Актуальность клинической диагностики болезней кожи и подкожно-жировой клетчатки, входящих в компетенцию врачей-дерматовенерологов, определяется, с одной стороны, высоким уровнем заболеваемости, а с другой — теми негативными последствиями, которые оказывают эти заболевания на здоровье человека.

В Москве на протяжении ряда последних лет регистрируется высокий уровень заболеваемости болезнями кожи и подкожно-жировой клетчатки как среди взрослого, так и детского населения. Так, в 2016 г. заболевания кожи и подкожной клетчатки составили в общей структуре заболеваемости 72,5% (в 2013 г. — 70,3%; в 2014 г. — 68,55%; в 2015 г. — 73,11%). Заболеваемость дерматозами составила 3583,7 на 100 тыс. населения, при этом наиболее высокий уровень данной патологии регистрировали среди подростков 15—17 лет (в 2016 г. — 9515,2 случая на 100 тыс. населения) (рис. 1).

Следует отметить рост торпидных к традиционной терапии заболеваний, нередко приводящих к инвалидизации и даже летальному исходу.

К 2016 г. отмечен существенный (в сравнении с данными 2009 г. — на 431%) рост заболеваемости новообразованиями кожи (в основном доброкачественными — 99,4%) (рис. 2).

Как известно, диагностику заболеваний кожи и подкожно-жировой клетчатки, новообразований кожи осуществляют врачи-дерматовенерологи прежде всего визуально, на основании наблюдения первичных и вторичных морфологических элементов, которые в итоге укладываются в клиническую картину того или иного заболевания. Однако в ряде случаев (при неясной, стертой клинической симптоматике, при схожей клинической картине отдельных заболеваний) для установления диагноза требуется дополнительное подтверждение.

Диагностические технологии, применяемые для верификации диагноза при заболеваниях кожи и подкожной клетчатки, можно разделить на две большие группы: морфологические методы оценки структуры кожи, которые в свою очередь подразделяются на инвазивные и неинвазивные технологии, и функциональные методы оценки состояния кожи (рис. 3).

Основным лабораторным методом верификации диагноза при дерматозах и новообразованиях кожи до сих пор остается метод патоморфологического (гистологическое) исследования. Патоморфологическое исследование биоптатов кожи позволяет изучить структуру кожи и обнаружить изменения (паттерны), характерные для того или иного дерматоза; оказывает существенную помощь при необходимости проведения дифференциальной диагностики. Помимо обычной световой микроскопии, для изучения биологических объектов, в том числе кожи, используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную виды микроскопии, в основе которых лежат различные свойства света.

Одним из современных патоморфологических методов является in vitro конфокальная микроскопия — лазерное оптическое сканирование, позволяющее получить полное изображение слоев кожи с высокой степенью разрешения, в трех измерениях (по высоте, ширине и глубине) [1].

Упоминая верификацию диагноза при дерматозах, нельзя обойти вниманием такой точный ультраструктурный метод, как электронная микроскопия, которая в свою очередь может быть трансмиссионной, сканирующей, иммуноэлектронной. Изображение объектов исследования при этом возникает за счет направленного потока электронов, однако ввиду низкой проникающей способности электронов исследуемый биологический материал должен быть приготовлен в виде очень тонких срезов. Вместе с тем только электронная микроскопия может дать непосредственную информацию о молекулярной организации клетки и оценить ультраструктурные изменения, происходящие в коже под влиянием тех или иных видов терапевтического воздействия [2—5].

Удачным дополнением патоморфологического исследования является метод гистохимии, изучающий локализацию различных веществ и продуктов их метаболизма в тканях путем связывания определенного химического компонента клеток с красителем. С помощью данного метода возможно осуществлять дифференциальное окрашивание жиров, гликогена, нуклеиновых кислот, нуклеопротеинов, ферментов и других химических компонентов клетки. Возможен также количественный учет результатов реакций. В качестве примера использования метода гистохимии в дерматологии можно привести определение количества меланинсодержащих клеток в базальном и шиповатом слое эпидермиса у больных витилиго [6]. Наличие гликогена часто является диагностическим признаком таких заболеваний, как опухоли фолликулов волос (светлоклеточная гидроаденома и экринная порома); все клетки эпителиальных влагалищ и потовых желез при этом содержат гликоген в большом количестве. Нейтральные мукополисахариды обнаруживают при болезни Педжета [7].

