Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в мире ежегодно регистрируется около 1 млрд случаев сезонного гриппа, причем до 5 млн человек переносят его в тяжелой форме, а смертность от заболевания или вызванных им осложнений составляет от 290 000 до 650 000 человек [1].

Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП), природным резервуаром которого являются дикие птицы, в настоящее время практически не передается от человека к человеку, заражение происходит при тесном контакте с пораженной птицей. Симптомы заболевания человека варьируются от легкой инфекции верхних дыхательных путей до чрезвычайно тяжелых состояний с высокой смертностью. Однако особая опасность вируса ВПГП для человека связана с тем, что вирусы гриппа достаточно легко преодолевают межвидовые барьеры и адаптируются к новым хозяевам путем приобретения мутаций и генетической реассортации, что может привести к масштабным эпидемиям с тяжелыми последствиями [2].

Самым известным среди «птичьих» штаммов вируса гриппа А является высокопатогенный штамм H5N1, приведший с 2003 г. по март 2024 г., согласно данным ВОЗ, к 888 случаям заражения людей, из которых 462 (52%) случая закончились смертью заболевших [3]. В 2016—2017 гг., а также в 2020 г. широкое межконтинентальное распространение получила клада вируса H5 2.3.4.4b, появившаяся в 2014 г. путем реассортации циркулировавших вирусов гриппа H5Nx [4, 5]. Данная клада распространилась через перелетных птиц в Африке, Азии и Европе, что привело к беспрецедентному количеству случаев гибели диких птиц и домашней птицы. В 2021—2022 гг. вирусы гриппа клады H5 2.3.4.4b были занесены в Северную и Южную Америку. В связи с масштабным распространением данной клады вируса в 2021—2024 гг. зафиксированы массовые случаи заболевания высокопатогенным гриппом H5N1 крупного рогатого скота, коз, кошек, лис, енотов, скунсов, белых медведей и ластоногих. Крупная вспышка ВПГП H5N1 произошла в США весной 2024 г. в стадах крупного рогатого скота и продолжается до настоящего момента [6].

Заражение человека высокопатогенным реассортантным штаммом гриппа A (H7N9) впервые было зафиксировано в Китае в 2013 г., в общей сложности зарегистрировано 1568 подтвержденных случаев заражения человека данным подтипом вируса, из которых 616 (39%) случаев закончились летальным исходом [7].

Большое беспокойство по поводу гриппа A (H9N2) связано с его высокой способностью к реассортации [8]. Вирус H9N2 впервые был выявлен у человека в 1999 г. в Гонконге, в дальнейшем случаи инфицирования от домашней птицы были зафиксированы в Египте, Бангладеш, Пакистане и Омане, зарегистрировано 59 лабораторно подтвержденных случаев [9].

Еще одним потенциально опасным для человека подтипом вируса гриппа птиц является подтип H10; спорадические случаи заражения человека с высокой долей летальных исходов выявлены в Китае (H10N8, 2013 и H10N3, 2021), Египте (H10N7, 2004) и других странах [10, 11, 12]. В отдельных случаях наблюдалась коинфекция сезонным гриппом А (H3N2) и вирусом H10N5 (Китай, 2024, случай с летальным исходом) [13].

Все это свидетельствует о том, что вирус гриппа А подтипов H5, H7, H9 и H10 обладает высоким пандемическим потенциалом.

Для выявления вируса гриппа типа А и идентификации его подтипов в лабораторной диагностике активно используют метод ПЦР, что связано с его высокой специфичностью и чувствительностью. В настоящий момент в Российской Федерации зарегистрировано только одно медицинское изделие для выявления подтипов H5, H7, H9 вируса гриппа А методом ПЦР, но данный диагностикум имеет ряд недостатков. Во-первых, набор не охватывает все потенциально опасные для человека подтипы вируса гриппа, а во-вторых, полный цикл исследования включает дополнительные этапы, требующие наличия дополнительных наборов реагентов, например для проведения обратной транскрипции РНК.

