Авдонина А.С.

ЗАО «ЭКОлаб»

Марданлы С.Г.

ЗАО «ЭКОлаб»;
ГОУ ВО «Государственный гуманитарно-технологический университет»

Разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов класса G к Treponema pallidum методом иммунного блоттинга (формат Western blot)

Авторы:

Авдонина А.С., Марданлы С.Г.

Подробнее об авторах

Прочитано: 2024 раза


Как цитировать:

Авдонина А.С., Марданлы С.Г. Разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов класса G к Treponema pallidum методом иммунного блоттинга (формат Western blot). Клиническая дерматология и венерология. 2020;19(4):465‑469.
Avdonina AS, Mardanly SG. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay system to confirm the presence of immunoglobulins of class G to Treponema pallidum in serum, plasma and cerebrospinal fluid by immune blotting (Western blot format). Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology. 2020;19(4):465‑469. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/klinderma202019041465

Рекомендуем статьи по данной теме:
Нес­пе­ци­фи­чес­кая со­ма­ти­чес­кая па­то­ло­гия у па­ци­ен­тов с си­фи­ли­сом. Кли­ни­чес­кая дер­ма­то­ло­гия и ве­не­ро­ло­гия. 2024;(4):398-404
Диф­фе­рен­ци­аль­ная ди­аг­нос­ти­ка кок­ци­диоидо­ми­ко­за, ма­ни­фес­ти­ро­ван­но­го пе­ри­фе­ри­чес­ким об­ра­зо­ва­ни­ем лег­ко­го. Хи­рур­гия. Жур­нал им. Н.И. Пи­ро­го­ва. 2024;(8):77-85
Ком­прес­си­он­ная элас­тог­ра­фия как но­вый ме­тод ультраз­ву­ко­вой ви­зу­али­за­ции в диф­фе­рен­ци­аль­ной ди­аг­нос­ти­ке хро­ни­чес­ко­го тон­зил­ли­та. Вес­тник ото­ри­но­ла­рин­го­ло­гии. 2024;(4):20-25
Сим­птом цен­траль­ной ве­ны в диф­фе­рен­ци­аль­ной ди­аг­нос­ти­ке рас­се­ян­но­го скле­ро­за. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(7-2):58-65
Па­то­ге­не­ти­чес­кие ас­пек­ты хро­ни­чес­кой та­зо­вой бо­ли при эн­до­мет­ри­озе: пер­спек­ти­вы ди­аг­нос­ти­ки (об­зор ли­те­ра­ту­ры). Проб­ле­мы реп­ро­дук­ции. 2024;(4):112-120
Прог­рес­си­ру­ющая муль­ти­фо­каль­ная лей­ко­эн­це­фа­ло­па­тия у ВИЧ-по­зи­тив­ных па­ци­ен­тов. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. 2024;(8):39-46
Воз­мож­нос­ти ис­поль­зо­ва­ния ал­го­рит­мов гра­ди­ен­тно­го бус­тин­га для прог­но­зи­ро­ва­ния ос­лож­не­ний у па­ци­ен­тов с хи­рур­ги­чес­ким пе­ри­то­ни­том. Опе­ра­тив­ная хи­рур­гия и кли­ни­чес­кая ана­то­мия (Пи­ро­гов­ский на­уч­ный жур­нал). 2024;(3):5-13
Роль анам­не­за в пос­та­нов­ке гас­тро­эн­те­ро­ло­ги­чес­ко­го ди­аг­но­за у де­тей. До­ка­за­тель­ная гас­тро­эн­те­ро­ло­гия. 2024;(3):73-79
Диаг­нос­ти­чес­кие шка­лы ос­тро­го ап­пен­ди­ци­та у де­тей. Хи­рур­гия. Жур­нал им. Н.И. Пи­ро­го­ва. 2024;(10):80-87
Ис­поль­зо­ва­ние ис­кусствен­но­го ин­тел­лек­та в сов­ре­мен­ной сто­ма­то­ло­гии в Рос­сий­ской Фе­де­ра­ции. Сто­ма­то­ло­гия. 2024;(5):42-45

Введение

Согласно статистическим данным Роспотребнадзора [1] заболеваемость сифилисом в Российской Федерации имеет тенденцию к снижению. Несмотря на это, сифилис остается социально значимым заболеванием, требующим пристального внимания со стороны как лечащих врачей, так и специалистов лабораторной службы.

Спектр методов, применяемых в лабораторной диагностике сифилиса, довольно широк [2—4]. При обследовании разных групп пациентов применяются разные комбинации этих методов и различные алгоритмы лабораторной диагностики сифилиса, которые, помимо скрининговых, обязательно включают различные подтверждающие методы исследования [5— 7]. Наиболее эффективным подтверждающим методом в настоящее время считается иммунный блоттинг (ИБ) — выявление специфических антител к отдельным антигенам возбудителя. Из основных антигенов T. pallidum диагностически значимыми считаются TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 с молекулярной массой 15, 17, 45 и 47 кДа соответственно [5, 8—12].

