Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Авдонина А.С.

ЗАО «ЭКОлаб»

Марданлы С.Г.

ЗАО «ЭКОлаб»;
ГОУ ВО «Государственный гуманитарно-технологический университет»

Разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов класса G к Treponema pallidum методом иммунного блоттинга (формат Western blot)

Авторы:

Авдонина А.С., Марданлы С.Г.

Подробнее об авторах

Просмотров: 1849

Загрузок: 88


Как цитировать:

Авдонина А.С., Марданлы С.Г. Разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов класса G к Treponema pallidum методом иммунного блоттинга (формат Western blot). Клиническая дерматология и венерология. 2020;19(4):465‑469.
Avdonina AS, Mardanly SG. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay system to confirm the presence of immunoglobulins of class G to Treponema pallidum in serum, plasma and cerebrospinal fluid by immune blotting (Western blot format). Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology. 2020;19(4):465‑469. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/klinderma202019041465

Рекомендуем статьи по данной теме:
Ис­кусствен­ный ин­тел­лект в дер­ма­то­ло­гии: воз­мож­нос­ти и пер­спек­ти­вы. Кли­ни­чес­кая дер­ма­то­ло­гия и ве­не­ро­ло­гия. 2024;(3):246-252
Нес­пе­ци­фи­чес­кая со­ма­ти­чес­кая па­то­ло­гия у па­ци­ен­тов с си­фи­ли­сом. Кли­ни­чес­кая дер­ма­то­ло­гия и ве­не­ро­ло­гия. 2024;(4):398-404
Воз­мож­нос­ти ми­ни­маль­но ин­ва­зив­ных вме­ша­тельств в ле­че­нии ос­лож­не­ний, свя­зан­ных с внут­риб­рюш­ны­ми кон­кре­мен­та­ми пос­ле ви­де­ола­па­рос­ко­пи­чес­кой хо­ле­цис­тэк­то­мии. Хи­рур­гия. Жур­нал им. Н.И. Пи­ро­го­ва. 2024;(5):14-20
Наш опыт ле­че­ния врож­ден­ных на­заль­ных сре­дин­ных ге­те­ро­то­пий у де­тей и об­зор так­тик ле­че­ния. Вес­тник ото­ри­но­ла­рин­го­ло­гии. 2024;(2):28-32
По­ли­поз­ный ри­но­си­ну­сит как пер­вый этап в раз­ви­тии эози­но­филь­но­го гра­ну­ле­ма­то­за с по­ли­ан­ги­итом. Рос­сий­ская ри­но­ло­гия. 2024;(2):157-166
Диф­фе­рен­ци­аль­ная ди­аг­нос­ти­ка кок­ци­диоидо­ми­ко­за, ма­ни­фес­ти­ро­ван­но­го пе­ри­фе­ри­чес­ким об­ра­зо­ва­ни­ем лег­ко­го. Хи­рур­гия. Жур­нал им. Н.И. Пи­ро­го­ва. 2024;(8):77-85
Ком­прес­си­он­ная элас­тог­ра­фия как но­вый ме­тод ультраз­ву­ко­вой ви­зу­али­за­ции в диф­фе­рен­ци­аль­ной ди­аг­нос­ти­ке хро­ни­чес­ко­го тон­зил­ли­та. Вес­тник ото­ри­но­ла­рин­го­ло­гии. 2024;(4):20-25
Сим­птом цен­траль­ной ве­ны в диф­фе­рен­ци­аль­ной ди­аг­нос­ти­ке рас­се­ян­но­го скле­ро­за. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(7-2):58-65
Па­то­ге­не­ти­чес­кие ас­пек­ты хро­ни­чес­кой та­зо­вой бо­ли при эн­до­мет­ри­озе: пер­спек­ти­вы ди­аг­нос­ти­ки (об­зор ли­те­ра­ту­ры). Проб­ле­мы реп­ро­дук­ции. 2024;(4):112-120
Прог­рес­си­ру­ющая муль­ти­фо­каль­ная лей­ко­эн­це­фа­ло­па­тия у ВИЧ-по­зи­тив­ных па­ци­ен­тов. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. 2024;(8):39-46

Введение

Согласно статистическим данным Роспотребнадзора [1] заболеваемость сифилисом в Российской Федерации имеет тенденцию к снижению. Несмотря на это, сифилис остается социально значимым заболеванием, требующим пристального внимания со стороны как лечащих врачей, так и специалистов лабораторной службы.

Спектр методов, применяемых в лабораторной диагностике сифилиса, довольно широк [2—4]. При обследовании разных групп пациентов применяются разные комбинации этих методов и различные алгоритмы лабораторной диагностики сифилиса, которые, помимо скрининговых, обязательно включают различные подтверждающие методы исследования [5— 7]. Наиболее эффективным подтверждающим методом в настоящее время считается иммунный блоттинг (ИБ) — выявление специфических антител к отдельным антигенам возбудителя. Из основных антигенов T. pallidum диагностически значимыми считаются TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 с молекулярной массой 15, 17, 45 и 47 кДа соответственно [5, 8—12].

