Улучшение ранней диагностики и совершенствование методов терапии рака молочной железы (РМЖ), в том числе создание и успешное применение специфических молекулярно-направленных («таргетных») препаратов, существенно повысили эффективность лечения этого тяжелого и социально значимого заболевания. Однако проведение как неоадъювантной, так и адъювантной системной и местной терапии не безразлично для больной и показания к ее применению должны быть четко определены. Современный уровень знаний о молекулярных механизмах возникновения и развития опухолей, их чувствительности или резистентности к различным препаратам уже позволяет осуществить переход от усредненных стандартных схем к так называемой «персонализированной медицине», т.е. назначению лечения в соответствии с индивидуальными особенностями больного и биологическими характеристиками опухоли.

Стандартными факторами, позволяющими прогнозировать клиническое течение РМЖ, до сих пор остаются такие параметры, как размер опухоли, поражение периферических лимфатических коллекторов, гистологическая форма, степень злокачественности. Важными этапами на пути к персонализированному лечению РМЖ стало внедрение в клиническую практику исследования статуса рецепторов стероидных гормонов (рецепторов эстрогенов - РЭ и рецепторов прогестерона - РП) для определения показаний к назначению эндокринной терапии в 1970-х годах и обязательная оценка экспрессии мембранного рецептора HER2/neu или амплификации его гена при решении вопроса о применении герцептина, вошедшая в практику вместе с внедрением этого первого таргетного препарата для лечения РМЖ в конце ХХ века. Тем не менее остается еще очень много нерешенных вопросов в этой области науки и практики, в связи с чем в последнее время возрастает роль поиска и клинического изучения значимости новых биологических маркеров для определения тактики лекарственной терапии РМЖ и прогноза ее эффективности [1, 2].

По данным экспериментальных исследований, одним из перспективных молекулярных маркеров РМЖ считают полифункциональный ядерный транскрипционный фактор NF-κB, который играет важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, регулируя экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [3]. NF-κB представляет собой гетеродимерный комплекс белков, которые в большинстве покоящихся клеток неактивны и находятся в цитоплазме в комплексе со специфическими ингибиторами - IκB. Идентифицировано 5 белков семейства NF-κB, содержащих общий ДНК-связывающий домен: NF-κB1 (p50/p105), NF-κB2 (p52/p100), RelA (NF-κBp65), RelB и c-Rel. Основной формой существования этих белков в большинстве клеток млекопитающих является гетеродимер p50/RelA (p65) [4, 5].

При поступлении в клетку активирующего сигнала происходит фосфорилирование ингибиторного белка IκB специфическими киназами (IKK) [6], а затем его убиквитинация и полная деградация в протеасомах, в результате чего свободный и активный NF-κB поступает в ядро. В качестве активирующих агентов выступают, как правило, различные факторы роста (например, эпидермальный или α-трансформирующий), цитокины (в первую очередь, семейства фактора некроза опухолей), бактериальные токсины и вирусные агенты, а также такие внешние пронекротические факторы, как гамма- и УФ-облучение, кислородные радикалы [7, 8]. Существует еще один уровень регуляции транскрипционной активности NF-κB - фосфорилирование его собственных субъединиц, влияющее на его трансактиваторную функцию. Одним из ключевых вышележащих эффекторных механизмов, активирующих NF-κB, является PI3K/Akt-сигнальный путь [9, 10]. Его основные компоненты: фосфатидилинозитол-3 киназа (PI3K), фосфорилирующая инозитольное кольцо в положении D-3, а также серин/треониновая протеинкиназа В (Akt). Активность NF-κB может модулироваться также с участием другой важнейшей сигнальной системы - онкогена Ras и нижележащего каскада митогенактивируемых протеинкиназ.

