Введение
Сифилис, системная хроническая инфекция, вызываемая T. pallidum, занимает в настоящее время одно из ведущих мест в структуре заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации [1, 2]. Возникающие при данной инфекции системные поражения, а также осложненные, тяжелые формы, например такие как нейросифилис (НС), вызывают пристальный интерес исследователей во всем мире.
В начале 2000-х годов в России отмечен значительный подъем заболеваемости НС [3–7]. Анализ причин такого явления установил несколько факторов. Отголоски эпидемии сифилиса в 1990-х годах и связанное с этим отсутствие адекватной диагностики и, соответственно, эффективной терапии. Кроме того, выяснилось, что во многих случаях диагноз НС выставляется без тщательного лабораторного исследования, в частности не везде проводилась ликвородиагностика, обязательная при подозрении на НС. К этому следует добавить отсутствие в ряде случаев специфических симптомов заболевания, свидетельствующих о наличии тех или иных поражений центральной и/или вегетативной нервной системы.
Вышедшие в связи с этим приказы Минздрава России, Департамента здравоохранения города Москвы, Минздрава Московской области и другие методические документы в определенной мере способствовали повышению качества клинической лабораторной диагностики и, соответственно, некоторому снижению уровня заболеваемости НС [8–11]. Вместе с тем кардинально решить проблему не удалось, а обследование и ведение больных НС по-прежнему представляет собой весьма сложную научно-прикладную задачу.
Цель исследования — сравнительная оценка эффективности двух современных подходов к лабораторной диагностике НС: путем определения ITPA-индекса1, или сывороточно-ликворного соотношения, и многомерного дискриминантного анализа (МДА)2.
Материал и методы
Проведено сравнительное исследование диагностической эффективности двух современных методологий, ранее не применявшихся для лабораторной диагностики НС в Российской Федерации: определения ITPA-индекса (Intrathecal T. pallidum assay index), или сывороточно-ликворного соотношения, и МДА.
Диагноз нейросифилиса устанавливали на основании данных клинической картины заболевания и результатов лабораторных исследований (серологические реакции сыворотки крови на сифилис, исследование ликвора на содержание белка, определение цитоза, иммунологические тесты в ликворе — РМП, VDRL, РПГА, РИБТ, ИФА, РИФц, а также, что не осуществлялось ранее, определение антител к рекомбинантным белкам бледной трепонемы — Tp17, Tp15, Tp47, TmpA в формате иммуночипа3).
В общем от пациентов с НС получено 65 парных биопроб (сыворотка и ликвор), в том числе 43 биопробы от пациентов с асимптомным НС (АНС) и 22 биопробы от пациентов с НС с симптомами (НСС). Возраст пациентов варьировал от 37 до 75 лет.
Методология определения ITPA-индекса предусматривает исследование титра IgG в ликворе и сыворотке крови. Подсчет производится с помощью компьютера или в «ручном» режиме по следующей формуле:
,
где ЦСЖ — цереброспинальная жидкость (ликвор).
При получении результата, свидетельствующего об идентичности соотношения антительного ответа в ликворе и в крови (то есть если антитела в ЦНС не синтезируются, а присутствие в ликворе трепонемоспецифических IgG является следствием их пассивного переноса из крови) указанный индекс колеблется в пределах 0,5—1,0 и, соответственно, диагноз НС не подтверждается. При индексе, равном 2,0 и более, состояние пациента расценивают как НС и назначают адекватную терапию. Значение ITPA-индекса 3,0 и более с уверенностью свидетельствует об интратекальном синтезе специфических антител к T. pallidum и специфическом поражении нервной системы.
Суть применения метода МДА, впервые использованного для диагностики НС в МНПЦ дерматовенерологии и косметологии в ходе выполнения НИР «Современные методы профилактики, диагностики, лечения инфекций, передаваемых половым путем», заключается в определении цифровых значений двух дискриминантных функций (ДФ) на основании полученных у каждого конкретного пациента результатов 12 лабораторных исследований ликвора: РМП (от + до 4+), VDRL (от + до 4+), РПГА (от + до 4+), РИБТ (в %), ИФА (от + до 4+), РИФц (от + до 4+), цитоз (в 106/л), белок (в г/л), Тр15 (в усл. ед.), Тр17 (в усл. ед.), Тр47 (в усл. ед.), TmpA (в усл. ед.).
