Введение

Новая коронавирусная инфекция продолжает распространяться во всем мире, несмотря на применение различных мер общественного здравоохранения. Вероятно, быстрое возобновление случаев заболевания произошло после частичного ослабления мер социального дистанцирования [1]. Однако активное диагностическое тестирование вместе с оперативной изоляцией и карантином близких контактов успешно предотвратило дальнейшее распространение инфекции в некоторых странах [2, 3]. Для контроля вспышек новой коронавирусной инфекции актуальным является масштабное ПЦР-тестирование на SARS-CoV-2, что регламентируется рядом официальных документов [4, 5]. С целью минимизации распространения COVID-19 необходимо максимально быстро выявить и изолировать носителей коронавируса. Многие регионы испытывают ряд трудностей, связанных с проведением ПЦР-анализа (малое число подготовленных специалистов, большой объем исследований, колоссальные затраты ЛПУ на приобретение реактивов, лабораторного пластика и др.). Такие расходы являются проблемой для всего мира, особенно для регионов со средним и низким уровнем дохода. В некоторых странах (Индия, Китай, Израиль и др.) уже используют стратегию объединенного тестирования. Исследователи утверждают, что с помощью этого метода можно сэкономить реактивы, финансы и время. В условиях пандемии существует потребность в тестировании чрезвычайно большого числа пациентов, что делает объединение проб привлекательным вариантом [6—8]. Ранее вопрос использования различных вариантов объединения проб рассматривался в рабочей группе Федерации лабораторной медицины по лабораторной диагностике COVID-19, материалы были опубликованы в журнале «Лабораторная служба» [9].

Существует несколько вариантов группового тестирования, основанных на математическом алгоритме и отличающихся схемами объединения и количеством раундов выделения РНК и амплификации. В 1943 г. экономистом Робертом Дорфманом была предложена одна из первых стратегий группового обследования, проходящая в два этапа [10]. Для этого равное количество образцов смешиваются вместе и тестируются. Группы с отрицательным результатом исключаются. Если группа дает положительный результат, то каждый образец подвергается повторному тестированию индивидуально.

Исследователи из Эдинбургского университета, Великобритания, совместно с сотрудниками Южной Африканской Республики (ЮАР) оптимизировали этот подход и разработали более экономные способы группового тестирования. Основная идея заключается в «умном смешивании» образцов по определенной схеме и включает в себя два раунда. Первый раунд объединенных тестов такой же, как использовался в методе, описанном Дорфманом. Во втором раунде при наличии положительного результата предлагается объединение в группы, которые пересекаются между собой [6].

Тестирование с применением двух раундов амплификации требует большего количества времени для выдачи окончательного результата, затрачивается двойной объем реактивов и расходных материалов. Был разработан одноэтапный метод с использованием алгоритма многомерного геометрического куба. Оптимизированная технология заключается в том, что применяется специальный математический алгоритм для создания групп образцов, представленных набором из точек на кубической решетке в объемных измерениях, организованных в виде гиперкуба с точками на стороне (см. рисунок). Если есть 1 инфицированный человек, то по одному из срезов в каждом из направлений будет положительный результат. Этот срез указывает координаты образца. Разработано две модели гиперкуба: для тестирования 27 образцов куб с гранями 3×3×3, 81 образца — куб 3×3×3×3 [6, 11].

Модель Гиперкуб для группового тестирования (L. Mutesa, P. Ndishimye, Y. Butera, et al., 2021).

Один из вопросов, который тревожит специалистов лабораторной диагностики, каким образом групповое тестирование будет влиять на чувствительность метода и, как следствие, получение ложноотрицательных результатов. Метод полимеразной цепной реакции достаточно чувствителен, для получения положительного результата достаточно <10 молекул вирусной РНК. По данным некоторых исследователей, соскоб слизистой оболочки носа и зева, взятый в первые 5 дней заболевания дает в среднем примерно 2·10⁵ молекул вирусной РНК на 1 мл [12]. Используя объединенное в группы тестирование, при 100-кратном разведении в смешанном пуле будет присутствовать 10 молекул РНК, что является достаточным для получения положительного результата [6].

В доказательство этой научной теории коллеги в Руанде провели исследование, используя разведение заведомо положительных проб с отрицательными пробами путем 20-, 50- и 100-кратного разбавления, чувствительность тест-системы составила 85, 81 и 77% соответственно [13]. По окончании амплификации положительные образцы даже при большом разведении выдают сигнал флюоресценции. По данным литературы, использование дополнительных циклов амплификации позволяет обнаружить даже небольшое количество вирусов, когда репликация начинается на границе или позже установленного цикла, заданного инструкцией производителя. В частности, чувствительность тест-системы выше 90% может быть достигнута при 100-кратном разбавлении благодаря использованию дополнительных 44 циклов ПЦР, что всего на 10% больше, чем обычно используется [6].