Регуляция NF-κB-сигнального пути нарушена во многих опухолях человека, в том числе и при РМЖ [4, 5]. В большинстве опухолевых клеток NF-κB постоянно активирован и находится в ядре. эта активация не только предотвращает апоптоз клеток, но также увеличивает их пролиферативную активность, инвазивный, метастатический и ангиогенный потенциал [7, 9, 11]. Особенно велико значение транскрипционного фактора NF-κB в опухолях молочной железы, отрицательных по РЭ, но имеющих рецепторы эпидермального фактора роста (РЭФР) или HER2/neu [12].

В экспериментальных исследованиях показано, что гиперактивация NF-κB является одной из причин резистентности РМЖ к антиэстрогенам [7, 13-15], химиопрепаратам [16-18] и лучевой терапии [19, 20]. Клинически значимым эффектом NF-κB может оказаться и его способность стимулировать образование остеолитических метастазов РМЖ в костях. В опытах in vivo продемонстрировано [21], что конститутивная активация NF-κB играет решающую роль в реализации остеолитической активности клеток РМЖ, индуцируя синтез гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). В этой же работе продемонстрирована корреляционная взаимосвязь между степенью активации NF-κB и уровнем экспрессии GM-CSF в метастатических очагах поражения костей у больных РМЖ [21]. Предполагается, что создание противоопухолевых агентов, блокирующих NF-κB-сигнальный путь, позволит повысить чувствительность клеток РМЖ к существующим видам терапии, а также может иметь самостоятельное терапевтическое значение, в том числе и для предотвращения метастазирования в кости [7, 19, 21-23].

Возможные подходы к преодолению NF-κB-опосредованной резистентности к противоопухолевой терапии суммированы в нескольких обзорах [7, 24-29]. В настоящее время известно несколько десятков экзогенных и эндогенных агентов, способных подавить активность NF-κB. Основным недостатком большинства из них является низкая специфичность. Некоторые из блокаторов NF-κB-сигнального пути обозначены на схеме (см. рисунок),

К числу наиболее перспективных и специфичных препаратов относятся ингибитор протеасом бортезомиб, который уже используется в лечении множественной миеломы [30], и ингибитор IkB-активирующей киназы партенолид [31, 32], обладающие значительной специфичностью по отношению к NF-κB и подавляющие его активацию, предотвращая деградацию IαB (бортезомиб) или подавляя его активацию (партенолид).

Большинство доказательств определяющего значения NF-κB и вышележащих сигнальных белков при РМЖ получено в экспериментальных исследованиях, а данные об экспрессии этого фактора и его регуляторов в опухолях человека, полученные на клиническом материале, единичны, выполнены с использованием различных методических подходов и требуют дальнейшего подтверждения. Так, в работе [33] при исследовании опухолей 81 больной ранним РЭ(+) РМЖ впервые был использован количественный иммуноферментный метод оценки ДНК-связывающей активности р50 и р65 субъединиц NF-κB. Пациентки были разделены на две подгруппы: группа А с высоким (более 100 фмоль на 1 мг белка) и группа Б с относительно низким (21-87 фмоль на 1 мг белка) содержанием РЭ в опухоли. ДНК-связывающая активность обеих субъединиц NF-κB в опухолях больных группы Б оказалась достоверно выше, чем в опухолях больных группы А. У 59 больных группы Б, получавших адъювантно тамоксифен по одной и той же схеме, оценили взаимосвязь активности NF-κB и безрецидивной/безметастатической выживаемости [33]. ДНК-связывающая активность обеих субъединиц в опухолях 13 больных, у которых за 80 мес наблюдения произошло прогрессирование заболевания, была достоверно выше, чем в опухолях больных, наблюдавшихся весь этот период без признаков возврата болезни. Авторы предложили стратифицировать РЭ(+) больных РМЖ с относительно низким содержанием рецепторов в опухоли на чувствительных и нечувствительных к тамоксифену на основании показателей ДНК-связывающей активности NF-κB. При этом более значимые различия были получены в результате стратификации на основании активности р50 субъединицы.