Полученные цифровые значения вводят в разработанные ранее формулы для вычисления двух ДФ, полученных на основании определения линейных классификационных коэффициентов: у больных сифилисом со специфическим поражением нервной системы (с НС) (ДФ1) и у больных сифилисом без НС (ДФ2) [17]:
ДФ1 = –13,682–0,735×РМП+0,035×VDRL+ 0,941×РПГА–0,011×РИБТ+0,445×ИФА+ 3,304×РИФц–0,201×цитоз+20,022×белок+ 0,003×Тр15+0,000×Тр17+0,001×Тр47– 0,008×TmpA;
ДФ2 = –5,741+0,114×РМП–0,348×VDRL+ 0,653×РПГА+0,013×РИБТ–1,185×ИФА+ 0,124×РИФц–0,186×цитоз+22,242×белок+ 0,002×Тр15+0,001×Тр17+ 0,000×Тр47– 0,005×TmpA.
При ДФ1>ДФ2 у больного сифилисом диагностируется НС, а при ДФ2 >ДФ1 диагноз НС не подтверждается.
Расчет показателей МДА осуществляли с использованием пакета программ Statistica 9.0.
Результаты
Исследования парных биопроб пациентов с использованием методологии определения сывороточно-ликворного соотношения показали следующее.
ITPA-индекс оказался положительным (>2,0) у 42 (97,7%) из 43 больных АНС и у 20 (90,9%) из 22 больных НСС. Всего положительных результатов ITPA-индекса оказалось 62. Таким образом, общая чувствительность метода составила 95,4%. При этом значения ITPA-индекса в пробах пациентов с НС варьировали в интервале 1,88–46,153.
Результаты применения МДА на основании разработанного ранее способа диагностики НС [17] показали положительные результаты у 43 (100%) больных АНС и у 21 (95,5%) больного НСС. Общая чувствительность метода составила 98,5% (64 из 65 пациентов).
Поскольку МДА до настоящего времени для диагностики сифилиса не применяли, приводим два клинических примера использования данного метода на практике.
Пример 1. Пациент К., мужчина, 46 лет, предъявлял жалобы на головные боли, головокружение, нарушение памяти, эмоциональную неустойчивость и снижение работоспособности, обратился в поликлинику по месту жительства, где при скрининге выявлены положительные серологические реакции на сифилис. Из анамнеза жизни: не женат, последний половой контакт 2 года назад со случайной половой партнершей. Сифилис в анамнезе отрицает.
Серологическое исследование сыворотки крови на сифилис: РМП 4+, VDRL 4+, РПГА 4+, РИБТ 65%, ИФА 4+ (КП 15), Tp15 109 усл. ед., Tp17 45 усл. ед., Tp47 110 усл. ед., TmpA 143 усл. ед.
Пациенту проведена диагностическая люмбальная пункция с целью исключения сифилитического поражения нервной системы. Результаты исследования ЦСЖ: РМП 3+, VDRL 4+, РПГА 4+, РИБТ 52%, ИФА 4+ (КП 15), РИФц 4+, цитоз 5·106/л, белок 0,42 г/л; результат определения антител к рекомбинантным белкам T. pallidum в формате иммуночипа: Tp15 81 усл. ед., Tp17 63 усл. ед., Tp47 144 усл. ед., TmpA 213 усл. ед.
На основании данных анамнеза, жалоб, осмотра и результатов обследования пациенту установлен диагноз: А51.4. Другие формы вторичного сифилиса: ранний церебральный менинговаскулярный НС.
Произведен расчет дискриминантных функций:
ДФ1 = –0,735×3+0,035×4+0,941×4–0,011×52+ 0,445×15+3,304×4–0,201×5+20,022×0,42+0,003×81+ 0,000×63+0,001×144–0,008×213–13,682 = –2,205+ 0,14+3,764–0,572+6,675+13,216–1,005+8,409+ 0,243+0+0,144–1,704–13,682 = 13,423;
ДФ2 = 0,114×3 – 0,348×4 + 0,653×4 + 0,013×52 – 0,185×15+0,124×4–0,186×5+22,242×0,42+ 0,002×81+0,001×63+0,000×144–0,005×213– 5,741 = 0,342–1,392+2,612+0,676–2,775+0,496 – 0,93+9,34+0,162+0,063–1,065–5,741 = 1,788.
Получено: ДФ1 (13,423) > ДФ2 (1,788).
В данном случае у пациента с сифилисом и с наличием неврологической симптоматики, но с дискордантными результатами исследования ЦСЖ: отрицательные значения цитоза — 5·106/л (при норме более 5·106/л) и белка — 0,42 г/л (при норме до 0,5 г/л); положительные значения нетрепонемных и трепонемных тестов, положительные результаты (при норме до 5 усл. ед.) определения антител к рекомбинантным белкам T. pallidum в формате иммуночипа (Tp15 81 усл. ед., Tp17 63 усл. ед., Tp47 144 усл. ед., TmpA 213 усл. ед.), наибольшая величина среди двух ДФ была получена для ДФ1.
