Инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), относятся к социально-значимым. Наиболее важная роль в развитии репродуктивной патологии отводится облигатно-патогенным микроорганизмам — Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis. В последние годы получены доказательства роли инфекции, вызванной Mycoplasma genitalium (МгИ), в развитии уретрита у мужчин, цервицита и воспалительных заболеваний малого таза (ВЗОМТ) у женщин [1].

Как в отечественных, так и в зарубежных руководствах для диагностики ИППП — хламидийной (ХИ), гонококковой (ГИ), трихомонадной (ТИ) инфекций, — а также МгИ, рекомендован набор лабораторных тестов, включая молекулярно-биологические методы (МБМ) [2—6]. Различные методы диагностики имеют разные показатели чувствительности/специфичности, наиболее высокие из которых у МБМ. В ряде зарубежных рекомендаций указывается, что при использовании для диагностики ХИ и ГИ метода амплификации нуклеиновых кислот для подтверждения его результатов некорректно использовать метод, обладающий более низкой чувствительностью, например методы прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), бактериоскопии, микроскопии (МС) и даже КП (культуральный посев). В этих случаях рекомендовано использование другого МБМ, направленного на выявление иной генетической мишени или типа нуклеиновой кислоты [7, 8]. За рубежом разработано и коммерчески доступно несколько технологий, таких как:

— ПЦР (выявление ДНК возбудителей ИППП) — Roche Amplicor (manufactured by Roche Diagnostics Corporation, Basel, Switzerland), Abbott RealTime CT/NG («Abbott Laboratories», Abbott Park, Illinois);

— SDA (выявление ДНК) — Becton Dickinson BDProbeTec ET (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey);

— ТМА (выявление РНК) — Gen-Probe APTIMA (Gen-Probe, Incorporated, San Diego, California).

Однако их использование в алгоритме обследования ограничивается высокой стоимостью каждой из технологий, разными платформами амплификации и протоколами. К тому же они недоступны для российского рынка. В нашей стране разработаны и промышленно выпускаются наборы реагентов на основе ПЦР, а также наборы реагентов для выявления РНК возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis) и M. genitalium — НАСБА (NASBA, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) в реальном времени.

Особенностью технологии НАСБА является то, что мишенью служат многокопийные молекулы рибосомальной РНК. Количество копий рибосомальной РНК в живых клетках бактерий или простейших может достигать от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч, что обеспечивает возможность обнаружения возбудителя даже при его минимальной концентрации в образце биоматериала [9, 10]. Использование в качестве мишени для НАСБА видоспецифических участков рибосомальной РНК обеспечивает методу высокую специфичность. Другой особенностью методики является то, что РНК — менее стабильный по сравнению с ДНК тип генетического материала, который быстрее деградирует при разрушении клеток, поэтому на основании результатов выявления РНК можно судить о наличии в образце жизнеспособных микроорганизмов, например, после проведенного лечения [11, 12]. С практической точки зрения важно, что для проведения НАСБА в лабораторных условиях используется то же оборудование, что и для проведения ПЦР в реальном времени. Кроме того, исходный биоматериал после ПЦР может исследоваться методом НАСБА. В результате этого существует возможность интегрирования указанного метода в протокол лабораторного обследования, что позволит верифицировать возбудителя.

Цель настоящего исследования — разработка алгоритма лабораторного обследования пациентов для выявления N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium с использованием методов ПЦР и НАСБА.

В исследовании были использованы наборы реагентов марки Амплисенс производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Для выявления ДНК N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium был использован тест на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени АмплиСенс N. gonorrhoeae/C. trachomatis/M. genitalium/T. vaginalis — МУЛЬТИПРАЙМ-FL, позволяющий в процессе реакции амплификации выявлять ДНК указанных микроорганизмов одновременно. Для определения РНК данных возбудителей были использованы наборы реагентов на основе метода НАСБА АмплиСенс Neisseria gonorrhoeae — РИБОТЕСТ, АмплиСенс Chlamydia trachomatis — РИБОТЕСТ, АмплиСенс Trichomonas vaginalis — РИБОТЕСТ и АмплиСенс Mycoplasma genitalium — РИБОТЕСТ. Все наборы прошли клинические испытания, имеют регистрационные удостоверения и разрешены для применения в лабораторной практике в России.

