Плазма (от греч. plasma — «выделенное, оформленное») — частично или полностью ионизированный газ, в котором плотности положительных и отрицательных зарядов практически одинаковы. Плазма может быть высокотемпературной (плазма звезд), ее температура превышает 105 оК, и низкотемпературной с температурой менее 105 оК; равновесной или неравновесной. При совпадении температуры ионов, электронов и нейтральных частиц плазма считается равновесной. Плазма считается низкотемпературной («холодной») в случае, если молекулы и атомы плазмообразующего газа имеют практически комнатную температуру, а электроны обладают высокой энергией [1]. Столкновение электронов в такой плазме сопровождается образованием ионов, возбужденных атомов и молекул. При этом сформированные внутри такой плазмы радикалы и другие активированные частицы обладают высокой степенью химической активности, способны излучать фотоны, что также способствует ускорению химических реакций. Созданы три принципиально различных конструкции, генерирующие низкотемпературную плазму (НТП) при атмосферном давлении: «плазменная струя» или непрямая плазма (плазма генерируется между двумя электродами, активные формы, образуемые плазмой, передаются в нужную область), «диэлектрический барьерный разряд» или прямая плазма (биологические клетки/ткани, используются как электрод; поток, направляемый плазмой, должен проходить через биологические ткани/клетки), «гибридные» (генераторы плазмы, объединяющие первые два) [2—8]. Характеристика различных НТП отражена в табл. 1. Биологически активные молекулы и частицы, генерируемые различными приборами НТП, представлены в табл. 2.
Своими физико-химическими свойствами НТП (холодная атмосферная плазма) весьма привлекательна для применения в биологии и медицине. Однако к настоящему времени механизмы биологических эффектов НТП изучены недостаточно [9]. Для уточнения механизма развития эффектов при применении различных режимов НТП были проведены многочисленные эксперименты как на культуре микроорганизмов, так и на культуре различных клеток млекопитающих. Полученные результаты позволили высказать гипотезу о механизме развития этих эффектов: холодная атмосферная плазма индуцирует изменения межклеточной жидкости с преобладанием активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА), вырабатываемых или переходящих в жидкие фазы. В результате воздействия НТП измененный окислительно-восстановительный баланс клетки влияет на метаболизм и жизнеспособность этой клетки. Путем плазменной доставки АФК и АФА НТП стимулирует или ингибирует клеточный процесс и запускает механизм, сходный с гормезисом в клетках млекопитающих (от греч. hórmēsis — быстрое движение, стремление; стимулирующее действие умеренных доз стрессоров; стимуляция какой-либо системы организма внешними воздействиями, имеющими силу, недостаточную для проявления вредных факторов; термин введен С. Зонтманом и Д. Эрлихом в 1943 г.). Ранее полученные данные показывают, что экспрессия генов и белков высоко чувствительна к воздействию холодной атмосферной плазмы и выявляют ключевую роль Nrf2 (nuclear erythroid-related factor 2) в регуляции защиты клеток от оксидативного стресса [10—13].
Одним из первых было изучено важное свойство НТП инактивировать микроорганизмы широкого спектра, в том числе с высокой множественной антибиотикорезистентностью (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, или MRSA; образующие планктонную форму и биопленку), вирусы, грибы и споры [14—23]. В многочисленных экспериментах было показано, что атмосферная плазма, имеющая температуру в точке контакта менее 40 °C и генерирующая большое количество АФК и АФА, другие ионы и радикалы, а также озон, оказывает такое же бактерицидное действие, как и стандартные антимикробные препараты, до 3—5 log10. В начале антимикробный эффект НТП был исследован в отношении различных антибиотико-чувствительных и антибиотико-резистентных штаммов микроорганизмов. Было показано, что Staphylococcus aureus, MRSA или Escherichia coli погибают в зависимости от длительности воздействия НТП. Получено значимое уменьшение числа колоний (CFU мл–1 снизилось 3 log10 для S.aureus [D-value = 3,7 мин] и E. coli [D-value = 3,71 мин]) после 6 мин воздействия НТП. При увеличении длительности воздействия до 15 мин бактерицидное действие существенно возрастало. При воздействии НТП в течение 8 мин бактерицидное действие достигало и превышало 5 log10 (99,999% первоначально нанесенных микроорганизмов было уничтожено) для обоих микробных штаммов. При воздействии НТП на штаммы MRSA (BAA-44 и atcc 43300) в течение 4 мин бактерицидное действие составляло 3 log10 (99,9%), в течение 8 мин — 5 log10 (99,999%). При анализе антимикробной эффективности различных генераторов НТП оказалось, что лучший бактерицидный эффект в отношении грамположительных микроорганизмов был получен при использовании DBD* технологии, в отношении грамотрицательных микроорганизмов технология генерации плазмы «плазменная струя» была более эффективна. Вместе с тем степень деколонизации зависела и от длительности воздействия НТП [23]. Аналогичный эффект был показан для различных штаммов Pseudomonas aeruginosa, а также для различных видов грибов, спор и вирусов (вирус простого герпеса, цитомегаловирус, аденовирус) [24—27]. M. Lee и соавт. [28] показали, что при воздействии холодной атмосферной плазмы в течение 20 с полностью удалятся биопленка микроорганизмов как грампозитивных, так и грамнегативных, рост микробного планктона в биопленке ингибируется в течение 5 с. Аналогичные результаты были получены и при использовании генераторов НТП типа «плазменная струя» с потоком гелия или аргона [29—31].