Технология группового тестирования с использованием модели Гиперкуб существенно экономит время, однако схема смешивания образцов весьма затруднительна для ручного метода выделения нуклеиновых кислот. Применение автоматизированных роботизированных ПЦР-станций является оптимальным решением для применения математических алгоритмов. Ученые-программисты создали приложения, которые помогают распределить и смешать образцы, а также интерпретировать полученные результаты. В научных лабораториях Израиля, ЮАР, Германии, Китая успешно используют автоматизированный метод объединенного смешивания [14].

Цель исследования — сокращение расходования реагентов и ускорение времени выдачи результатов с применением математической модели Гиперкуб.

Материал и методы

Исследование проводилось на базе кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России. В ходе научной работы был проанализирован 81 образец респираторных мазков со слизистой оболочки носа и задней стенки глотки. Первая группа включает скрининговые обследования здорового населения, профилактические осмотры. Вторая группа — пациенты поликлинического звена (с признаками ОРВИ, диагнозом «пневмония»). Третья группа — медицинские работники, имеющие риски инфицирования новой коронавирусной инфекцией, из специализированного ковидного госпиталя Клиник ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России.

В ходе исследования был апробирован метод объединенного смешивания с применением математического алгоритма Гиперкуб. Каждая группа обследуемых включала в себя 27 пациентов и тестировалась отдельно. По итогу смешивания получилось 9 групп по 9 образцов в каждой (табл. 1).

Таблица 1. Схема смешивания образцов

Качественное выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2 проводили с использованием метода одностадийной реакции обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени с применением набора реактивов ПЦР-РВ-2019-nCoV («Синтол», Россия) на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США). Производителем предусмотрено использование 100 мкл образца для выделения РНК. В нашем исследовании для объединенного тестирования 9 проб в одной группе было взято по 12 мкл каждого образца. Дальнейшие этапы очистки нуклеиновой кислоты проводились согласно инструкции производителя. Исследование выполнялось параллельно со стандартным тестированием всех образцов без группового тестирования с применением набора реактивов ПЦР-РВ-2019-nCoV на амплификаторе CFX96. В каждой постановке исследуемых образцов проводился контроль качества с использованием стандартных контрольных отрицательных и положительных образцов.

Результаты и обсуждение

В первой группе были обследованы 27 человек в рамках профилактического осмотра на наличие вируса SARS-CoV-2. Было выявлено 3 положительных группы — №2, 4, 7 (табл. 2).

Таблица 2. Результаты тестирования первой группы

Примечание. Серым цветом обозначены положительные группы.

Методом математического исключения выявлен один положительный образец (табл. 3).

Таблица 3. Выявление положительного образца в первой группе

Примечание. Серым цветом обозначены положительные группы.

Во второй группе (пациенты с признаками ОРВИ, диагнозом «пневмония») исследовались образцы пациентов поликлинического звена. Было получено 5 положительных групп из 9 (табл. 4).

Таблица 4. Результаты тестирования второй группы

Примечание. Серым цветом обозначены положительные группы.

Методом математического исключения получилось 4 положительных образца — №10, 13, 19, 22 (табл. 5).

Таблица 5. Выявление положительного образца во второй группе

Примечание. Серым цветом обозначены положительные группы.

Для идентификации истинно положительных проб второй группы потребовалась дополнительная уточняющая ПЦР-постановка, начиная с выделения РНК. После повторного анализа было выявлено 2 истинно-положительных результата — №13 и 19.

В третьей группе были изучены образцы медицинских сотрудников специализированного госпиталя, имеющих риск инфицирования COVID-19 на рабочих местах, все пробы были отрицательные.

Выводы

Во время пандемии COVID-19 широкомасштабное тестирование на SARS-CoV-2 было реализовано в качестве одной из мер общественного здравоохранения для выявления инфицированных пациентов с целью раннего лечения и изоляции для предотвращения дальнейшего распространения вируса. Поскольку существующие диагностические возможности не позволяют справиться с большим количеством образцов, некоторыми исследователями используется групповое тестирование [15, 16]. Изученный алгоритм Гиперкуб является привлекательным решением для снижения общего количества тестов с целью уменьшения расходов лечебно-профилактических учреждений, а также предлагает максимальную скорость тестирования и выдачи результата. В частности, при исследовании 100 образцов с использованием данной методики может быть достигнута 20-кратная экономия затрат.

