Диагностическое и прогностическое значение определения белков — маркеров повреждения мозга при легких черепно-мозговых травмах

Подтверждение наличия повреждения клеток ЦНС лабораторными методами не входит в стандарты диагностики черепно-мозговых травм (ЧМТ). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно в мире от ЧМТ страдают 10 млн человек, а погибают до 2 млн человек [1]. Учитывая, что многие пациенты получают легкие ЧМТ и не обращаются за медицинской помощью, реальная цифра может быть значительно выше [2].

Отсутствие инструментов для выявления неврологического или психологического дефицита, который влияет на ежедневное функционирование, оставляет пациентов с легкой ЧМТ практически без вариантов лечения [3—6].

Вследствие гибели клеток головного мозга в сыворотку крови поступают нейротрофические факторы — вещества, основная функция которых заключается в регулировании жизнедеятельности нейронов и глиальных клеток [7, 8]. На данный момент лучше всего изучены нейротрофические факторы, которые схожи друг с другом по химической структуре [9—11]. На основании современных данных, выделяемые тканями поврежденного головного мозга белки могут быть использованы как маркеры [12—14].

Диагностические и прогностические инструменты для стратификации риска у пациентов с легкими ЧМТ ограничены на ранних стадиях после травмы [15, 16]. Несмотря на большое количество опубликованных научных работ, по-прежнему не хватает биомаркеров ЧМТ, одобренных для клинического применения у взрослых и детей [13, 14]. В настоящее время существует острая необходимость в проверке и внедрении биомаркеров клеточного повреждения головного мозга в клиническую практику [16].

Цель исследования — исследовать динамику биомаркеров клеточного повреждения головного мозга для оценки возможности их использования в лабораторной диагностике легких ЧМТ.

На базе Клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «Клиническая больница №1» Управления делами Президента РФ по разрешению Локального этического комитета (Протокол ЛЭК №16 от 03.09.14) проведено проспективное сравнительное исследование пациентов, разделенных по группам наблюдения: пациенты с ЧМТ (основная группа), пациенты после оперативного вмешательства на головном мозге (группа сравнения), здоровые добровольцы без патологии головного мозга (контрольная группа). Для подтверждения роли биомаркеров в развитии ЧМТ проводилось определение концентрации Tau-белка, GFAP и pNF-H в динамике в крови, взятой в день поступления в стационар (1-е взятие), на следующий день (2-е взятие) и на 6—7-й день госпитализации (3-е взятие) — для основной и контрольной групп, а для группы сравнения были выполнены только два взятия крови: в день поступления в стационар (1-е взятие) и на следующий день после операции на головном мозге (2-е взятие).

ИФА проводился с использованием следующего оборудования: планшетный ридер LABSYSTEMS iEMS Reader MF («Thermo Fisher Scientific», Финляндия), инкубатор-шейкер для микропланшетов iEMS («Thermo Fisher Scientific», Финляндия), устройство для промывки микропланшетов PW 40 BioRad (Финляндия). ИФА проводился с использованием следующих тест-систем: набор GFAP ELISA «Набор для определения глиофибриллярного кислого протеина (GFAP) человека методом ИФА» («BioVendor»); набор pNF-H ELISA «Набор для определения фосфорилированных нейрофиламентов человека методом ИФА» («BioVendor»); набор Hu Tau «Иммуноферментный набор для определения человеческого Tau (нативного и рекомбинантного)» («Invitrogen»).

В исследование был включен 121 человек разных полов, из которых 77 составили 1-ю группу, 14 — 2-ю группу и 30 — 3-ю группу. Обобщенные данные представлены в таблице.

Обобщенные данные исследуемых групп

Статистическая обработка результатов проведена с использованием критерия Фишера для двух групп сравнения, с использованием критериев Фридмана и Краскела—Уоллиса — для трех групп. Статистическая значимость была определена при p<0,05. Все статистические расчеты были выполнены с использованием SPSS версии 20.0 и GraphPad Prism версии 5.0 («GraphPad Inc»).

Сравнение полученных результатов средних значений концентрации изучаемых биомаркеров (Tau-, GFAP- и pNF-H-белков), а также их динамики по пробам во всех трех группах сравнения (рис. 1) демонстрирует существенные доказательства роли данных белков в возможности оценки клеточного повреждения мозговой ткани. И при легких ЧМТ, и при травмах, связанных с оперативным вмешательством на ЦНС, отмечается достоверное увеличение концентраций всех трех потенциальных биомаркеров мозгового клеточного повреждения. Однако при анализе динамики концентраций в трех группах сравнения достоверные различия получены только для Tau-белка и pNF-H-белка, что свидетельствует о более стабильном содержании GFAP-белка в крови при травматических повреждениях головного мозга.

