюдения за контактными пациентами, прогнозирования развития эпидемического процесса и анализа развития иммунитета к новому коронавирусу.

Таким образом, для каждой из стадий развития инфекции SARS-CoV-2 максимально подходит только определенный тип лабораторного тестирования [9]. Дизайн теста должен соответствовать определенным параметрам: напрямую ли он детектирует вирусную РНК (ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией) или же косвенно (исследование специфических антител), время выполнения исследования, его пропускная способность, его дозирование (возможность использования перед тестированием минимального количества образцов), а также возможность использования тестов в «полевых условиях» в случае отсутствия хорошо оснащенной ПЦР или иммунологической лаборатории. Также важным является специфичность и чувствительность тест-системы. Если принять за базис стадийность степени репликации SARS-CoV-2 до зависимости от стадии заболевания и тяжести клинической картины, ПЦР тесты с низкой чувствительностью подойдут для тестирования симптоматических пациентов, но у асимптомных индивидуумов могут дать ложноотрицательный результат.

Разберем теперь, каким образом лучше проводить тестирование на наличие SARS-CoV-2 с точки зрения развития заболевания, а также наблюдения за развитием эпидемического процесса. В задачи данного обзора не входит рассмотрение тест-систем конкретных производителей, но базисные параметры используемых лабораторных тестов рассмотреть необходимо.

В настоящее время, как уже было отмечено выше, референсным методом диагностики инфекции SARS-CoV-2 является метод real-time PCR с обратной транскрипцией вирусной РНК. Но появляются новые методы диагностики рассматриваемой нами инфекции, в частности иммунологические, которые для ряда задач подходят больше, чем молекулярно-генетическое исследование [9, 17]. В таблице представлен перечень типов специфического лабораторного тестирования нового коронавируса согласно стадийности развития заболевания и задач наблюдения за эпидемическим процессом по схеме, показанной ни рисунке.

В таблице светло-серым выделены ячейки, тесты в которых хорошо адаптированы для поставленных диагностических и прогностических задач с точки зрения точности тестирования, его формата и времени получения результата. Белым выделены ячейки, тесты в которых доступны или разработаны для использования в короткие сроки, но имеют существенные ограничения для применения (например, многие из существующих тест-систем для ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией могут давать ложноотрицательные результаты у индивидуумов в инкубационном периоде с низкой вирусной нагрузкой или же у пациентов с вирусоносительством, где тоже может предполагаться низкая вирусная нагрузка). Темно-серым отмечены ячейки, которые не применяются для соответствующих поставленных задач. NAAT — тест амплификации нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification test), который является альтернативой RT-PCR и для SARS-CoV-2 представлен методом изотермальной амплификации (TMA, LAMP).

Типы лабораторного тестирования SARS-CoV-2, наиболее подходящие для различных диагностических задач на определенной стадии патологического процесса [9, с дополнениями]

Примечание. ¹Предполагается, что анализы разрабатываются и в настоящее время проводится оценка их точности.

²Применение анализов на детекцию антител для диагностики острой инфекции, возможно, сильно ограничено временем начала проявления симптомов, когда наиболее высоки вирусовыделение и способность вирусного агента к трансмиссии.

Рассмотрим некоторые особенности взятия материала для молекулярно-генетического анализа на SARS-CoV-2. CDC рекомендует осуществлять взятие материала из респираторного тракта [6]. В основном анализируются назофарингеальные соскобы, но может проводиться анализ и орофарингеальных, соскобов из средней носовой раковины и передней носовой полости [18, 19]. Для забора образцов предпочтительней использовать алюминиевые или пластиковые зонды с ватными тампонами, причем для увеличения концентрации вирусных частиц в образце желательно материал, полученный из разных отделов респираторного тракта, помещать в одну пробирку с универсальной транспортной средой. Для анализа также может использоваться мокрота, БАЛ и эндотрахеальный аспират, молекулярно-генетический анализ которых может дать в ряде случаев более надежный результат, чем пробы, взятые из верхних дыхательных путей, так как вирус SARS-CoV-2 более тропен к клеткам нижних отделов респираторного тракта [6].