В практике отечественного здравоохранения широко применяются наборы реагентов для ИБ формата Line blot (лайн-блот, линейный иммуноблот), в которых используются рекомбинантные аналоги антигенов TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 [13, 14]. В то же время опыт серологической диагностики инфекционной патологии показывает, что наиболее эффективными являются подтверждающие исследования с использованием как рекомбинантных аналогов, так и нативных антигенов возбудителей, т.е. применительно к ИБ его обоих форматов — Line blot и Western blot.

Поскольку в настоящее время в нашей стране отсутствуют зарегистрированные тест-системы для диагностики сифилиса в формате Western blot, их разработка и внедрение в практику российского здравоохранения представляется актуальной задачей.

Цель исследования — разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).

Материал и методы

В процессе разработки использованы следующие основные материалы:

— нативный лизат T. pallidum (штамм Nichols) фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (Россия);

— белковый маркер молекулярной массы фирмы Bio-Rad (США);

— акриламид и бис-акриламид фирмы AppliChem (Германия);

— нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм фирмы Sartorius (Германия);

— конъюгат козьих антител к IgG человека с щелочной фосфатазой фирмы Jakson ImmunoResearch (США);

— субстратный раствор, содержащий 5-бром-1-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий фирмы Kem-En-Tec (Дания).

В работе применяли следующие методы:

1. Культивирование T. pallidum in vivo на кроликах-самцах породы шиншилла. Для этого животным интратестикулярно вводили взвесь T. pallidum из расчета 5×107 спирохет на яичко. Затем отбирали кроликов с 7—10-дневным специфическим орхитом, фиксировали их в станке и производили тотальное обескровливание перед удалением яичек. Вскрывали мошонку и отделяли семенники. Из каждого семенника извлекали трепонемы, для этого сначала каждый семенник держали над пламенем спиртовки несколько секунд, затем измельчали инфицированную ткань ножницами в кашицеобразную массу. Измельченную ткань заливали стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и встряхивали на орбитальном шейкере. После встряхивания полученную взвесь сливали в стерильные центрифужные пробирки и центрифугировали. Надосадочную жидкость (взвесь T. pallidum) сливали в стерильный флакон. Все процедуры проводили согласно Правилам проведения лабораторных исследований в области ветеринарии [15] в соответствии с Законом Российской Федерации от 14.05.1993 №4979-1 «О ветеринарии» [16].

2. Получение нативного лизата из культуральной массы. Полученный супернатант подвергали обработке ультразвуком, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в фосфатно-солевом буферном растворе.

3. Электрофорез нативного лизата T. pallidum в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстановленных условиях с целью разделения белков в соответствии с их молекулярной массой проводили по методике, предложенной U.K. Laemmli [17].

4. Электроперенос (блоттинг) разделенных белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили с использованием оборудования фирмы Hoefer Scientific (США).

В качестве референсного материала при оценке чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали международный стандарт ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC (Великобритания); сероконверсионную панель Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (США) и смешанную панель Syphilis Mixed Titer AccuSet Performance Panel Modified фирмы SeraCare (США).

В качестве клинического материала при оценке чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали образцы сыворотки, плазмы крови и спинномозговой жидкости человека, полученные в диагностическом центре El Clinic (Электрогорск), в кожно-венерологическом диспансере г. Орехово-Зуево и на станции переливания крови г. Владимира. Все образцы предварительно были охарактеризованы на наличие или отсутствие IgG к T. pallidum в следующих тест-системах производства фирмы ЗАО «ЭКОлаб»: ИФА-Антипаллидум-IgG (РУ № ФСР 2008/03536 от 30.05.2018), Лайн-Блот Сифилис-IgG (РУ № РЗН 2014/1657 от 26.04.2018) и Антипаллидум-Флюороген-IgG (РУ № РЗН 2013/247 от 23.07.2018).

В качестве набора сравнения использовали набор реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).

Результаты и обсуждение

При разработке новой тест-системы использован опыт разработки аналогичных наборов, в частности тест-системы для выявления IgG к цитомегаловирусу [18]. При этом отработаны оптимальные условия получения иммуносорбента, процедуры анализа, регистрации, учета и интерпретации полученных данных.

По результатам проведенных экспериментов выбраны следующие условия получения иммуносорбента:

1) ПААГ с концентрацией акриламида 16% и бис-акриламида 4%;

2) загрузка нативного лизата T. pallidum на поверхность ПААГ из расчета 2 мкг на 1 мм2;

3) проведение электрофореза в течение 4 ч при температуре 7°С и меняющемся напряжении (250 В в начале процесса, 150 В через 1 ч от начала процесса и 100 В через 2 ч от начала процесса);

4) проведение электропереноса в течение 3 ч при температуре 15 °С и постоянном напряжении 100 В;

5) инкубирование мембран после электропереноса в течение 15 мин в трис-солевом буферном растворе с целью блокирования сайтов неспецифического связывания.

Анализ антигенного состава нативного лизата T. pallidum показал наличие в нем всех диагностически важных антигенов с молекулярными массами 47, 45, 17 и 15 кДа (см. рисунок).