Рис. 1. Оценка динамики концентраций Tau-белка по средним их значениям в трех группах сравнения: «здоровые» (3-я группа), ЧМТ (1-я группа) и операции на ЦНС (2-я группа). Стрелкой указаны разнонаправленные тренды динамики концентраций.

Также проведена оценка динамики определяемых биомаркеров клеточного повреждения головного мозга в каждой группе сравнения (рис. 2). Так, в контрольной группе отмечается незначительная динамика низких показателей концентраций Tau-, GFAP- и pNF-H-белков, что подтверждает наличие процессов апоптоза в неповрежденной мозговой ткани.

Рис. 2. Динамика концентраций Tau-, GFAP- и pNF-H-белков по трем взятиям крови (1 — проба 1, 2 — проба 2, 3 — проба 3) в трех группах сравнения: ЧМТ (1-я группа), операция на головном мозге (ГМ) (2-я группа) и «здоровые» (3-я группа).

В основной группе наблюдения отмечается выраженная динамика всех трех изучаемых потенциальных биомаркеров: однонаправленная для Tau- и pNF-H-белков, причем с более резким снижением концентрации Tau-белка; и разнонаправленная для GFAP-белка с повышением концентрации во 2-й пробе и снижением в 3-й пробе.

В группе сравнения (пациенты с оперативными вмешательствами на головном мозге) по причине только двух измерений исследуемых потенциальных биомаркеров выявлено однонаправленное повышение концентраций всех изучаемых белков клеточного повреждения мозга, причем более выраженное для pNF-H- и GFAP-белков и менее выраженное для Tau-белка.

По результатам проведенного многофакторного анализа, не выявлено достоверных различий по ряду клинико-диагностических параметров в зависимости от групп сравнения и клинических исходов: влиянию пола, наличию патологии на ЭКГ и МРТ. Однако по параметрам наличия или отсутствия патологии на КТ головного мозга в группах сравнения и по клиническим исходам обнаружены достоверные различия (p=0,000048 и p=0,011 соответственно).

Так, по данным литературы, КТ как инструментальный метод диагностики, предназначенный для визуализации повреждений головного мозга, в достаточной степени имеет субъективный характер, так как зависит от квалификации и опыта врача, проводящего и дающего заключение по исследованию [18]. В нашем исследовании проведение КТ головного мозга при легких ЧМТ (основная группа) выявило патологию только в 30,4% случаев в отличие от пациентов с оперативными вмешательствами (группа сравнения), у которых закономерно патология отмечалась в 100% случаев, что подтверждает существующие в реальной клинической практике сложности диагностики и объективизации легких ЧМТ.

При анализе КТ головного мозга в зависимости от клинических исходов патология нами была выявлена только в 36,4% случаев при благоприятном исходе и в 100% случаев летального исхода. Это косвенно свидетельствует о более точной диагностике при КТ у пациентов с признаками клеточного повреждения головного мозга более тяжелого течения заболевания, однако по причине малочисленности группы с летальным исходом (n=4) утверждать данный факт не представляется возможным.

При сопоставлении полученных данных с анализом средней концентрации исследуемых биомаркеров в зависимости от клинических исходов обнаружило достоверное преобладание концентраций Tau-, GFAP- и pNF-H-белков в группе летального исхода (p<0,05), что свидетельствует о более высоких уровнях концентрации данных биомаркеров у пациентов с признаками клеточного повреждения головного мозга (основная группа и группа сравнения) более тяжелого течения ЧМТ. По разности концентраций между пробами также были получены достоверные различия (p<0,05) по всем разностям концентраций между пробами (2-й и 1-й, 3-й и 1-й, 3-й и 2-й), что подтверждает данное предположение.

Далее был определен диапазон концентраций при первичном измерении (в день получения травмы) Tau-, GFAP- и pNF-H-белков по квартилям для диагностики легких ЧМТ: Q1—Q2—3 по TAU-белку (9,24—78,07 нг/мл), GFAP (7,17—51,03 нг/мл) и pNF-H-белку (19,03—64,88 нг/мл). Увеличение концентрации в диапазоне Q4 свидетельствует о более тяжелой степени ЧМТ и риске неблагоприятного исхода: по Tau-белку (>78,07 нг/мл), GFAP (>51,03 нг/мл) и pNF-белку (>64,88 нг/мл).