Таким образом, на основании данных МДА у пациента подтверждено сифилитическое поражение нервной системы, что совпадает с клиническим диагнозом.
Пример 2. Пациент С., мужчина, 27 лет, предъявлял жалобы на появление высыпаний папулезного характера на ладонях и подошвах, мокнущие папулы в перианальной области. Объективно: лейкодерма, очаги выпадения волос на волосистой части головы. Из анамнеза: половая связь с женщиной, у которой выявлен сифилис полгода назад.
При исследовании райц-серума с эрозивных папул перианальной области методом темнопольной микроскопии обнаружена T. pallidum. При серологическом исследовании сыворотки крови выявлены положительные тесты на сифилис: РМП 4+, VDRL 4+, РПГА 4+, РИБТ 60%, ИФА 4+ (КП 15), РИФ 200/абс. 3+/3+, Tp15 1,54 усл. ед., Tp17 1,58 усл. ед., Tp47 3,48 усл. ед., TmpA 1,47 усл. ед.
На основании данных клинико-серологического обследования пациенту установлен диагноз: А51.3. Вторичный сифилис кожи и слизистых оболочек.
С целью исключения специфического поражения нервной системы пациенту проведены люмбальная пункция и исследование ЦСЖ. Результаты исследования ЦСЖ: РМП отр., VDRL отр., РПГА 2, РИБТ 0%, ИФА 3 (КП 5), РИФц отр., цитоз 3·106/л, белок 0,34 г/л, Tp15 0,16 усл. ед., Tp17 2,35 усл. ед., Tp47 2,09 усл. ед., TmpA 0,1 усл. ед.
Произведен расчет дискриминантных функций:
ДФ1 =–0,735×0+0,035×0+0,941×2– 0,011×0+0,445×3+3,304×0–0,201×3+ 20,022×0,34+0,003×0,16+0,000×2,35+0,001×2,09– 0,008×0,1–13,682 = –4,25939;
ДФ2 = 0,114×0–0,348×0+0,653×2+ 0,013×0–0,185×3+0,124×0–0,186×3+ 22,242×0,34+0,002×0,16+0,001×2,35+0,000×2,09– 0,005×0,1–5,741 = 2,01645.
Получено: ДФ1 (–4,25939) < ДФ2 (2,01645).
В данном случае у пациента с сифилисом и дискордантными результатами исследования ЦСЖ: отрицательные значения нетрепонемных тестов — РМП отр., VDRL отр., отрицательные результаты трепонемных тестов — РИБТ, РИФц, отрицательные значения цитоза — 3·106/л (при норме более 5·106/л) и белка — 0,34 г/л (при норме до 0,5 г/л), положительные результаты РПГА, ИФА, отрицательные результаты определения антител к рекомбинантным белкам T. pallidum в формате иммуночипа (Tp15 0,16 усл. ед., Tp17 2,35 усл. ед., Tp47 2,09 усл. ед., TmpA 0,1 усл. ед. при норме до 5 усл. ед.), наибольшая величина среди двух ДФ получена для ДФ2. На основании данных МДА НС у пациента с сифилисом исключен.
Результаты клинической апробации методов определения ITPA-индекса и МДА и получение высоких показателей их диагностической чувствительности послужили основанием для проведения сравнительного анализа двух методологий (см. таблицу).
Результаты исследований биопроб пациентов с нейросифилисом методами определения ITPA-индекса и МДА
| № п/п | Диагноз (АНС, НСС) | ITPA-индекс | МДА |
| 1—42 | АНС | + | + |
| 43—61 | НСС | + | + |
| 62 | АНС | — | + |
| 63 | НСС | — | + |
| 64 | НСС | — | + |
| 65 | НСС | + | — |
Примечание. Для ITPA-индекса «+» — это ITPA-индекс >2,0; для МДА «+» — это ДФ1>ДФ2; серым цветом в таблице обозначены полученные в биопробах дискордантные результаты двух методов.
Как следует из таблицы, при определении ITPA-индекса и осуществлении МДА 65 биопроб, полученных от пациентов с НС, совпадение результатов указанных методик отмечено в 61 (93,8%) биопробе, в том числе в 42 биопробах, полученных от пациентов с АНС, и в 19 биопробах, полученных от пациентов с НСС.