Метод группового тестирования целесообразно использовать в группах с низкой вероятностью инфицирования SARS-CoV-2 (профилактические осмотры организованных коллективов, студенты, рейсы самолетов, спортивные команды и т.д.). Не рекомендуется применение данной методики для идентификации новой коронавирусной инфекции у лиц с выраженными симптомами ОРВИ, диагнозом «внебольничная пневмония» в связи с неэффективностью. Предполагается, что данная технология будет успешно применяться в автоматизированных ПЦР-лабораториях.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

И снова... средняя температура по больнице!

Рецензия на статью коллектива авторов «Применение математической модели «Гиперкуб» для исследования SARS-CoV-2»

Проблема диагностики коронавирусной инфекции, несомненно, является актуальной, поэтому любое сообщение о каких-либо усовершенствованиях встречает отклик. Хочется видеть новое в увеличении чувствительности и повышении специфичности такой диагностики. И такие примеры есть — так компания Рош выпустила ПЦР-тест на РНК к SARS-CoV-2 с аналитической чувствительностью 10 копий на мл биологического материала, при существующих на рынке тест-системах с чувствительностью 500 и 1000 копий/мл. Впечатляет! Я уж и не говорю про космические технологии секвенирования, которые должны использоваться повсеместно для отслеживания происхождения и мутаций вируса.

Но есть и противоположные примеры, часто они связаны с погоней за прибылью как в старой истории, попытке продать маленький кусочек индивидуального теста, обходящегося пациенту и так не слишком-то дешево. Я имею в виду попытки объединения нескольких образцов в один, пулирование. Примером такого подхода является статья авторов. В данной статье авторами предпринята попытка ускорить и удешевить существующую систему лабораторной диагностики коронавирусной инфекции. К сожалению, не всегда удешевление и ускорение приводит к повышению качества проводимых исследований.

Пандемия преподала нам несколько уроков: во-первых, документировать все процедуры для необходимой отчетности; во-вторых, следовать строго протоколам (инструкциям) проведения исследований; в-третьих, проводить количественные исследования, необходимые для выдачи пациентам с целью постановки диагноза и контроля эффективности лечения. Ни одно из этих требований не может быть выполнено при объединении образцов.

В самом начале эпидемии все с головой окунулись в тестирование пациентов методом ПЦР, не хватало ресурсов и администраторы стали диктовать условия врачам по оптимизации тестирования. Это были необходимые меры. Людям с коммерческим складом ума такие технологии были быстро восприняты и пулированием стали злоупотреблять из-за колоссальной выгоды таких исследований.

Многие ученые уже признали, что пулирование образцов на этапе скрининга значительно снижает чувствительность метода. Эту проблему можно каким-то образом решить, снизив количество пулированных образцов, получив лишь незначительное снижение чувствительности, что не явится клинически значимым особенно в период эпидемии, когда требуется снижения доли ложноположительных результатов для контаминированных образцов. Таким образом, эффективность останется прежней или, наоборот, даже может увеличиться. Авторы же предлагают увеличить количество проб в тестируемом пуле до десяти и при этом не проводят исследований, показывающих сохранение чувствительности для данной тест системы, а приводят только литературные ссылки.

При хорошо обоснованной и доказанной с помощью математического аппарата технологии у нас был бы готовый протокол пулирования на случай экстренных ситуаций, связанных с дефицитом ресурсов и данный материал помог бы в случае необходимости сослаться на него. Представляется, да и сами авторы об этом неоднократно упоминают, что сама модель оперирует определенным математическим аппаратом. В этом случае не стоит подменять статистические методы обработки результатов математическими методами модели (метод математического исключения).

И теперь мы продолжаем оставаться заложниками системы, хорошим выходом из этого было бы использование количественных методов определения содержания РНК вируса, и насколько я понимаю, это вполне достижимо. В этом случае, результатом теста будет содержание РНК на слизистых, а решение должно приниматься лечащим врачом уже исходя из клинической интерпретации, Выяснилось, что существует определенная зависимость между количеством копий РНК и заразностью пациента, и разработка референтного интервала — тема отдельного научного исследования.

Использовать ли данный метод разведения в своей практической работе или не использовать — остается на рассмотрение исследователей. За ними остается право выбора диагностических алгоритмов и диагностических тест-систем: либо выбрать тест с высокой чувствительностью и выдать количественный результат с определенным референтным диапазоном, либо выбрать качественный тест, получить сомнительный результат и потом сомневаться в его интерпретации и объяснять технологию его получения.

Кривцов Александр Владимирович

Зав. лаб. иммуногенетики

ФБУН ФНЦ Медико-профилактических технологий

Управления рисками здоровью населения Роспотребнадзора