Популярным методом диагностики дерматозов и новообразований кожи в настоящее время является метод иммуногистохимии — иммунологический метод микроскопии тканей, специфически выявляющий в них искомые вещества (антигены). Прямой метод заключается в специфическом связывании маркированных антител непосредственно с выявляемым антигеном (рис. 4).

Непрямой метод осуществляется двухэтапно (см. рис 4). На первом этапе немаркированные первичные антитела связываются с искомым антигеном. На втором этапе исследования искомый антиген выявляется путем взаимодействия вторичных, меченных антител с первичными антителами, которые служат для вторичных антител антигенами.

Иммуногистохимия быстро становится стандартной методикой во многих лабораториях и доступна в виде флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), хромогенной in situ гибридизации (CISH) и in situ гибридизации серебрением (SISH).

В качестве примера использования метода иммуногистохимии в дерматологии можно привести его применение для установления диагноза грибовидного микоза. Так, с использованием соответствующих маркеров можно определять иммунофенотип опухолевых лимфоидных клеток, соответствующий зрелым Т-клеткам памяти (βF1+ CD3+ CD4+ CD5+ CD7+ CD8– CD45RO+) [8], аберрантный фенотип лимфоцитов (снижение экспрессии маркеров CD2, CD3, CD5, CD7 — потеря пан-Т-клеточных антигенов) [9], количество и степень зрелости дендритных клеток [10].

Близким по своей сути к методу иммуногистохимии является иммунофлюоресцентный анализ — иммунологический метод определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах тканевых срезов, а также клеточных суспензий, крови. Суть метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами, меченными флюоресцентными маркерами. Как метод иммуногистохимии, так и метод иммунофлюоресценции может быть прямым и непрямым, и во втором случае осуществляется двухэтапно. Наиболее часто в дерматологии данный метод используют при необходимости подтверждения диагноза пузырчатки. При этом при pemphigus vulgaris в реакции прямой иммунофлюоресценции выявляется фиксация комплемента (C3) и Ig (G, A или M) в межклеточных промежутках эпидермиса, что является основанием для установления диагноза данного заболевания (рис. 5)

Среди основных тенденций развития современной дерматологии в ближайшем будущем особую роль приобретает направление, связанное с разработкой и внедрением в практику неинвазивных методов исследования структур кожи in vivo [13—20].

К числу таких методов относят нижеследующие.

— Дерматоскопия — метод визуальной оценки кожных поражений для быстрого подтверждения диагноза (дает возможность распознавать морфологические структуры, невидимые невооруженным глазом).

— In vivo конфокальная микроскопия — лазерное оптическое сканирование, позволяет получить изображение слоев кожи с высокой степенью разрешения, в реальном времени в трех измерениях (высота, ширина и глубина).

— Оптическая когерентная томография для зондирования биоткани используется оптическое излучение ближнего инфракрасного диапазона; метод обладает высоким разрешением, контрастностью, глубина исследования 1,5 мм.

— Ультразвуковое исследование кожи — неинвазивный метод исследования кожи, обладающий высокой точностью и воспроизводимостью, позволяющий осуществлять дифференцировку слоев кожи, оценивать состояние васкуляризации; оперирующий понятиями «эхогенность», «эхоструктура».

Существует ряд методов оценки функционального состояния кожи. Некоторые из этих методов позволяют оценить липидный баланс кожи (себуметрия оценивает активность сальных желез), другие (максаметрия, хромаметрия) позволяют определять цветовые характеристики кожи. Увлажненность кожи можно оценивать методами корнеометрии и вапометрии. Теваметрия оценивает барьерные свойства рогового слоя кожи, ревискометрия — состояние соединительнотканных волокон дермы; кутометрия и баллистометрия — деформационные и эластические свойства кожи, измерение рН кожи позволяет определить состояние кислотно-щелочного равновесия (табл. 1).

Методы оценки функционального состояния кожи в настоящее время широко применяются в дерматологии и косметологии при обследовании больных акне, розацеа и другими заболеваниями и косметическими дефектами кожи [21—26].