В США для молекулярно-генетического тестирования новой коронавирусной инфекции применяется одобренный CDC тестовый набор, который содержит праймеры к двум локусам вирусного нуклеокапсида (N1 и N2) и для гена человеческой рибонуклеазы P [9]. Данный набор отличается от рекомендованного ВОЗ, в котором используются праймеры к генам SARS-CoV РНК-зависимой РНК полимеразы (RdRP) и капсидного белка (E) [20]. Оба тестовых набора обладают высокой аналитической чувствительностью и специфичностью и минимальной перекрестной реакцией с другими циркулирующими видами коронавирусов [9]. Данные тесты могут использоваться в качестве как скрининговых, так и подтверждающих в референсных лабораториях и лабораториях, выполняющих массовое тестирование. Также FDA одобрено около 20 коммерческих тестов, которые могут быть использованы молекулярно-генетическими лабораториями для расширения тестирования на новый коронавирус.

Для быстрого молекулярно-генетического анализа в режиме «полевых условий» амбулаторных учреждений здравоохранения первичного медицинского звена новой коронавирусной инфекции FDA был одобрен ряд тест-систем, с которыми может работать медицинский персонал вне стационарных лабораторий. Эти тесты позволяют получить результат максимум за 1 ч, работа с ними не требует особой лабораторной квалификации. Это тест-системы в виде готовых картриджей, работающих на платформах Abbott ID NOW («Abbott Laboratories»), BioFire FilmArray («bioMerieux»), cobas Liat («Roche Diagnostics»), и GeneXpert («Cepheid») [21]. Использование таких тест-систем, которые быстро дают результат вне лаборатории, может иметь решающее значение для быстрого выявления инфицированных новым коронавирусом. Например, такие тесты на базе платформы GeneXpert хорошо себя зарекомендовали для массового быстрого тестирования таких социально значимых инфекций, как туберкулез или ВИЧ [9]. Поэтому благодаря их пропускной способности можно будет проводить массовое тестирование на SARS-CoV-2 в странах и регионах со слаборазвитой стационарной лабораторной службой, хотя у таких аналитических систем могут быть определенные ограничения их чувствительности и специфичности.

В настоящее время для массового молекулярно-генетического тестирования на новую коронавирусную инфекцию в условиях стационарной лаборатории целесообразно использовать тест-системы высокой пропускной способности на базе автоматических станций для выделения вирусной РНК и подготовки ПЦР-смеси для амплификации, например тест-систему на платформе Cobas 6800, которая обладает хорошей аналитической чувствительностью (примерно 700 копий РНК/мл), сравнимую с тест-системами на базе ручных методов выделения РНК [22], что позволяет использовать ее как для скрининга новой коронавирусной инфекции, так и в качестве подтверждающего теста. Данные тест-системы позволяют многократно ускорить процесс молекулярно-генетической диагностики SARS-CoV-2, что важно как для оперативного выявления бессимптомных носителей, так и для подтверждения диагноза COVID-19.

В Китае и некоторых других азиатских странах в отличие от стран Европы для массового скрининга на SARS-CoV-2 больше используются тест-системы на базе не RT-PCR для автоматических станций, а вышеописанной изотермической амплификации (LAMP) [23]. Как уже отмечалось, данный метод является более простым для использования вне специализированных ПЦР-лабораторий, и некоторые авторы указывают на его пригодность для массового скрининга новой коронавирусной инфекции, так как его чувствительность и специфичность эквивалентны методу ПЦР в реальном времени [24, 25]. Но исследования других авторов показали, что специфичность и чувствительность тест систем на базе изотермической амплификации ниже, чем на базе RT-PCR [26, 27]. Поэтому, по нашему мнению, на настоящее время более подходящим для массового молекулярно-генетического скрининга SARS-CoV-2 является метод качественной ПЦР в реальном времени на платформе автоматизированных станций выделения вирусной РНК.

Одним из новых методов молекулярно-генетического анализа новой коронавирусной инфекции, который сейчас активно внедряется в клиническую практику, является метод количественного определения вирусной нагрузки SARS-CoV-2 с помощью цифровой капельной ПЦР (droplet digital PCR, ddPCR) [28]. С помощью данной методики можно анализировать не только назофарингеальные соскобы, но и другие биологические жидкости (кровь, мочу, мокроту). Более высокая чувствительность данной методики по сравнению с ПЦР в реальном времени (до 11 копий РНК/мл) позволяет оценивать вирусную нагрузку даже на ранних стадиях заболевания, когда потенциально она ниже порога чувствительности тест-систем на базе RT-PCR и является перспективной для более точного выявления новой коронавирусной инфекции у пациентов с бессимптомным носительством [29, 30].