Для разработки алгоритма лабораторного исследования была проведена оценка диагностических характеристик используемых наборов реагентов на основе методов ПЦР и НАСБА в сравнении с другими методами диагностики — МС, ПИФ, КП.

Разработанный алгоритм был апробирован при ретроспективном тестировании образцов биологического материала, полученных от пациентов, обратившихся в разные филиалы Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии в 2012 г., где были выявлены N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium методами ПЦР, БС и КП в зависимости от назначенного врачом метода лабораторной диагностики. Более детально характеристика групп пациентов и результаты планового и ретроспективного лабораторного обследований описаны в работе В.И. Кисиной и соавт. [13]. Образцы, в которых одним из методов были обнаружены N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium, хранились при температуре –20 °С до проведения текущего исследования методом НАСБА с использованием соответствующих наборов РИБОТЕСТ с целью выявления РНК указанных микроорганизмов.

В общей сложности, в рамках разработанного алгоритма методом НАСБА было протестировано 259 образцов, из которых в 41 образце было показано наличие N. gonorrhoeae методами ПЦР и выявление диплококков при использовании БС; в 55 образцах была обнаружена T. vaginalis методами ПЦР и МС; в 103 образцах и в 60 образцах были обнаружены соответственно C. trachomatis и M. genitalium методом ПЦР.

Сравнительный анализ возможностей ПЦР, НАСБА и других методов диагностики ГИ, ХИ, МгИ и ТИ.

По результатам предыдущих исследований, в том числе международных, нами был проведен сравнительный анализ чувствительности и специфичности используемых в данном исследовании МБМ (ПЦР и НАСБА) и традиционных (КП, МС, ПИФ) методов диагностики ИППП, применяемых в кожно-венерологической службе [14—22]. Результаты представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, при выявлении инфекций, вызванных N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium, МБМ ПЦР и НАСБА обладают самой высокой чувствительностью и специфичностью, приближающимися к 100%. Чувствительность традиционных методов диагностики варьирует в широком диапазоне, но значительно ниже, чем у ПЦР и НАСБА.

При манифестной гонококковой инфекции у мужчин чувствительность МС и КП достаточно высокие и достигают 91,7 и 98,9% соответственно. Однако у женщин даже при наличии выраженных клинических симптомов чувствительность МС находится в пределах 36,2%, а КП — до 89,7% [14]. При этом на качество культивирования серьезное влияние оказывают как тип и техника получения биоматериала, так и качество сред, в результате чего чувствительность культурального посева может снижаться до 50% [15, 16]. Чувствительность методов ПЦР и НАСБА, по результатам независимых исследований, в меньшей степени зависит от типа биоматериала и пола пациентов. Для ПЦР она определена в пределах 98,9—100%, для НАСБА — 90—100% [16, 22].

Для диагностики ХИ наиболее доступным и распространенным в учреждениях дерматовенерологического профиля методом до 2008 г. оставался ПИФ. Так, его использовали 94% лабораторий [23]. Однако основной проблемой метода является субъективность при интерпретации результатов [24]. В исследовании Е.В. Ширшовой [21] было показано, что одни и те же результаты ПИФ в интерпретации двух независимых специалистов в большинстве случаев выглядели по-разному и имели высокий процент несовпадений как по положительным результатам, так и по отрицательным. Итоговое значение чувствительности метода ПИФ составило 33%, а специфичности — 77,1%. При этом совпадение результатов, выполненных методами ПЦР и НАСБА, составило 100% случаев [21]. В исследовании, проведенном Е.В. Шипицыной и соавт. [19], метод культивирования хламидий в культуре эукариотических клеток при специфичности 100% имел чувствительность 78,4%. Это согласуется с результатами исследования C. Black и соавт. [25], в котором чувствительность метода культивирования хламидий составила 74,7%. В настоящее время клинические рекомендации (как российские от Российского общества дерматовенерологов и косметологов РОДВиК 2012 г., так и зарубежные) по диагностике и лечению пациентов с ХИ не рекомендуют метод ПИФ к практическому применению для диагностики этой инфекции. Показатели чувствительности МБМ (ПЦР и НАСБА) для диагностики ХИ с использованием наборов разных российских производителей по результатам международной валидации составили от 89,7 до 100% [18, 19, 26].