Важным направлением в диагностике дерматозов является так называемая маркерная диагностика. Биомаркер представляет собой анализ (специфический белок, метаболит, ген, РНК), характеристики которого показывают существенную корреляцию с физиологическими, патологическими или клиническими проявлениями заболевания. Основной целью целевой «маркерной» диагностики является идентификация определенных молекул или их комплексов, которые присутствуют только в пораженных тканях или клетках и при развитии заболевания выделяются во внешнюю среду или внутренние среды организма.

В зависимости от применяемых методологий выявления маркеры можно условно подразделить на «биохимические» и «клинические» (выявляемые соответственно биохимическими и клиническими методами исследований), «иммунологические» (выявляемые иммунологическими методами), «молекулярные или молекулярно-генетические» (выявляемые молекулярными методами), «протеомные» (выявляемые методами протеомного анализа) и т. д.

Биохимическими и клиническими методами выявляются:

— ревматоидный фактор (аутоантитела класса IgM, реагирующие с F_c-фрагментом IgG), который нередко отмечают у больных системной красной волчанкой (СКВ), имеющих выраженный суставной синдром [27, 28];

— волчаночный антикоагулянт (ВА) относится к IgG. ВА — это показатель коагулограммы, представляет собой группу антител к фосфолипидам, которые входят в состав клеточных мембран. ВА определяют в среднем у 60% больных СКВ. Впервые он был обнаружен у больного СКВ, отчего и получил такое название. Присутствие в крови ВА свидетельствует о склонности к тромбозам, механизм возникновения которых до конца неясен [29];

— LE-клетки (lupus erythematodes cells, LE-cells) представляют собой морфологическое проявление иммунологического феномена, характерного для СКВ. Главное в данном феномене — гибель нейтрофилов. В результате сложных аутоиммунных процессов при СКВ происходит разрушение клеток, а из их ядерной субстанции (деполимеризованная ДНК) возникают бесструктурные шаровидные образования (гематоксилиновые тельца), которые затем фагоцитируются нейтрофильными лейкоцитами. Таким образом, LE-клетки — это полиморфноядерные нейтрофилы (реже эозинофилы или базофилы) с фагоцитированным ядром клетки или отдельными его фрагментами. Эти клетки обнаруживают в среднем у 70— 80% больных СКВ [30];

— «ферменты мышечного распада» (креатинфосфокиназа, лактатдегидрогеназа, аланин- и аспартатаминотрансфераза, АСТ, альдолаза) у больных дерматомиозитом [31—33].

Иммунологическими методами выявляют:

— общий IgE в сыворотке крови больных атопическим дерматитом (иммуноферментный анализ, ИФА);

— специфические IgE/IgG4-антитела к пищевым, бытовым антигенам, антигенам растительного, животного и химического происхождения, определяемые у больных атопическим дерматитом (ИФА);

— антитела к десмоглеинам 1-го и 3-го типов при пузырчатке (ИФА);

— IgG-антитела к антигенам буллезного пемфигоида (230 kD; ВРА-1; 60−180 kD; ВРА-2) (ИФА) [34—41].

Путем выявления аутоантител иммунологическими методами (ИФА, белковые микрочипы) осуществляется верификация целого ряда аутоиммунных заболеваний — СКВ, дерматомиозита, склеродермии, системных васкулитов. При этом в качестве иммунологических маркеров СКВ используют антитела к двуспиральной нативной ДНК-ss DNA, гистонам, Sm-антигену, кардиолипину, к β₂-гликопротеину 1 [42—46]. Для верификации дерматомиозита определяют антитела против цитоплазматических белков и рибонуклеиновых кислот мышечной ткани (к аминоацетилсинтетазам т-РНК, Jо-1-синтетазам, к Mi-2, к фактору I-а, к SRP-антигену) [47]. Маркерами склеродермии считаются антитела к центромере В и топоизомеразе I (Scl-70) [48—51].

Системные васкулиты верифицируют с помощью определения антител к нейтрофильным цитоплазматическим (с-ANCA) и перинуклеарным (p-ANCA) антигенам, в том числе определяют антитела против миелопероксидазы (MPO) и сериновой протеазы из а-гранул нейтрофилов (PR3) [52—55] (табл. 2).