Завершая обзор методов ПЦР диагностики новой коронавирусной инфекции, кратко опишем, каким образом можно оптимизировать преаналитический и аналитический этапы для повышения точности выявления SARS-CoV-2 молекулярно-генетическими методами. Для взятия назофарингеальных соскобов рекомендуется использовать полиэстеровые зонды с пластиковыми толстыми наконечниками; такой тип зондов более эффективен для взятия соскоба, чем урологические зонды с ватным наконечником [31]. После взятия материала зонды немедленно помещаются в полипропиленовые микроцентрифужные 1,5 мл пробирки с транспортной средой (например, TRIzol). Для повышения специфичности и чувствительности ПЦР-тестирования рекомендуется использовать тест-системы, в которых праймеры подобраны не к одному, а к нескольким таргетным генетическим маркерам SARS-CoV-2 (например, к генам RdRP (ген РНК-зависимой РНК полимеразы), N (ген нуклеокапсидного белка), E (ген белка оболочки) и S (ген спайкового белка)) [31]. В случае получения сомнительного результата на наличие SARS-CoV-2 в биоматериале рекомендуется повторный ПЦР-анализ с использованием тест-системы с более высокой чувствительностью.

Рассмотрим теперь кратко перспективы использования иммунологических тестов на новую коронавирусную инфекцию. Относительно тестов на вирусный антиген, как показывает практика иммунологического тестирования антигенов вирусов гриппа респираторно-синтициальной инфекции, данные тест-системы могут оперативно давать результаты в амбулаторных условиях первичного медицинского звена [32]. Но такой тип тест-систем для вышеуказанных сезонных ОРВИ показывает неоптимальную чувствительность с точки зрения диагностики. Для нового коронавируса такие иммунологические тесты сейчас активно разрабатываются, причем их основой служат моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку [33, 34]. Что касается серологических тестов на специфические антитела класса IgA, IgM, и IgG, для возможности их использования ситуация двоякая. С одной стороны, метод ИФА с поиском антител в периферической крови или слюне может быть проще по исполнению, чем все методы NAAT, поэтому его можно использовать в определенных ситуациях [9, 35]. Сдругой стороны, данный метод имеет ряд ограничений: зависимость от стадии развития заболевания, инерционность активной выработки антител на инфекционный агент (антитела образуются от нескольких дней до 1 нед в количестве, достаточном для их обнаружения), перекрестная реакция с другими видами коронавирусов человека [34, 35]. Серологические тесты могут быть полезны у пациентов на поздних стадиях заболевания, когда происходит снижение репликации и активного вирусовыделения SARS-CoV-2. В этом случае молекулярно-генетические тесты могут дать ложноотрицательный результат. Ряд исследований, например [36], показывает почти 100% корреляцию между положительным анализом методом RT-PCR и уровнем выработанных специфических антител классов IgM и IgG методом ИФА у пациентов, госпитализированных с симптомами COVID-19. Так же как показано на вышеприведенной схеме, такие тесты незаменимы для эпидемиологического наблюдения и эпидемиологических исследований и могут также применяться для разработки вакцинных препаратов и вакцин против нового коронавируса.

Резюмируя данный обзор, можно отметить, что, несмотря на активное развитие в настоящее время методов специфической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции, к основным методам (RT-PCR и серологические тесты) лабораторной диагностики новой коронавирусной инфекции остается еще много вопросов. Как мы показали выше, определенный тип тестов подходит только к определенной фазе развития патологического процесса. И главная проблема — выявление бессимптомных носителей инфекции и пациентов в инкубационном периоде. Учитывая достаточную длительность инкубации при COVID-19 (в среднем 5—6 дней, но возможно увеличение вплоть до 2 нед), данные индивидуумы могут играть ключевую роль в развитии эпидемического процесса. Следует также отметить тот факт, что до конца не изучена стадийность репликации и вирусовыделения SARS-CoV-2, что также усложняет точное выявление новой коронавирусной инфекции. Поэтому на данный момент необходима разработка тестов для выявления SARS-CoV-2 с учетом не только специфических свойств нового коронавируса, но и особенностей патогенеза данной инфекции. Разработка таких тестов может сыграть решающую роль в выявлении асимптомных носителей заболевания, позволит уточнить особенности его этиопатогенеза и в конечном итоге взять под полный контроль развитие эпидемического процесса [37].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.