Цель исследования — разработка и внедрение диагностического набора реагентов для определения РНК вируса гриппа А и типирования подтипов H5, H7, H9, H10 в биологическом материале человека (мазках со слизистой носоглотки и ротоглотки, мокроте) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Материал и методы

Дизайн праймеров и зондов

В работе использовали последовательности геномов вирусов гриппа А, В, С из баз данных NCBI [14] и Gisaid EpiFlu [15]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма MUSCLE в программе MEGAX [16]. Дизайн олигонуклеотидных праймеров и TaqMan зондов проводили в соответствии со стандартными требованиями, учитывая выявленные полиморфизмы последовательностей.

Для выявления РНК вируса гриппа А были выбраны олигонуклеотидные праймеры и зонды в области гена матриксного белка гриппа А. Для типирования подтипов H5, H7, H9, H10 вируса гриппа А специфические праймеры и зонды были выбраны в области гена гемагглютинина. Подтверждение высокой идентичности нуклеотидных последовательностей выбранных олигонуклеотидов только к целевым таксонам (вирусу гриппа А или отдельным подтипам H5, H7, H9 и H10) осуществляли с использованием ресурса BLAST.

Контрольные образцы

В качестве внутреннего контрольного образца (ВКО IC-R1) использовали искусственную синтезированную рекомбинантную последовательность РНК, заключенную в оболочку Ms2-фага. Положительный контроль (ПКО) представлял собой смесь рекомбинантных РНК, содержащих целевой участок гена М1 вируса гриппа А, а также целевые участки гена HA подтипов H5, H7, H9 и H10 вируса гриппа А, в оболочке Ms2-фага. Нуклеотидные последовательности вставок всех генно-инженерных конструкций подтверждали секвенированием по Сэнгеру.

Концентрацию РНК бактериофагов ВКО IC-R1 и ПКО измеряли методом цифровой капельной ПЦР с использованием системы QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad Laboratories, США).

Экстракция РНК

Для исследования на наличие РНК вируса гриппа использовали мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки и мокроту, так как вирус преимущественно поражает клетки эпителия слизистой оболочки верхних дыхательных путей с последующим инфицированием нижних дыхательных путей. Для экстракции РНК из биоматериала использовали комплект реагентов «РИБО-преп» производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. Принцип действия основан на лизисе клеток и денатурации клеточных белков с помощью раствора для лизиса, содержащего хаотропный агент (гуанидина изотиоцианат), с последующим осаждением нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя гликогена и экстракцией их в раствор. При экстракции РНК в образцы исследуемого материала добавляли ВКО IC-R1.

ОТ-ПЦР

ПЦР-смеси H5/H7/H9 и H10/M (2,5-кратные) готовили с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров и зондов в концентрации 0,5 — 0,8 мкМ каждого и по 0,7 мМ каждого дНТФ. Таким образом, при исследовании в одной пробирке со смесью H5/H7/H9 проводили 4 реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса гриппа А подтипов H5, H7, H9 и кДНК ВКО IC-R1. Для смеси H10/M в одной пробирке проводили 3 реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса гриппа А, вируса гриппа А подтипа H10 и ВКО IC-R1.

Специфические TaqMan-зонды метили различными флуорофорами, чтобы регистрировать накопление продуктов амплификации на разных каналах детекции, в соответствии с табл. 1.

Таблица 1. Анализ результатов амплификации по каналам для флуорофоров

Для амплификации смешивали реагенты из расчета на одну реакцию: 10 мкл одной из приготовленных ПЦР-смесей, 5 мкл ПЦР-буфера-R, 0,5 мкл Taq-полимеразы, 0,25 мкл ревертазы MMlv (реагенты производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА России) и вносили по 10 мкл проб РНК, полученных в результате экстракции из исследуемых образцов.

Валидация разработанного набора реагентов

В связи с отсутствием в настоящий момент зарегистрированных случаев заболеваний человека в Российской Федерации ВПГП подтипов H5, H7, H9, H10 диагностические характеристики проверяли на штаммах гриппа А, В, С, а также биологическом материале от диких и сельскохозяйственных птиц (мазки из клоаки, ротоглотки, тканевой материал трахеи и легких, селезенки, головного мозга, воздухоносных мешков, кишечника, сердца, почек, мазки на транспортных FTA-картах). Для биологического материала подтверждали наличие РНК вируса гриппа А и типировали подтипы H5, H7, H9 методом ОТ-ПЦР с использованием наборов реагентов «АмплиСенс Influenza virus A/B-FL», «АмплиСенс Influenza virus A-тип-H5, H7, H9-FL». Наличие РНК вируса гриппа А подтип H10 подтверждали секвенированием гена гемагглютинина в соответствии с протоколом ВОЗ [17], опубликованным на сайте организации.