В практике отечественного здравоохранения широко применяются наборы реагентов для ИБ формата Line blot (лайн-блот, линейный иммуноблот), в которых используются рекомбинантные аналоги антигенов TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 [13, 14]. В то же время опыт серологической диагностики инфекционной патологии показывает, что наиболее эффективными являются подтверждающие исследования с использованием как рекомбинантных аналогов, так и нативных антигенов возбудителей, т.е. применительно к ИБ его обоих форматов — Line blot и Western blot.

Поскольку в настоящее время в нашей стране отсутствуют зарегистрированные тест-системы для диагностики сифилиса в формате Western blot, их разработка и внедрение в практику российского здравоохранения представляется актуальной задачей.

Цель исследования — разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).

Материал и методы

В процессе разработки использованы следующие основные материалы:

— нативный лизат T. pallidum (штамм Nichols) фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (Россия);

— белковый маркер молекулярной массы фирмы Bio-Rad (США);

— акриламид и бис-акриламид фирмы AppliChem (Германия);

— нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм фирмы Sartorius (Германия);

— конъюгат козьих антител к IgG человека с щелочной фосфатазой фирмы Jakson ImmunoResearch (США);

— субстратный раствор, содержащий 5-бром-1-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий фирмы Kem-En-Tec (Дания).

В работе применяли следующие методы:

1. Культивирование T. pallidum in vivo на кроликах-самцах породы шиншилла. Для этого животным интратестикулярно вводили взвесь T. pallidum из расчета 5×107 спирохет на яичко. Затем отбирали кроликов с 7—10-дневным специфическим орхитом, фиксировали их в станке и производили тотальное обескровливание перед удалением яичек. Вскрывали мошонку и отделяли семенники. Из каждого семенника извлекали трепонемы, для этого сначала каждый семенник держали над пламенем спиртовки несколько секунд, затем измельчали инфицированную ткань ножницами в кашицеобразную массу. Измельченную ткань заливали стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и встряхивали на орбитальном шейкере. После встряхивания полученную взвесь сливали в стерильные центрифужные пробирки и центрифугировали. Надосадочную жидкость (взвесь T. pallidum) сливали в стерильный флакон. Все процедуры проводили согласно Правилам проведения лабораторных исследований в области ветеринарии [15] в соответствии с Законом Российской Федерации от 14.05.1993 №4979-1 «О ветеринарии» [16].

2. Получение нативного лизата из культуральной массы. Полученный супернатант подвергали обработке ультразвуком, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в фосфатно-солевом буферном растворе.

3. Электрофорез нативного лизата T. pallidum в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстановленных условиях с целью разделения белков в соответствии с их молекулярной массой проводили по методике, предложенной U.K. Laemmli [17].

4. Электроперенос (блоттинг) разделенных белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили с использованием оборудования фирмы Hoefer Scientific (США).

В качестве референсного материала при оценке чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали международный стандарт ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC (Великобритания); сероконверсионную панель Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (США) и смешанную панель Syphilis Mixed Titer AccuSet Performance Panel Modified фирмы SeraCare (США).

В качестве клинического материала при оценке чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали образцы сыворотки, плазмы крови и спинномозговой жидкости человека, полученные в диагностическом центре El Clinic (Электрогорск), в кожно-венерологическом диспансере г. Орехово-Зуево и на станции переливания крови г. Владимира. Все образцы предварительно были охарактеризованы на наличие или отсутствие IgG к T. pallidum в следующих тест-системах производства фирмы ЗАО «ЭКОлаб»: ИФА-Антипаллидум-IgG (РУ № ФСР 2008/03536 от 30.05.2018), Лайн-Блот Сифилис-IgG (РУ № РЗН 2014/1657 от 26.04.2018) и Антипаллидум-Флюороген-IgG (РУ № РЗН 2013/247 от 23.07.2018).

В качестве набора сравнения использовали набор реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).

Результаты и обсуждение

При разработке новой тест-системы использован опыт разработки аналогичных наборов, в частности тест-системы для выявления IgG к цитомегаловирусу [18]. При этом отработаны оптимальные условия получения иммуносорбента, процедуры анализа, регистрации, учета и интерпретации полученных данных.

По результатам проведенных экспериментов выбраны следующие условия получения иммуносорбента:

1) ПААГ с концентрацией акриламида 16% и бис-акриламида 4%;

2) загрузка нативного лизата T. pallidum на поверхность ПААГ из расчета 2 мкг на 1 мм2;

3) проведение электрофореза в течение 4 ч при температуре 7°С и меняющемся напряжении (250 В в начале процесса, 150 В через 1 ч от начала процесса и 100 В через 2 ч от начала процесса);

4) проведение электропереноса в течение 3 ч при температуре 15 °С и постоянном напряжении 100 В;

5) инкубирование мембран после электропереноса в течение 15 мин в трис-солевом буферном растворе с целью блокирования сайтов неспецифического связывания.

Анализ антигенного состава нативного лизата T. pallidum показал наличие в нем всех диагностически важных антигенов с молекулярными массами 47, 45, 17 и 15 кДа (см. рисунок).