Цель исследований, проводившихся в лаборатории клинической биохимии ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН в 2008-2010 гг., - сравнительная оценка уровня экспрессии (общего содержания) и/или активности ключевых белков семейства NF-κB - p65 и p50, их регуляторов IκB и Akt1 в опухолях и окружающих гистологически неизмененных тканях молочной железы, а также анализ взаимосвязи этих показателей с рецепторным статусом опухоли и основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания для выявления клинически значимых показателей и подгрупп пациентов, потенциально чувствительных к ингибиторам NF-κB [34-37].

В исследование вошли 119 больных РМЖ. Больных распределили по стадиям заболевания:

IIA - 37, IIB - 28, по 20 больных I и IIIA стадии и у 14 больных был распространенный процесс IIIB-IIIC стадии. По гистологическому строению 95 опухолей представляли собой протоковый инфильтративный рак, 14 - дольковый инфильтративный рак, другие типы РМЖ представлены единичными наблюдениями. Большинство опухолей (84) имели II, 28 - III, и 7 - I степень злокачественности. Во всех опухолях иммуногистохимическим методом определен статус РЭ, РП и HER2/neu.

Суммарное содержание NF-κBp65 в полученных ядерно-цитоплазматических экстрактах тканей определяли с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа NF-κBр65 (Total). ДНК-связывающую активность NF-κBp65 и NF-κBp50 измеряли, используя наборы TransAM NF-κBр65 и TransAM NF-κBр50 (США). Принцип этого метода количественного измерения ДНК-связывающей активности заключается в следующем: активированный (свободный) NF-κBp65 или NF-κBp50 специфически связывается с иммобилизованным на 96-луночной планшете олигонуклеотидом, содержащим консесусную последовательность 5’-GGGACTTTCC-3’, после чего проводится стандартное прямое иммуноферментное определение количества связавшегося белка с использованием специфических антител к p65 или p50 соответственно. Определение суммарной и активированной (фосфорилированной) Akt1, а также суммарного и активированного (фосфорилированного) IκB альфа (IκBα) проводили с помощью наборов для прямого иммуноферментного анализа компании «Cell Signaling technology» (США): PathScan Total Akt1 Sandwich ELISA Kit, PathScan Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA Kit, PathScan Total IκBalpha Sandwich ELISA Kit и PathScan Phospho-IκBalpha (Ser32) Sandwich ELISA Kit.

Во всех опухолях обнаружены измеримые количества NF-κBp65, Akt1 и IκBα (табл. 1).

У 84% больных РМЖ содержание NF-κBp65 в опухоли было достоверно выше, чем в окружающей неизмененной ткани; содержание Akt1 было повышено в 88%, а содержание IκBα - в 95% опухолей (во всех случаях p<0,0001). ДНК-связывающая активность NF-κBp65 выявлена в 98% опухолей и достоверно повышена по сравнению с окружающей тканью у 95% больных (p<0,0001). В 97% опухолей выявлена также повышенная ДНК-связывающая активность NF-κBp50. Отмечена высоко достоверная положительная корреляция ДНК-связывающих активностей NF-κBp65 и p50 в опухоли (R=0,88; p<0,0001), при этом активность р50 превышала активность р65 в 10-570 раз (медиана - 77 раз), что согласуется с результатами [33]. Эти показатели коррелировали также с содержанием IκBα и Akt1, а активность NF-κBp50 - с содержанием phospho-Akt1, повышенным только в 37% опухолей.

Достоверной взаимосвязи с такими клинико-морфологическими факторами, как стадия заболевания, размер (индекс Т), гистологическое строение и степень злокачественности РМЖ, степень поражения лимфатических узлов (индекс N) ни для одного из исследованных показателей не обнаружено.

Учитывая роль активации Akt и NF-κB-сигнального пути в регуляции гормональной и лекарственной чувствительности РМЖ, особое внимание было уделено оценке взаимосвязи изучаемых показателей с рецепторным статусом опухоли (табл. 2).