Аналитические характеристики оценивали с использованием ПКО бактериофагов, содержащих фрагменты РНК вируса гриппа А с известными концентрациями.

Клинико-лабораторные испытания

Испытания набора реагентов для подтверждения его эффективности с целью последующей государственной регистрации как медицинского изделия для диагностики in vitro проводились в аккредитованном испытательном центре продукции ООО «НАКФФ». Для испытаний использовали остаточные образцы клинического материала от больных с характерными клиническими симптомами ОРВИ и от пациентов без признаков ОРВИ.

Аналитическую чувствительность оценивали на модельных образцах биоматериала с добавлением положительных контрольных образцов, содержащих фрагменты РНК вируса гриппа А подтипов H5, H7, H9, H10. Пробы в пороговой концентрации 1∙10³ ГЭ/мл и 5∙10² ГЭ/мл анализировали в 20 повторах, в концентрации 5∙10³ ГЭ/мл — в 3 повторах.

Аналитическую специфичность оценивали на панели инактивированных штаммов вируса гриппа А (H1N1) pdm09 (А/С.-Петербург/НИИГ-94/20), А(H2N3) (А/Утка/Германия-1215/73), А(H3N2) (А/Красноярск/НИИГ-20/21), A(H5N1) (А/Скворец/233/07), A(H5N1) (А/NIBRG-14/2005), A(H5N3) (А/duck/Moscow/4971/13), A(H7N3) (А/Mallard/NT/12/2002), A(H7N7) (А/Equine/Corbora/5/1976), инактивированных A(H7N9) (А/Anhui/1/2013), A(H9N2) (А/HK/1073/1999), A(H9N2) (А/Чирок/Колотун/Приморье/3628/2002), A(H10N5) (А/mallard/Dagestan/004/2018), вируса гриппа B (В/С.-Петербург/НИИГ-183/2020), вируса гриппа C (С/Taylor/1233/1947) из коллекции ФГБУ«НИИ гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава России, а также с использованием нуклеинового материала других вирусных и бактериальных штаммов.

Диагностические показатели оценивали при анализе клинических образцов от пациентов с признаками ОРВИ и модельных образов, имитирующих биологический материал от больных ВПГП подтипов H5, H7, H9, H10. Для подготовки модельных образцов использовали мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки и мокроту от пациентов без признаков ОРВИ, не содержащие РНК вируса гриппа А. Образцы контаминировали штаммами вируса гриппа А подтипов H5N1, H7N3, H9N2 и H10N5 и биологическим материалом от птиц. Было проанализировано 173 образца мазков и 170 образцов мокроты.

Основные результаты

Отсутствие перекрестных реакций показано по результатам тестирования кДНК/ДНК вирусных и бактериальных возбудителей различных инфекций человека. Для реакций, дифференцирующих целевые подтипы H5, H7, H9, H10 вируса гриппа А, было показано отсутствие перекрестных реакций с другими подтипами вируса.

Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) ОТ-ПЦР была определена на разных видах амплификаторов, включая Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), CFX96 (Bio-Rad, США), ДТпрайм («ДНК-Технология», Россия) и составила 1·10³ ГЭ/мл РНК вируса гриппа А и целевых подтипов H5, H7, H9, H10 как для мазков со слизистой носоглотки и ротоглотки, так и для мокроты. На диаграмме (рисунок) приведены результаты обнаружения РНК вируса гриппа А и целевых подтипов, добавленных в модельные образцы мазков и мокроты, до определенной концентрации (5·10³, 1·10³ или 5·10³ ГЭ/мл). Как видно из полученных результатов, РНК вируса гриппа А и подтипов H5, H7, H9, H10 воспроизводимо выявляется в образцах, содержащих целевую РНК в концентрации 5·10³ ГЭ/мл (n=6) и 1·10³ ГЭ/мл (n=20). При исследовании образцов с более низким содержанием РНК вируса гриппа (5·10² ГЭ/мл) обнаружение происходит не во всех образцах, что указывает на содержание в данных образцах целевой РНК вируса ниже предела обнаружения.