Имеются разработки в области высокочувствительной детекции белков с использованием протеомного анализа кожи, сыворотки крови и интерстициальной жидкости, которые позволили выявить до 21 кандидатного белка при псориазе (в том числе squamous cell carcinoma antigen-2, cytokeratin 14, 17, glutathione S transferase, heat shock protein 27, RhoGDP-dissociation inhibitor 1 и др.) [56], до 46 кандидатных белков при атопическом дерматите (в том числе NCC27) [57], до 185 кандидатных белков при хронической экземе кожи рук, относящихся в основном к барьерным белкам — filaggrin (FLG), FLG-2, hornerin; антимикробные пептиды S100A7 и S100A8/A9, малый пролиновый белок 2B и S100A11 и т. д. [58].

Для верификации дерматозов могут применяться методы молекулярного анализа — полимеразная цепная реакция (ПЦР), в том числе в режиме реального времени, технологии гибридизации (ДНК-чипы; качественный, количественный анализ: экспрессионые биочипы), технологии секвенирования: от секвенирования по Сенгеру до секвенирования нового поколения — NGS (Next generation sequensing). Эти методы обладают целым рядом преимуществ, таких как высокая информативность, быстрота выполнения исследований, относительно малая инвазивность (исследуется кровь или отпечаток со слизистой оболочки щеки), возможность одновременного исследования совокупностей генов, локусов, проведения полногеномного секвенирования.

С использованием молекулярных методов (ПЦР) определяется клональность Т-лимфоцитов (по генам g- и β-цепей Т-клеточного рецептора) и В-лимфоцитов (по генам тяжелой цепи иммуноглобулинов IgH) с целью проведения дифференциальной диагностики опухолевой (лимфома кожи) и реактивной пролиферации лимфоцитов (парапсориаз, псевдолимфомы кожи и т. д.). При этом выявление моноклонального типа пролиферации свидетельствует о злокачественном характере заболевания [59—62].

Важным подходом к ведению больных дерматозами является своевременное выявление коморбидной патологии, которая может существенно отягощать течение основного заболевания. Для этого в настоящее время широко используют высокопроизводительные системы биохимического, гематологического, иммуноферментного, ионоселективного, атомно-адсорбционного анализа, хемилюминесценции на основе широкого внедрения процессов автоматизации. При этом наблюдается тенденция к существенному повышению аналитической чувствительности методов путем изменения пределов детекции аналитов (цептомоли — 1·10^–21; йоктомоли — 1·10^–24 на 1 л), что позволяет говорить о многосторонней «технологической революции» лабораторной аналитики [63]. В контексте возможности быстрого выявления различных видов патологии у больных дерматозами следует упомянуть о таком высокоточном многопараметрическом методе исследования, как иммуноанализ на микросферах (Microbead immunoassays — MBIA). Метод основан на использовании проточной флуориметрии микросфер из полистирола, маркированных красными и инфракрасными флуорофорами с последующей лазерной детекцией и цифровой обработкой сигнала. Изучаемыми субстратами являются сыворотка/плазма крови, экстракт биоптатов кожи, синовиальная жидкость, слюна, биологические секреты и другие жидкости организма. Предмет исследования — маркеры сахарного диабета, острой фазы, ангиогенеза, сепсиса и апоптоза, маркеры кожи (кератины-6, -1, -10, -11; инволюкрин, фибронектин), метаболизма костной ткани и углеводного обмена, цитокины (панели от 8 до 27 и более цитокинов), изотипы иммуноглобулинов, маркеры сердечно-сосудистой патологии; система определения клеточных сигналов. Кроме того, с использованием данного метода могут изучаться мутации в генах (SNP-генотипирование), белки, нуклеиновые кислоты, факторы транскрипции. Таким образом, данный метод исследования может применяться как в практическом здравоохранении, так и при проведении научных исследований.

Одним из наиболее перспективных направлений современной молекулярной медицины, опирающейся на лабораторные методы, является персонализированная, предиктивная, превентивная (предупредительная) медицина, которая изучает возможность прогнозирования заболеваний у конкретного человека на основе революционных достижений биологии ХХI века, которую называют «многомерной биологией» (high dimensional biology).