В ходе изучения действия НТП на различные штаммы микроорганизмов стало известно, что бактериальная клетка подвергается воздействию на различных клеточных уровнях: наружная клеточная мембрана (etching), внутренняя клеточная мембрана (локальное повреждение за счет перекисного окисления липидов), цитоплазматические белки (окислительное повреждение белков, unfolding amino acid modification), РНК (разрыв нитей РНК), ДНК (окислительное повреждение ДНК, модификация оснований, образование димеров тимина, разрыв цепей), что приводит к ее гибели [25, 29, 32]. S. Kalghatgi и соавт. [33] провели исследования по изучению взаимосвязи интенсивности НПТ (доза энергии, которую «холодная» плазма передает биологическим тканям) и ее воздействия на клетки млекопитающих. Результаты показали, что воздействие НТП низкой интенсивности (не более 0,2 Дж/см2) приводит к пролиферации клеток, НТП средней интенсивности (0,2—0,6 Дж/см2) не оказывает никакого воздействия на клетки млекопитающих, а НТП высокой интенсивности (более 0,6 Дж/см2) вызывает апоптотическую гибель клеток. В экспериментах с различными клеточными линиями прокариот и эукариот было показано, что эукариотические клетки менее чувствительны к повреждающему действию НТП, и в большинстве случаев, наоборот, получали стимулирующий пролиферацию импульс [34—36]. При низкой интенсивности НТП в культуре клеток млекопитающих B. Haertel и соавт. [37—40] получили эффект пролиферации клеток и ан-гиогенеза, в то время как высокая интенсивность НТП приводила к апоптозу клеток млекопитающих, в том числе опухолевых.
Основываясь на результатах многочисленных доклинических исследований, начались интенсивные клинические исследования применения НТП в дерматологии: для ускорения процессов заживления хронических (трофические) язв, в том числе инфицированных резистентными штаммами микроорганизмов; для лечения инфекций кожи и дерматитов.
Заживление ран после травмы ткани представляет собой серию перекрывающихся и организованных процессов, начиная с гемостаза (прекращение кровопотери и образования фибринового сгустка), воспаления, пролиферации и, наконец, ремоделирования [41]. Фаза воспаления включает нейтрофилы и макрофаги. В случае заживления ран эти воспалительные клетки играют ключевую роль в высвобождении так называемых факторов роста, которые привлекают фибробласты, кератиноциты и эпителиальные клетки, способствуют формированию внеклеточного матрикса и быстрого ангиогенеза. Очевидно, что рост кровеносных сосудов необходим для обеспечения области заживления кислородом и другими питательными веществами. Раны, которые неспособны нормально заживать, называются «хроническими» и представляют значимую проблему для пациентов, страдающих ожирением и сахарным диабетом [42]. Известно, что АФК и АФА играют ключевую роль в заживлении ран в физиологических условиях [43—46]. Прежде всего они необходимы для инициации каскада гемостаза, они служат связующим звеном тканевого фактора (TF-mRNA), рекрутированием тромбоцитов и активацией тромбоцитов [46,47]. Атомарный кислород (О), гидроксильный радикал (ОН), молекула азота (N2), супероксид-анион (О2–) и оксид азота (NO) играют важную роль во взаимодействии между плазмой и клетками, что индуцирует воспаление. Известно, что H2O2 выполняет функцию второго сигнала для PDGF (platelet-derived growth factor, фактор роста из тромбоцитов), VEGF (vascular endothelial growth factor, эндотелиального фактора роста сосудов) и TGF (tissue growth factor, тканевой фактор роста) [46, 48]. Оксид азота (NO) — один из самых важных АФА, вовлеченный в процесс заживления ран (см. рисунок), за счет активации TGF-β1, усиливающий миграцию кератиноцитов, образующих кератиновый слой под эпидермальным, а также путем активации сигнального пути MAPK, вовлеченного в процессы воспаления (в том числе пролиферации), важны для заживления ран [34, 37, 44, 46, 49—52] (см. рисунок).