Дискордантность результатов ITPA-индекса и МДА отмечена в 4 (6,2%) пробах:
— в биопробах №62—64 ITPA-индекс оказался отрицательным, а МДА дал положительный результат; эти биопробы получены от 2 мужчин с НСС и 1 мужчины с АНС;
— в биопробе №65 ITPA-индекс оказался положительным, а МДА дал отрицательный результат; биопроба получена от мужчины с НСС.
Обсуждение
Лабораторная диагностика большинства инфекционных заболеваний, в том числе инфекций, передаваемых половым путем, являющаяся неотъемлемой частью комплекса клинико-лабораторного обследования и ведения пациентов, в последние годы основывается преимущественно на молекулярно-биологических методологиях. Методы амплификации нуклеиновых кислот — полимеразная цепная реакция, ее модификации и другие, позволяют с высокой достоверностью выявлять наличие ДНК или РНК возбудителя в биологических пробах и устанавливать достоверный диагноз. Однако лабораторная диагностика сифилиса в большинстве случаев не может быть осуществлена с помощью этих методик ввиду отсутствия субстрата для выполнения этих исследований или невысокой чувствительности при исследовании таких видов биологического материала, как плазма, сыворотка и цельная кровь [18]. Исключение составляют ранние манифестные формы заболевания, при которых в качестве биологических образцов используют соскобный материал и отделяемое сифилидов и получают высокодостоверные результаты [19, 20].
Поскольку клиническая картина сифилиса многообразна, в ряде случаев неспецифична или отсутствует вовсе, то лабораторные исследования являются одной из важных составляющих диагностического процесса.
В России при диагностике всех форм и стадий сифилиса, согласно приказам Минздрава России и клиническим рекомендациям, применяется комплексный подход с использованием многочисленных регламентированных методологий, основанных главным образом на ответной реакции со стороны организма-хозяина — так называемом антительном ответе [8, 9, 14]. Диагноз сифилиса устанавливают на основании положительных результатов неспецифических (нетрепонемных) и специфических (трепонемных) тестов. За основу при установлении «лабораторного» диагноза сифилиса, как правило, принимают результаты трепонемных тестов. Тест-системы, выпускаемые в Российской Федерации («Вектор-Бест», «Диагностические системы», «ЭКОлаб» и др.) обладают высокой (≥95%) чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью и регулярно контролируются государственными службами.
Таким образом, установление диагноза сифилиса заключается в применении многочисленных разноплановых методологий, а само исследование представляет собой процедуру, требующую значительного опыта и не исключающую субъективизма при оценке результатов [21—26].
Одним из наиболее сложных и трудоемких вопросов является подтверждение или опровержение диагноза нейросифилиса. И если при других формах заболевания достаточно провести исследование сыворотки крови, то при диагностике НС необходимо оценить ряд показателей, получаемых путем исследования ликвора [8, 9].
В МНПЦ дерматовенерологии и косметологии на протяжении ряда лет реализуется научно-исследовательская программа по усовершенствованию диагностики НС, которая заключается в сопоставлении применяемых в России регламентированных методик с ранее не использовавшимися методологиями и в разработке новых подходов, применяемых для постановки диагноза, а также по окончании терапии и в процессе клинико-серологического наблюдения. Результаты программы широко освещаются в научных изданиях — статьях, монографиях, докладах и тезисах конференций, в том числе международных [8, 17, 22, 26, 27].
Стандартными методами клинико-лабораторной диагностики в большинстве случаев установить диагноз НС невозможно даже с помощью исследования ЦСЖ, что объясняется необходимостью выявления не только антительного ответа на инвазию трепонемы, но также интратекального синтеза антител с целью его дифференциации от пассивного проникновения компартментов возбудителя через поврежденный гематоэнцефалический барьер [26].
В основу методологии оценки интратекального синтеза антител к T. pallidum у больных НС положен постулат о том, что при отсутствии патологии ЦНС содержание специфических и общих иммуноглобулинов в ликворе и в крови идентично. Разработан ITPA-индекс (Intrathecal T. pallidum assay index), позволяющий проводить дифференциальную диагностику локальной продукции антител и их пассивной транссудации в ЦНС; поскольку РПГА направлена на определение IgG, этот индекс является маркером интратекального синтеза этих иммуноглобулинов и позволяет верифицировать специфические поражения нервной системы; этот индекс иногда называют РПГА (ITPA)-индексом [12, 13, 26].