Антигенный состав лизата T. pallidum.

1 — результат электрофоретического разделения белкового маркера молекулярной массы; 2 — результат исследования сыворотки, положительной по наличию IgG к T. pallidum, при инкубации с мембраной, на которую нанесены электрофоретические разделенные антигены нативного лизата T. pallidum и контрольная линия (анти-IgG).

В качестве оптимальной выбрана следующая процедура проведения анализа:

— разведение образца в буферном растворе 1:100;

— инкубация стрипов иммуносорбента с образцом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;

— инкубация стрипов иммуносорбента с конъюгатом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;

— инкубация с субстратным раствором в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— остановка реакции водой очищенной.

Итогом разработки стала тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG следующего состава:

1) иммуносорбент — 24 полоски (стрипа) из нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными на них методом электропереноса белками T. pallidum (антигены р47, р45, р17, р15) и контрольной линией (козьи антитела к IgG человека);

2) конъюгат — козьи антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой;

3) окрашивающий раствор — 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий;

4) 10-кратный концентрат трис-солевого буфера [ТСБ(×10)];

5) фотография референс-стрипа с проявленным белковым профилем антигенов T. pallidum (р47, р45, р17, р15).

Результаты анализа интерпретировали с учетом окрашивания зон, соответствующих только специфическим антигенам, при этом учету подлежали только четко окрашенные полосы. Наличие слабо окрашенных полос, соответствующих специфическим антигенам, а также окрашенных полос, соответствующих неспецифическим антигенам, не учитывали.

Положительным результатом анализа считали наличие не менее 2 полос, соответствующих специфическим антигенам T. pallidum; наличие только одной полосы, соответствующей одному из специфических антигенов, оценивали как неопределенный результат, отсутствие окрашивания в области полос, соответствующих специфическим антигенам, — как отрицательный результат.

Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы вначале исследовали на референсных материалах — на 9 сыворотках сероконверсионной панели Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (5 отрицательных, 3 неопределенных и 1 положительный) и на 20 сыворотках панели Syphilis Mixed Titer AccuSetTM Performance Panel Modified фирмы SeraCare (2 отрицательных и 18 положительных).

Полученные оценки исследованных образцов полностью совпали с их паспортными характеристиками, т.е. была показана 100% диагностическая чувствительность и специфичность разработанной тест-системы. Аналитическая чувствительность тест-системы оценена с использованием международного стандарта ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC и составила 0,001 МЕ/мл.

В заключение исследовали чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на клиническом материале по сравнению с аналогом — набором реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG. Исследовано по 10 образцов сыворотки и плазмы крови человека, а также спинномозговой жидкости, содержащих IgG к T. pallidum по результатам их предварительного обследования, и по 10 образцов сыворотки, плазмы и спинномозговой жидкости, не содержащих этих антител (всего 60 образцов). Оценки всех исследованных образцов, полученных в обеих тест-системах, полностью совпали, что подтверждает высокую чувствительность и специфичность новой тест-системы.

Кроме полного совпадения общих оценок клинических материалов, в обеих тест-системах получено практическое совпадение профилей антител, выявленных этими тест-системами в исследованных образцах, о чем свидетельствуют коэффициенты корреляции оценок наличия антител к антигенам р47, р45, р17, р15 — 0,93—1,00.

Следует отметить, что разработанная тест-система имеет преимущество перед набором-аналогом по времени проведения анализа — оно короче на 15 мин, поскольку блокировка стрипов, предусмотренная постановкой ИБ с помощью набора-аналога, при использовании ИФА-Блот-Сифилис-IgG не требуется — она уже выполнена при изготовлении иммуносорбента. Кроме того, стоимость новой тест-системы будет значительно ниже стоимости набора-аналога, поскольку ее основной компонент — нативный лизат T. pallidum — производится на базе ЗАО «ЭКОлаб». Так, в апреле 2020 г. коммерческая цена набора Anti-Treponema pallidum WESTERNBLOT (IgG) составила 12 552 руб., тогда как ориентировочная себестоимость набора ИФА-Блот-Сифилис-IgG равна 5000 руб.

Выводы

1. Разработана отечественная иммуноферментная тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG, предназначенная для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).

2. Разработанная тест-система характеризуется высокими показателями чувствительности и специфичности и имеет аналитическую чувствительность 0,001 МЕ/мл.

3. ИФА-Блот-Сифилис-IgG выгодно отличается по техническим характеристикам и стоимости от своего импортного аналога — набора реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).

4. После прохождения процедуры государственной регистрации медицинского изделия новая тест-система может быть рекомендована учреждениям здравоохранения в качестве подтверждающего теста на сифилис.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — С.Г. Марданлы

Сбор, обработка материала, написание текста — А.С. Авдонина

Редактирование — С.Г. Марданлы

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — S.G. Mardanly

Collecting and interpreting the data — A.S. Avdonina

Drafting the manuscript — A.S. Avdonina

Revising the manuscript — S.G. Mardanly

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.