Исследования на культуре клеток подтверждают гипотезу о том, что воздействие НТП на раневую поверхность не только резко уменьшает колонизацию раневой поверхности микроорганизмами, но и оказывает прямое действие на клетки эпидермиса и дермы. A. Shashurin и соавт. [53] с использованием культуры фибробластов показали, что адгезия и миграция фибробластов сокращается на половину после 5-минутного облучения НТП, при этом отмечается снижение интегринов a и b (10 и 20% соответственно). Результаты последующих исследований, выполненных на модели раны, продемонстрировали эффект заживления (закрытие искусственной раны фибробластами) после воздействия НТП в течение 5—15 мин без видимого цитотоксического эффекта существенно быстрее, чем без воздействия НТП. Улучшение способностей фибробластов к пролиферации и миграции может быть связано с активацией γ-рецептора, опосредованного повышением количества внеклеточных АФК [54, 55]. Результаты исследования эффектов воздействия НТП на клетки эпидермиса (кератиноциты и меланоциты) и дермы (фибробласты) показали, что воздействие в течение 2 мин не сопровождалось цитотоксичностью или апоптозом, в то время как более низкая или более высокая интенсивность воздействия, достигаемая за счет меньшего или большего времени воздействия НТП, стимулируют или ингибируют миграцию фибробластов и пролиферацию фибробластов и кератиноцитов соответственно [55, 56]. K. Wende и соавт. [56] оценивали 40-секундное воздействие НТП in vitro в культуре кератиноцитов человека, заселенных эпидермальным стафилококком. Оказалось, что бактериальная нагрузка и уменьшение искусственной раны были лучше после воздействия НТП по сравнению с контрольными культурами клеток. S. Amdt и соавт. [57] отметили повышение экспрессии матричной РНК Il-8, TGB-β1/TGB-β2 и β-дефензина через 24—48 ч после воздействия на кератиноциты НТП в течение 2 мин. Результаты, полученные S. Hasse и соавт. [58], продемонстрировали усиление пролиферации клеток базального слоя после 1—3 мин воздействия при отсутствии изменений целостности эпидермиса, индукцию апоптоза только при воздействии НТП в течение более 3—5 мин.
Использование НТП в клинике привело к сокращению времени эпителизации ран вне зависимости от причины их появления, в том числе массивно инфицированных антибиотико-резистентными штаммами микроорганизмов (например, MRSA и образующими биопленки) (табл. 3) [36, 51, 52, 59—62].
Хорошие результаты, полученные при использовании НТП в лечении хронических язв, заставили исследователей рассмотреть возможность включения НТП в стандартную терапию других заболеваний кожи. Так, G. Isbary и соавт. [63] в 2011 г. опубликовали результаты, полученные при использовании аргон-НТП в лечении редкого заболевания — болезни Хейли—Хейли. Это редкое аутосомно-доминантное состояние, развивающееся в результате мутации ATP2C1 гена, кодирующего секреторный путь Ca2+/Mg2+ АТФ-азы), расположенного на хромосоме 3q21.1. Заболевание гистологически характеризуется супрабазальным акантолизом, приводящим к мокнущим эрозиям в складках. В жаркие месяцы пот и трение агравируют проявления, часто очаги поражения инфицируются. Авторы показали, что обработка очагов поражения в течение 5 мин (всего было проведено четыре сеанса) привела к выраженному улучшению (исчезновение мокнутия, зуда, уменьшении инфильтрации и гиперемии).
