Применение различных методов детекции процессов перекисного окисления липидов в дерматологии

Повышение качества медицинской помощи требует совершенствования методов диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний. В этой связи особое значение приобретает изучение молекулярных механизмов патологических реакций, которые предшествуют и служат основой развития многих заболеваний [1].

Практически при всех патологических состояниях изменяются интенсивность и скорость образования свободных радикалов, что позволяет отнести это явление к общим неспецифическим проявлениям болезни или даже предболезни [2].

В физиологических условиях интенсивность процессов свободно-радикального окисления регулируется сложной многоступенчатой системой, состоящей из ферментативных и неферментативных звеньев. Нарушение стационарного состояния этой системы и развитие патологического течения свободно-радикального окисления (СРО) могут быть одним из важных патогенетических факторов возникновения ряда дерматозов [3].

Среди прочих факторов патогенеза атопического дерматита, псориаза, красного плоского лишая, пузырчатки определенную роль играют процессы СРО [4—8].

Усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) свидетельствует о гипоксии организма, сопровождающей синдром эндогенной интоксикации.

Показано, что эндогенная интоксикация может приводить к изменению структурно-функциональных характеристик клеточных мембран, нарушению их проницаемости, необратимому повреждению [9].

Перечень и описание биохимических и физико-химических методов изучения продуктов ПОЛ и определения содержания или активности антиоксидантов очень велик: йодометрический метод определения пероксидных групп, тиобарбитуровый метод, метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных жирных кислот, а также ряд биохимических методов определения активности ферментов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, каталазы). Однако каждый из этих методов не может в целом охарактеризовать состояние окислительного гомеостаза. С этой целью используют спонтанную (СХЛ) или индуцированную различными факторами хемилюминесценцию (РХЛ — рентгено-хемилюминесценция, ТХЛ — термохемилюминесценция, сопровождающаяся выделением большого количества тепла, ФХЛ — фотохемилюминесценция, ЭХЛ — электрохемилюминесценция, возникающая при поляризации ион-радикалов, образующихся во время электролиза раствора активатора, например, изобензофуран, изоиндол и другие) [4, 10] (см. таблицу).

Наиболее информативной является СХЛ, характеризующая положение окислительного равновесия, константное в норме и наиболее быстро из существующих показателей реагирующая на его сдвиги [10].

Доказательством связи СРО с хемилюминесценцией (ХЛ) служит параллелизм между накоплением метаболитов и продуктов СРО и ПОЛ и интенсивностью сверхслабого свечения [11]. Интегральным показателем состояния СРО в биологических жидкостях может служить общая антиокислительная активность.

Измерение хемилюминесценции сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа (Fe²⁺) является методом оценки состояния ПОЛ в крови [12]. Так как обнаружено, что у пациентов, страдающих хроническими дерматозами, в частности псориазом, высок риск кардиоваскулярной патологии, а тяжелый псориаз (в том числе псориатический артрит) и молодой возраст при первой госпитализации ассоциируются с повышенным риском кардиоваскулярной смертности, пристальное внимание исследователей привлекает изучение состояния ПОЛ в составных частях сыворотки крови, в частности, в атерогенных липопротеидах (ЛП) — ЛП низкой и очень низкой плотности (соответственно ЛПНП и ЛПОНП) [15, 16].

Сыворотку крови получают путем центрифугирования в течение 15 мин при 2400 g. ЛП сыворотки крови выделяют осаждением в присутствии гепарина и CaCl₂. К 2 мл 15 мМ раствора CaCl₂ добавляют 0,2 мл сыворотки крови и 0,04 мл 1% раствора кристаллического гепарина. Пробирку осторожно встряхивают. Образовавшуюся суспензию через 5 мин инкубации при комнатной температуре центрифугируют в течение 5 мин при 2000 g. Надосадочную жидкость, состоящую из липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и белков, удаляют пипеткой в отдельную пробирку. Осадок представляет собой суммарную фракцию ЛПНП и ЛПОНП [13, 14].

Полученную суспензию ЛПНП+ЛПОНП (или ЛПВП+белки) в количестве 200 мкл или цельную сыворотку крови в количестве 100 мкл помещают в кювету хемилюминесцентной установки, добавляют 200 мкл фосфатного буфера (20 мМ КH₂PO₄, 10 мМ KCl pH=7,4). Для инициации ХЛ вводят 50 мкл FeSO₄·7H₂О, на 7-м цикле вводят 100 мкл 3% H₂O₂ [14, 16]. Регистрируют Х.Л. в течение 20 циклов с помощью одного из разновидностей хемилюминографов — биохемилюминометра 3606 М (рис. 1).

При оценке хемилюминограмм учитывают интенсивность быстрой вспышки (I б.в.), которая зависит от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов; светосумму медленной вспышки (S св., оценивает число новых цепей разветвления, т. е. сколько образовавшихся перекисных радикалов ROO* приходится на Fe²⁺); тангенс подъема (tg под.), определяющий скорость окисления липидов [13] (рис. 2). Также показано, что при изучении хемилюминесценции суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП интегративный показатель Н, равный отношению светосуммы S к интенсивности быстрой вспышки I б.в., у пациентов, страдающих псориазом, достоверно выше, чем у здоровых доноров [14].

По сравнению с другими методами детекции свободных радикалов хемилюминесцентный метод является наиболее информативным, позволяющим оценивать кинетику окисления.

Таким образом, к преимуществам хемилюминесцентного метода исследования можно отнести: 1) возможность получения бесконтакной информации о нативном состоянии, функционировании и метаболизме клеток, тканей, биологических жидкостей; 2) возможность непосредственного исследования кинетики окислительных реакций, развивающихся под влиянием физиологических и патологических агентов; 3) высокую чувствительность, позволяющую регистрировать микроколичества биологически активных соединений, не определяемых другими методиками [17].

Техника регистрации ХЛ проста, не требует существенных временных затрат (занимает не более 5—10 мин), равно как и специальной подготовки обследуемого, может использоваться как скрининговый экспресс-метод нарушений липидного обмена при хронических дерматозах.

Конфликт интересов отсутствует.