В результате проведенного анализа обнаружено, что Q2—3 имеет максимальную распространенность среди пациентов основной группы по всем трем изучаемым биомаркерам: Tau-белку — в 50,65% случаев (кроме Tau3 — 48,05%), GFAP-белку — в 50,65% и pNF-H-белку — в 50,65%. А распространенность квартилей Q1 и Q4 заметно снижается и составляет по всем биомаркерам 24,68%, за исключением Tau3, у которого Q1 встречался несколько чаще — в 27,27% случаев. Таким образом, легкие ЧМТ лежат в диапазоне концентраций Q1—Q2—3 всех трех исследованных биомаркеров.

Результаты сравнения непараметрических данных КТ при оценке биомаркера GFAP2 в зависимости от уровня его концентрации в крови (p=0,019) подтверждают предположение о том, что более высокие концентрации данного биомаркера чаще коррелируют с наличием подтвержденной патологии при нейровизуализации на КТ, а чем меньше уровень концентрации белка GFAP2, тем чаще отсутствует подтверждение патологии на КТ. Схожие достоверные результаты были получены при сравнении непараметрических данных КТ при оценке биомаркера GFAP3 в зависимости от уровня его концентрации в крови (p=0,021).

При анализе концентрации Tau2 были выявлены достоверные различия при сравнении двух клинических исходов (p=0,009). При исходе с улучшением доминировали концентрации данного белка в Q1 и Q2—3 в 100% случаев и несколько меньше в Q4 — в 84,2%, тогда как при летальном исходе только в Q4 выявлено 15,8% случаев. Аналогичная картина обнаружена при анализе концентрации Tau3, GFAP3, pNF1 и pNF2, где также были получены достоверные различия (p=0,009) со схожими процентными показателями, что подтверждает тенденцию выявления более высоких концентраций потенциальных белков клеточного повреждения головного мозга при более тяжелых ЧМТ, однако из-за малочисленности выборки требует дальнейшего изучения.

1. Доказано, что у пациентов с легкой ЧМТ (основная группа) достоверно преобладали повышенные значения всех трех изучаемых биомаркеров (Tau, GFAP и pNF-H в динамике) (p<0,0001) в сравнении с группой пациентов без клеточного повреждения головного мозга (контрольная).

2. Обнаружено, что при легких ЧМТ (основная группа) наблюдается постепенное снижение уровня повышеных значений концентрации всех изучаемых биомаркеров, более выраженное для Tau-белка, в меньшей степени для pNF-H-белка и практически не выраженное для GFAP-белка, по сравнению с группой пациентов без клеточного повреждения головного мозга (контрольная).

3. Выявлена достоверная разнонаправленная динамика двух изучаемых биомаркеров при сравнении средних концентраций в группах с ЧМТ и операциях на головном мозге (основная группа и группа сравнения), что подтверждает роль травмы в повышении концентрации исследованных белков:

a. Tau1 ЧМТ>Tau1 операции на головном мозге, Tau2 ЧМТp<0,05);

b. pNF-H1 ЧМТ=pNF-H1 операции на головном мозге, pNF-H2 ЧМТp<0,05).

4. Обнаружено, что определение концентрации Tau-, GFAP- и pNF-H-белков улучшает диагностику легких ЧМТ в качестве биомаркеров клеточного повреждения головного мозга независимо от результатов КТ. Однако в динамике (до 7 сут наблюдения в стационаре) могут оцениваться только два биомаркера: Tau- и pNF-H-белки, так как концентрация GFAP-белка за данный период снижается незначительно.

5. Определен диапазон концентраций при первичном измерении (в день госпитализации) Tau-, GFAP- и pNF-H-белков по квартилям для диагностики легких ЧМТ: Q1—Q2—3 по Tau-белку (9,24—78,07 нг/мл), GFAP- (7,17—51,03 нг/мл) и pNF-H (19,03—64,88 нг/мл) белкам. Увеличение концентрации в диапазоне Q4 свидетельствует о более тяжелой степени ЧМТ и риске неблагоприятного исхода: по Tau-белку (>78,07 нг/мл), GFAP- (>51,03 нг/мл) и pNF- (>64,88 нг/мл) белкам.

6. Доказано, что старший возраст является фактором, отягощающим течение ЧМТ, так как способствует достоверному повышению концентрации биомаркеров клеточного повреждения головного мозга в крови (p<0,05).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.