Изучая антисептическое действие НТП в лечении инфекций волосяного фолликула, O. Lademann и соавт. [64] убедительно доказали, что НТП способна оказывать антисептический эффект не только на поверхности кожи, но и непосредственно в волосяном фолликуле.
Предположение о противозудном эффекте НТП послужило поводом для исследования эффективности и безопасности применения аргон-НТП в составе стандартной терапии зуда. J. Heinlin и соавт. [65] в 2013 г. опубликовали результаты такого исследования. В работу были включены 46 пациентов с различными зудящими дерматозами, из них 40 с острым зудом и 6 с хроническим (в качестве контроля использовали тех же пациентов, но в составе терапии использовали обычный аргон). Интенсивность зуда оценивали по визуальной аналоговой шкале. До лечения у всех больных интенсивность зуда составила 4,57 балла (получали аргон-НТП) и 4,34 балла (получали обычный аргон). У пациентов, получавших аргон-НТП в составе стандартной терапии, краткосрочный эффект составил в среднем 1,97 балла по визуально-аналоговой шкале, долгосрочный эффект — 1,92 балла. У пациентов, получавших воздействие обычным аргоном, краткосрочный и долгосрочный эффект составили 1,74 и 1,97 балла соответственно. В исследовании не выявлено значимой разницы между источниками аргона (НТП или обычный газ), но вместе с тем показано существенное снижение интенсивности зуда.
В 2014 г. M. Klebes и соавт. [66] представили результаты пилотного исследования с участием шести больных (27—55 лет) с бляшечной формой вульгарного псориаза, которым в составе наружной терапии использовали аргон-НТП. Исследователи использовали три терапевтических протокола: А — воздействие НТП (1 мин/см2 на одну бляшку) 3 раза в неделю на фоне местной терапии (5% салициловая мазь + солевые ванны, 4,17% натрия хлорид, раствор Фумазола по 15 мин, 5 дней в неделю); В – только местная терапия; С — местная терапия, УФ-облучение (UVB) и дитранол в возрастающих концентрациях 5 дней в неделю в течение 1 ч (начальная доза 1/16—1/8%), при хорошей переносимости длительность воздействия увеличивалась до 2 ч; в последующие дни концентрация и длительность аппликации дитранола повышалась — ¼, ½, 1, 2, 3 и 4% до максимальной концентрации 5% и максимальной длительности 2 ч. Отмечено, что у всех пациентов отмечалось снижение PASI в течение 2 нед на 75%. Размер бляшек уменьшился на 13% в лечебной группе А, незначительное увеличение (0,9%) бляшек отмечено в лечебной группе В, уменьшение размера бляшек в лечебной группе С было аналогично таковому в лечебной группе А. Значимое уменьшение гиперемии и инфильтрации псориатических бляшек было отмечено только в лечебных группах, А и С. Микробная колонизация значимо снижалась только в лечебной группе, А при исследовании сразу после воздействия НТП и значимо не отличалась при отсроченном исследовании. Исследователи предположили, что НТП уменьшает воспалительный процесс, угнетает ангиогенез в псориатических бляшках, снижая метаболические требования сниженной пролиферации кератиноцитов. Вместе с тем авторы отметили, что схожий эффект в лечебных группах, А и С был достигнут при разной интенсивности воздействия: в группе, А — интенсивность НТП составила 105±15 мкДж/см2, в группе С интенсивность воздействия UVB — 0,1—0,3 Дж/см2, что позволило высказать предположение о возможно большей эффективности НТП при использовании равной интенсивности воздействия.
Заключение
Воздействие НТП оказывает мощный бактерицидный эффект в отношении антибиотико-резистентных штаммов MRSA, образующих биопленку или биопланктон миокроорганизмов, при инфекционной патологии в волосяных фолликулах. Эксперименты в культуре тканей и на животных выявили способность НТП вызывать как пролиферацию различных клеток, так и их апоптоз в зависимости от интенсивности воздействия. Глубинные механизмы действия НТП до сих пор остаются до конца не ясными, не расшифрованы все механизмы участия, образующихся при действии НТП АФК и АФА на клеточные сигнальные пути. Однако уже известные эффекты НТП и доказанная безопасность ее применения у человека позволяют широко использовать ее в клинической практике.
Короткий В.Н. — http://orcid.org/000−0002−6502−1596
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
*DBD — dielectric barrier discharge – диэлектрический барьерный разряд.