Для диагностики инфекции, вызванной M. genitalium, в настоящее время МБМ являются безальтернативными из-за крайне малых размеров микроорганизма и трудностей культивирования. Культивирование M. genitalium в специальных условиях занимает до 50 сут [27]. Определенная в результате сравнительных с другими вариантами МБМ чувствительность ПЦР и НАСБА находилась в пределах от 80 до 95,1%.

Для диагностики ТИ (так же, как и ГИ) наиболее широко в нашей стране используется микроскопический метод диагностики. Трихомонады довольно крупные микроорганизмы и хорошо видны при бактериоскопии. Их бактериоскопическая идентификация проводится на основании формы и размеров клеток, часто эксцентрично расположенного ядра, вакуолизированной цитоплазмы и наличия жгутиков. Однако в биологическом материале присутствует много клеточных элементов (клетки эпителия влагалища и их предшественников — парабазальных клеток, макрофагов, лейкоцитов, клеток-предшественников сперматогенеза — сперматоцитов), сопоставимых по размеру и клеточной морфологии с клетками трихомонад, которые можно принять за простейшие [28]. Это приводит к ложноположительным результатам МС. В работе Е.В. Шипициной и соавт. [18] при изучении 16% образцов методом бактериоскопии был получен «сомнительный» результат. В зарубежных работах чувствительность МС определена в пределах 30—70% [29—33]. КП при диагностике ТИ требует длительного культивирования (до 7—9 сут), особенно для исключения трихомонадной инфекции. К тому же трихомонады весьма требовательны к питательным средам и температурному режиму. В среднем чувствительность КП, по результатам зарубежных исследований, составляет 60—95% [29—33]. При несоблюдении этих условий чувствительность КП может быть невысокой — 54,5% [18].

В зарубежных исследованиях показано, что МБМ на сегодня обладают самой высокой чувствительностью и специфичностью при диагностике ТИ — от 85 до 100% [29—33]. Достигается это благодаря тому, что генетические мишени, которые выявляются МБМ, присутствуют в геноме во множестве копий, поэтому возможно выявление даже единичных клеток. При прямом сравнении МС, КП и МБМ было показано, что ПЦР и НАСБА позволяют определять трихомонады в значительно более низких концентрациях, чем с помощью МС и КП [18, 20].

Таким образом, у значительного числа пациентов, инфицированных какими-либо из указанных возбудителей, традиционные методы (МС, ПИФ, КП) не позволяют выявить инфекцию, а использование в комбинации с ними МБМ приводит к появлению у определенного числа несовпадающих результатов, что создает проблему окончательного установления диагноза. Возникает проблема подтверждения наличия или отсутствия инфекции с учетом перечисленных особенностей всех методов диагностики. Согласно зарубежным рекомендациям, при использовании какого-либо из МБМ, основным из которых в нашей стране является метод ПЦР, некорректно в качестве второго метода диагностики использовать методы с меньшей чувствительностью (ПИФ, МС, КП). Правильным является использование альтернативного МБМ, направленного на выявление другой генетической мишени или типа нуклеиновой кислоты [7, 8]. В этом отношении в роли подтверждающего теста мог бы выступать метод НАСБА, чувствительность которого, как показано выше, совпадает с ПЦР и выше, чем у традиционных тестов.