Антигенный состав лизата T. pallidum.

1 — результат электрофоретического разделения белкового маркера молекулярной массы; 2 — результат исследования сыворотки, положительной по наличию IgG к T. pallidum, при инкубации с мембраной, на которую нанесены электрофоретические разделенные антигены нативного лизата T. pallidum и контрольная линия (анти-IgG).

В качестве оптимальной выбрана следующая процедура проведения анализа:

— разведение образца в буферном растворе 1:100;

— инкубация стрипов иммуносорбента с образцом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;

— инкубация стрипов иммуносорбента с конъюгатом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;

— инкубация с субстратным раствором в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— остановка реакции водой очищенной.

Итогом разработки стала тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG следующего состава:

1) иммуносорбент — 24 полоски (стрипа) из нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными на них методом электропереноса белками T. pallidum (антигены р47, р45, р17, р15) и контрольной линией (козьи антитела к IgG человека);

2) конъюгат — козьи антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой;

3) окрашивающий раствор — 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий;

4) 10-кратный концентрат трис-солевого буфера [ТСБ(×10)];

5) фотография референс-стрипа с проявленным белковым профилем антигенов T. pallidum (р47, р45, р17, р15).

Результаты анализа интерпретировали с учетом окрашивания зон, соответствующих только специфическим антигенам, при этом учету подлежали только четко окрашенные полосы. Наличие слабо окрашенных полос, соответствующих специфическим антигенам, а также окрашенных полос, соответствующих неспецифическим антигенам, не учитывали.

Положительным результатом анализа считали наличие не менее 2 полос, соответствующих специфическим антигенам T. pallidum; наличие только одной полосы, соответствующей одному из специфических антигенов, оценивали как неопределенный результат, отсутствие окрашивания в области полос, соответствующих специфическим антигенам, — как отрицательный результат.

Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы вначале исследовали на референсных материалах — на 9 сыворотках сероконверсионной панели Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (5 отрицательных, 3 неопределенных и 1 положительный) и на 20 сыворотках панели Syphilis Mixed Titer AccuSetTM Performance Panel Modified фирмы SeraCare (2 отрицательных и 18 положительных).

Полученные оценки исследованных образцов полностью совпали с их паспортными характеристиками, т.е. была показана 100% диагностическая чувствительность и специфичность разработанной тест-системы. Аналитическая чувствительность тест-системы оценена с использованием международного стандарта ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC и составила 0,001 МЕ/мл.

В заключение исследовали чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на клиническом материале по сравнению с аналогом — набором реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG. Исследовано по 10 образцов сыворотки и плазмы крови человека, а также спинномозговой жидкости, содержащих IgG к T. pallidum по результатам их предварительного обследования, и по 10 образцов сыворотки, плазмы и спинномозговой жидкости, не содержащих этих антител (всего 60 образцов). Оценки всех исследованных образцов, полученных в обеих тест-системах, полностью совпали, что подтверждает высокую чувствительность и специфичность новой тест-системы.

Кроме полного совпадения общих оценок клинических материалов, в обеих тест-системах получено практическое совпадение профилей антител, выявленных этими тест-системами в исследованных образцах, о чем свидетельствуют коэффициенты корреляции оценок наличия антител к антигенам р47, р45, р17, р15 — 0,93—1,00.

Следует отметить, что разработанная тест-система имеет преимущество перед набором-аналогом по времени проведения анализа — оно короче на 15 мин, поскольку блокировка стрипов, предусмотренная постановкой ИБ с помощью набора-аналога, при использовании ИФА-Блот-Сифилис-IgG не требуется — она уже выполнена при изготовлении иммуносорбента. Кроме того, стоимость новой тест-системы будет значительно ниже стоимости набора-аналога, поскольку ее основной компонент — нативный лизат T. pallidum — производится на базе ЗАО «ЭКОлаб». Так, в апреле 2020 г. коммерческая цена набора Anti-Treponema pallidum WESTERNBLOT (IgG) составила 12 552 руб., тогда как ориентировочная себестоимость набора ИФА-Блот-Сифилис-IgG равна 5000 руб.

Выводы

1. Разработана отечественная иммуноферментная тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG, предназначенная для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).

2. Разработанная тест-система характеризуется высокими показателями чувствительности и специфичности и имеет аналитическую чувствительность 0,001 МЕ/мл.

3. ИФА-Блот-Сифилис-IgG выгодно отличается по техническим характеристикам и стоимости от своего импортного аналога — набора реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).

4. После прохождения процедуры государственной регистрации медицинского изделия новая тест-система может быть рекомендована учреждениям здравоохранения в качестве подтверждающего теста на сифилис.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — С.Г. Марданлы

Сбор, обработка материала, написание текста — А.С. Авдонина

Редактирование — С.Г. Марданлы

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — S.G. Mardanly

Collecting and interpreting the data — A.S. Avdonina

Drafting the manuscript — A.S. Avdonina

Revising the manuscript — S.G. Mardanly

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.