Достоверных различий в зависимости от статуса рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu для большинства показателей не обнаружено, что может быть связано с преобладанием в обследованной группе РЭ(+)HER2(–) опухолей (78,5%) и незначительным числом всех остальных подгрупп. Но можно отметить тенденцию к увеличению содержания и ДНК-связывающей активности NF-κBp65 и уровня phospho-Akt1 в РЭ(–) опухолях по сравнению с РЭ(+). Наблюдали достоверное увеличение содержания общего белка NF-κBp65 (p<0,01), а также снижение его удельной активности (p<0,05) в HER2(+) опухолях по сравнению с HER2(–).

Таким образом, по данным настоящего исследования, более чем в 90% опухолей больных РМЖ координированно увеличивается ДНК-связывающая активность NF-κBp50 и p65, а также содержание NF-κBp65, IκBα и протеинкиназы Akt1. Удельная ДНК-связывающая активность NF-κBp65 наиболее высока в опухолях с «тройным отрицательным» рецепторным статусом [РЭ(–)РП(–)HER2/neu(–)], не поддающихся ни эндокринной, ни молекулярно-направленной терапии, поэтому именно эта подгруппа больных РМЖ может получить преимущество от использования селективных ингибиторов NF-κB.

Следует отметить, что ранее мы уже провели два небольших исследования роли двух вышележащих эффекторов NF-κB при РМЖ человека на разных, хотя и сравнимых по клиническим характеристикам группах больных. В одном из них методом иммуноблоттинга была оценена экспрессия регуляторной p85 субъединицы PI3K [38, 39]. В другом - оценена экспрессия phospho-Akt1 в опухолях и прилежащих гистологически неизмененных тканях больных РМЖ [39 - 41]. Оказалось, что активность этих двух компонентов одного сигнального каскада изменяется при малигнизации клеток молочной железы по-разному: в то время как экспрессия PI3K была увеличена в опухолях 79% больных и не зависела от основных клинико-морфологических факторов, включая статус рецепторов стероидных гормонов, Akt1 была активирована только в 49% опухолей, и частота ее активации положительно коррелировала с их размером и степенью злокачественности, а также была выше в РЭ(+) РМЖ, чем в РЭ(–).

Обобщая результаты этих трех исследований, мы пришли к выводу, что, несмотря на кооперированную роль PI3K/Akt в активации NF-κB, а также их участие в регуляции роста и выживаемости опухолевых клеток в целом, влияние этих сигнальных белков на клиническое течение и лекарственную чувствительность РМЖ может значительно различаться. Отсутствие четкой взаимосвязи экспрессии и активности ключевых субъединиц NF-κB и его регуляторов с большинством клинически значимых прогностических факторов наряду со значительным и практически универсальным увеличением этих показателей в ткани РМЖ по сравнению с окружающей неизмененной молочной железой свидетельствует о том, что при дальнейшем наблюдении за обследованными больными данные биомаркеры смогут приобрести значение в качестве независимых критериев, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения.

Выше мы уже цитировали работу [33], в которой продемонстрирована возможность стратификации РЭ(+) больных РМЖ на чувствительных и резистентных к тамоксифену, основываясь на показателях ДНК-связывающей активности NF-κB. Кроме того, прогностическое значение активированного NF-κB у РЭ(+) больных РМЖ с метастазами в лимфатических узлах продемонстрировали также С. Liu и соавт. [42], используя иммуногистохимический метод оценки экспрессии данного белка. При обследовании 130 больных ими обнаружено достоверное уменьшение безрецидивной и общей выживаемости при высокой экспрессией активированного NF-κB в опухоли, подтвержденное данными многофакторного анализа. Одновременно была исследована экспрессия других сигнальных белков: phospho-Akt, фосфорилированного транскрипционного фактора STAT3, РЭФР, HER2/neu, фосфатазы PTEN, белка Ki67. Продемонстрирована положительная корреляционная взаимосвязь между уровнями экспрессии NF-κB и phospho-Akt. Оба эти показателя, в свою очередь, коррелировали с гиперэкспрессией HER2/neu и степенью злокачественности РМЖ. На основании этих результатов авторы предположили, что активация phospho-Akt/NF-κB-сигнального пути ухудшает прогноз РЭ(+) РМЖ c метастазами в лимфатических узлах. К сожалению, недостаточно продолжительный период наблюдения за нашими проспективно обследованными больными не позволяет пока ни подтвердить, ни опровергнуть эти выводы.