В настоящем исследовании общая чувствительность определения ITPA-индекса при обследовании пациентов с НС составила 95,4%, при этом у пациентов с АНС она оказалась несколько выше (97,7%), чем у пациентов с НСС (90,9%).
Второй методологией, использованной для диагностики НС в настоящем исследовании, явился МДА. Сущность МДА заключается в поиске новых признаков, называемых ДФ, на основе использования совокупности исходных показателей. При этом каждой группе пациентов соответствует своя ДФ. Получаемое значение ДФ позволяет отнести пациента к той или иной группе с соответствующей нозологией.
Применительно к диагностике НС методология МДА впервые использована в МНПЦ дерматовенерологии и косметологии в ходе выполнения НИР «Современные методы профилактики, диагностики, лечения инфекций, передаваемых половым путем» и имела своей целью разделение пациентов с сифилисом на 2 группы на основании результатов исследования ликвора: больные сифилисом, одновременно страдающие НС, и больные сифилисом без НС. Для каждой из групп рассчитана ДФ. На основании расчета значений ДФ пациента относили к группе с более высоким значением ДФ. При проведении исследований установлено, что эффективность МДА значительно превышает количество положительных результатов таких методов лабораторной верификации НС, как, например, определение белка, цитоза, а также некоторых иммунологических показателей (РМП, РИБТ).
На основании результатов выполнения НИР разработан способ диагностики НС, заключающийся в том, что у пациента с подозрением на НС в ликворе определяют совокупность лабораторных показателей (РМП, VDRL, РПГА, РИБТ, ИФА, РИФц, цитоз, белок, а также, что не осуществляли ранее, антитела к Tp17, Tp15, Tp47, TmpA в формате иммуночипа) с последующим вычислением значений линейных ДФ — ДФ1 и ДФ2: при ДФ1>ДФ2 диагностируют наличие специфического поражения нервной системы (НС), а при ДФ2>ДФ1 НС исключают [15–17, 28]. Показано, что способ диагностики НС, основанный на МДА, повышает точность диагностики НС и верифицирует диагностику этого заболевания в сомнительных случаях, предоставляет возможность выбора тактики терапии и ведения пациентов.
При использовании методики МДА в настоящем исследовании установлено, что общая чувствительность метода составила 98,5%, при этом у пациентов с АНС она оказалась выше (100%), чем у пациентов с НСС (95,5%).
Сравнительная оценка эффективности двух методологий показала, что результаты ITPA и МДА совпали в 93,8% случаев, дискордантные (несовпадающие) результаты получены в 4 биопробах (6,2%).
Заключение
Учитывая высокую эффективность методологий ITPA и МДА для выявления НС, можно сделать вывод о возможности их использования в практике сифилидологии с целью верификации диагноза НС как отдельно, так и в дополнение друг другу, особенно в случае затруднений при установлении диагноза НС, при несовпадении клинических и лабораторных данных.
Это особенно актуально, поскольку применяемая в настоящее время классификация НС основана главным образом на патологических изменениях, тогда как классификации этого заболевания, основанной на определении иммунной реакции ЦНС, не существует.
В перспективе представленные методологии могут заменить недостаточно эффективные и субъективно оцениваемые стандартные лабораторные исследования.
Участие авторов:
Концепция и дизайн: Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго, Е.С. Негашева
Написание текста: Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго, Н.В. Китаева
Редактирование: Н.В. Фриго, О.В. Доля
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors’ contributions:
The concept and design of the study: G.A. Dmitriev, N.V. Frigo, E.S. Negasheva
Drafting the manuscript: G.A. Dmitriev, N.V. Frigo, N.V. Kitaeva
Revising the manuscript: N.V. Frigo, O.V. Dolya
1ITPA-индекс (Intrathecal T. pallidum assay index) — методология, разработанная для диагностики НС в 1980-х годах [12, 13], позволяющая верифицировать специфические поражения нервной системы; до недавнего времени в России не применялась и нашла свое отражение лишь в последних клинических рекомендациях (2020) [14].
2МДА — методология, впервые примененная для диагностики НС в МНПЦ дерматовенерологии и косметологии в ходе выполнения НИР «Современные методы профилактики, диагностики, лечения инфекций, передаваемых половым путем», гос. рег. №АААА-А17-117122290024-5, фрагмент «Разработка и внедрение в практику московского здравоохранения новых подходов и алгоритмов лабораторной диагностики нейросифилиса» [15].
3Для определения антител к рекомбинантным белкам бледной трепонемы Тр15, Тр17, Тр47, TmpA (значения в условных единицах) применялась технология иммуночипов [16].