Определение аналитической чувствительности набора реагентов «АмплиТест Influenza A H5/H7/H9/H10». Амплификатор CFX96 (Bio-Rad).

Образцы, в которых не обнаруживается РНК вируса гриппа А и целевых подтипов H5, H7, H9, H10, вынесены за пределы пунктирной линии конечного Ct, 45-й цикл. Обработка данных была проведена с использованием ресурса https://datatab.net.

Исследование проводили на разных сериях набора реагентов в разных лабораториях, полученные результаты свидетельствуют о достаточной повторяемости и воспроизводимости независимых результатов испытаний.

Для оценки диагностических характеристик в ходе клинических испытаний было проанализировано в общей сложности 343 охарактеризованных образцов мазков и мокроты. Показано полное совпадение результатов с результатами исследований образцов системой сравнения, данные представлены в табл. 2.

Таблица 2. Оценка диагностической чувствительности и специфичности испытуемого набора реагентов «АмплиТест Influenza A H5/H7/H9/H10» в сравнении с результатами, полученными системой сравнения

Примечание. * — в качестве системы сравнения использовали наборы реагентов «АмплиСенс Influenza virus A/B-FL», «АмплиСенс Influenza virus A-тип-H5, H7, H9-FL» и протокол ВОЗ WHO information for the molecular detection of influenza viruses.

Диагностические характеристики рассчитывали с учетом количества исследованных проб, характеристики с доверительной вероятностью приведены в табл. 3.

Таблица 3. Диагностические характеристики набора реагентов «АмплиТест Influenza A H5/H7/H9/H10»

Примечание. * — расчет диагностических характеристик проведен с использованием ресурса MEDCALC (https://www. medcalc.org/calc/diagnostic_test.php).

Обсуждение

В связи с высоким распространением подтипов вирусов ВПГП в популяции диких и сельскохозяйственных птиц, а также с массовыми случаями заражения и гибели млекопитающих, связанными со эпизоотиями гриппа подтипа H5 в 2021—2024 гг., риск появления генотипов вируса ВПГП, способных вызвать эпидемии с тяжелыми последствиями, сохраняется на высоком уровне.

Отличительной особенностью разработанного диагностикума является возможность выявлять известные опасные и потенциально опасные для человека подтипы вируса гриппа, в том числе подтип H10, для которого в РФ не было ранее разработано средств диагностики.

Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов для амплификации кДНК вируса гриппа А и РНК подтипов H5, H7, H9, H10 был проведен с учетом информации о генетической изменчивости вирусов гриппа с использованием не менее 1500 разнообразных последовательностей из различных источников, опубликованных в базах данных NCBI и GISAID.

Набор укомплектован положительными и отрицательными контрольными образцами для оценки эффективности всех стадий исследования. Внутренний контрольный образец добавляется на этапе экстракции РНК во все исследуемые образцы, что позволяет контролировать прохождение экстракции РНК, обратной транскрипции и амплификации и оценивать влияние потенциальных ингибиторов на результаты ПЦР-исследования. Положительный контрольный образец также исследуется с этапа экстракции нуклеиновых кислот, обеспечивая контроль эффективности амплификации целевых участков РНК вируса гриппа А. Для удобства пользователей и снижения времени исследования реакции обратной транскрипции и ПЦР осуществляются на одном этапе исследований в формате ОТ-ПЦР.

По результатам клинико-лабораторных испытаний разработанного набора реагентов были показаны высокие аналитические и диагностические характеристики. Аналитическая чувствительность, определенная с использованием различных амплификаторов, составила не менее 1·10³ ГЭ/мл РНК вируса гриппа А и целевых подтипов H5, H7, H9, H10 как для мазков со слизистой носоглотки и ротоглотки, так и для мокроты. Диагностическая чувствительность не хуже 86,3%, специфичность не хуже 92,1% с учетом доверительной вероятности 95%.

Заключение

Было разработано изделие для диагностики in vitro вируса гриппа А и идентификации его высокопатогенных и потенциально опасных для человека подтипов. Проведенные клинико-лабораторные испытания показали, что данный набор реагентов соответствует требованиям нормативной, технической и эксплуатационной документации, а также является эффективным и безопасным.

По результатам проведенных испытаний подготовлен пакет документов для подачи в Росздравнадзор с целью регистрации данного медицинского изделия и получения регистрационного удостоверения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.