Наиболее перспективными в настоящее время представляются комплексные исследования с использованием современных высокотехнологичных методов, позволяющих одновременно оценивать достаточно большой спектр взаимосвязанных и взаиморегулируемых показателей. Уже опубликованы результаты двух подобных исследований. Так, в работе [15] был использован метод микрочипов для определения уровня экспрессии комплекса генов, регулируемых NF-κB и транскрипционным фактором АР-1. Обследованы 4 группы больных РМЖ без метастазов в лимфатических узлах с РЭ(+) опухолями (262 пациентки), лечившихся в разных медицинских центрах и получавших адъювантно тамоксифен в различных режимах. Выявлено три NF-κB/АР-1-активируемых гена - циклин D1, uPA и VEGF, с помощью которых можно разделить больных РЭ(+) РМЖ без метастазов в лимфатических узлах на подгруппы с более ранним и более поздним прогрессированием на фоне тамоксифена, независимо от режима приема препарата. Наиболее значимыми различия были в группе молодых больных. Таким образом, оценка экспрессии этих генов, наряду с оценкой уровня активации самих транскрипционных факторов, может оказаться полезной для выявления группы больных, резистентных к тамоксифену, несмотря на положительный рецепторный статус опухоли. Сравнивая активность

NF-κB-сигнального пути в отечно-инфильтративном и типичном РМЖ с помощью определения «генных подписей» опухолей методом количественной полимеразной цепной реакции, S.van Laere и соавт. [43] изучали несколько «подписей»: набор генов, характеризующих активность РЭ, набор генов, характеризующих активность МАП-киназного сигнального пути, группу из 8 генов, активируемых NF-κB, а также смешанную «подпись», объединяющую РЭ- и NF-κB-регулируемые гены. Оказалось, что экспрессия большинства РЭ-модулируемых генов значительно увеличена в опухолях с транскрипционно неактивированным NF-κB. Более того, наблюдали отрицательную корреляцию между уровнями экспрессии РЭ-активируемых и NF-κB-активируемых генов, что подтверждает обратное соотношение между активностью РЭ- и NF-κB-сигнальных путей. Отечно-инфильтративные варианты рака характеризовались низкой экспрессией РЭ-зависимых генов и высокой экспрессией NF-κB-активируемых генов. В опухолях с таким фенотипом (как инфильтративных, так и неинфильтративных) выявлена также гиперэкспрессия РЭФР и/или HER2. Авторы полагают, что именно повышенная экспрессия этих рецепторных белков приводит к активации NF-κB и подавлению активности РЭ.

Таким образом, результаты собственного исследования экспрессии и активности ключевых субъединиц ядерного транскрипционного фактора NF-κB, его ингибитора IκBα и вышележащей эффекторной протеинкиназы Akt1 в опухолях больных РМЖ, а также анализ современных публикаций, посвященных роли NF-κB и связанных с ним сигнальных белков в формировании гормональной и лекарственной резистентности РМЖ, свидетельствуют о перспективности использования этих показателей для выявления гормонорезистентной подгруппы среди больных рецепторположительным РМЖ. Дальнейшего клинического изучения требует вопрос о роли этих показателей в оценке и преодолении химио- и радиорезистентности РМЖ, а также в определении показаний к клиническому применению модуляторов активности NF-κB.