Термин «персонализированная медицина» (personalized medicine) был впервые применен K. Jain [64]. Персонализированная медицина — это интегральная медицина, включающая в себя разработку персонализированных средств лечения, тестирования на предрасположенность к болезням, профилактику, объединение диагностики с лечением и мониторингом лечения.

Методическую основу предиктивной персонифицированной медицины составляет выявление генов, определенные аллели которых предрасполагают или, наоборот, препятствуют развитию различных заболеваний. Основная методология — секвенирование (определение нуклеотидной последовательности; от лат. sequentum — последовательность) [65].

Имеющиеся в нашем распоряжении молекулярно-генетические методы позволяют изучать особенности генотипов больных и здоровых лиц на уровне фрагментов гена/генов (анализ мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов, SNP — single nucleotid polimorphism; изучение копийности фрагмента гена), исследования всего гена (полноразмерное секвенирование), генома (полногеномное секвенирование), а также изучать уровень экспрессии генов (транскриптомика).

Благодаря так называемым GWAS-исследованиям (англ. GWAS, Genome-Wide Association Studies — полногеномный поиск ассоциаций), а также более локальным исследованиям с применением методологий секвенирования к настоящему времени частично расшифрована структура генетических рисков развития: псориаза (локусы PSORS, ген TNF-А, RAGE-ген, ген IL-10; rs1800871, ген IL12B; rs7709212, ген RUNX3; rs7536201; rs1886734, гены апоптоза и медиаторов воспаления — DR4 Glu228Ala, CasplO Ile479Leu, rs 12188300 IL 12 В А/Т и TRAF3IP2 Trp74Arg; псориатического артрита — ген IL23R; rs7530511; rs11209026; ген IL12B rs3212227; rs6887695; аллель G (Arg) гена DR4 Lys441Arg и аллель Т полиморфизма rs12188300 гена IL 12 В А/Т), атопического дерматита (мутации в гене филаггрина, rs1800795 гена IL6, ген DEFB1), СКВ (гены TNFSF4, CD44, IRF8, MIR-146A, TMEM39A) [66—76].

Благодаря применению молекулярных методов исследования и технологий секвенирования к настоящему времени стала известна генетическая основа многих генодерматозов: в частности, врожденного буллезного эпидермолиза, синдрома Блоха—Сульцбергера и ряда других, что позволяет в неясных случаях верифицировать диагноз (табл. 3).

Молекулярные маркеры могут быть использованы для персонализации ранней диагностики (пример — выявление антигенов гистосовместимости HLA-B8 и HLA-DR3, сцепленных с продукцией миозитспецифических антител, при дерматомиозите), прогнозирования метастазирования злокачественных новообразований кожи — так называемая профилактическая геномика и микро РНК-омика [83—85].

Хорошо известно, что терапия дерматозов может оказывать выраженный терапевтический ответ, не оказывать клинического эффекта или вызывать развитие осложнений. Вопросы прогнозирования эффективности и безопасности терапии заболеваний изучает фармакогеномика, предметом изучения которой является полиморфизм генов, определяющий вариабельность индивидуального ответа организма человека на применение лекарственного препарата. Так, например, в отечественных и зарубежных публикациях [86—88] описана прогностическая значимость определения полиморфизма гена TNF-R-II, уровня экспрессии ряда хемокинов, их рецепторов и белка CCR9, наличия антигена HLA-Cw6 у больных псориазом в отношении эффективности терапии генноинженерными препаратами (инфликсимаб, устекинумаб и др.).

Таким образом, в настоящее время отечественная и зарубежная дерматология располагает арсеналом как традиционных, так и инновационных, инвазивных и неинвазивных методов исследований, оказывающих помощь врачам-клиницистам в верификации диагноза в неясных случаях, позволяющих осуществлять раннюю диагностику, прогнозировать течение заболеваний и фармакологический ответ на терапию. Автоматизация рутинных процедур, миниатюризация формата исследования, объединение различных модулей в интегрированные многофункциональные системы, — все это приводит к стремительному увеличению производительности биологических исследований в дерматологии и к их поднятию на качественно новый уровень.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^1,2e-mail: frigo2013@yandex.ru