На рисунке представлен алгоритм лабораторного обследования пациентов для диагностики инфекций, вызванных N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis на основе методов ПЦР и НАСБА. Предложенный алгоритм предполагает использование метода ПЦР в качестве основного скринингового метода диагностики ИППП, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью. Анализ результатов ПЦР проводится с учетом анамнеза заболевания, анамнеза жизни, эпидемиологического и сексуального анамнезов и результатов оценки объективных симптомов заболевания.

При обнаружении ДНК указанных возбудителей на фоне клинической картины урогенитальной инфекции (уретрит у мужчин, цервицит, вагинит, наличие патологических влагалищных выделений у женщин), смены полового партнера без использования барьерной контрацепции, наличии многочисленных половых партнеров, диагноз инфекции можно считать установленным, и подтверждение наличия возбудителя методом НАСБА не требуется.

У пациентов без жалоб, симптомов и риска инфицирования ИППП при наличии ДНК возбудителей целесообразно исходный биоматериал исследовать методом НАСБА на наличие РНК выявленных микроорганизмов. В этом случае обнаружение и ДНК, и РНК микроорганизмов является основанием для установления диагноза соответствующей инфекции даже при отсутствии субъективных клинических проявлений инфекции. Если же РНК возбудителя не обнаружена (при отсутствии симптомов и повышенного содержания лейкоцитов), это свидетельствует об отсутствии жизнеспособных микроорганизмов и может трактоваться как отсутствие инфекции.

Если при первичном обследовании методом ПЦР ДНК возбудителей не обнаружена, но при этом имеются клинические признаки инфекции или положительные результаты других лабораторных тестов, то для уточнения диагноза целесообразно применение метода НАСБА. Наличие РНК возбудителя при отсутствии детектируемой ДНК может быть свидетельством низкой концентрации возбудителя в образце, не детектируемой методом ПЦР. Положительные результаты традиционных лабораторных тестов (МС, ПИФ и КП) в отсутствии РНК и ДНК возбудителей следует рассматривать как ложноположительные.

Применение метода НАСБА при получении отрицательного результата ПЦР у пациентов без симптомов и клинических проявлений инфекции нецелесообразно по экономическим соображениям.

Предлагаемый алгоритм был апробирован при ретроспективном исследовании образцов биоматериала, полученного от пациентов и исследованного разными методами. Первичное обследование пациентов при диагностике ГИ и ТИ проводилось с использованием методов ПЦР и МС [13]. Результаты исследования с использованием метода НАСБА представлены в табл. 2.

У мужчин методом ПЦР ДНК N. gonorrhoeae была выявлена у 31 пациента. Только у 14 из них при МС мазка из уретры были обнаружены внутриклеточно расположенные грамотрицательные диплококки и высокое содержание лейкоцитов (5 и более в поле зрения), что позволило этим пациентам поставить диагноз гонореи. У остальных 14 пациентов ДНК N. gonorrhoeae обнаруживали на фоне лабораторных признаков уретрита, т. е. повышенного содержания лейкоцитов (5 и более в поле зрения), а у 3 больных — при нормальном уровне лейкоцитов в мазке из уретры (менее 5 в поле зрения). Среди обследованных женщин ДНК N. gonorrhoeae методом ПЦР была выявлена у 10 пациенток, и у всех из них МС не выявила наличие внутриклеточно расположенных грамотрицательных диплококков. Ретроспективное исследование образцов методом НАСБА позволило установить наличие РНК во всех образцах, полученных от женщин, и в 30 (из 31) — от мужчин, в которых присутствовала ДНК N. gonorrhoeae. Один из мужчин с отрицательными результатами НАСБА не имел клинических проявлений инфекции и лабораторных признаков уретрита. Случаев, когда обнаруживались грамотрицательные диплококки на фоне отрицательных результатов ПЦР, зафиксированы не были ни среди мужчин, ни среди женщин.

У мужчин ДНК T. vaginalis была выявлена у 16 пациентов, при этом результаты МС были отрицательными. Еще у троих пациентов, наоборот, сообщалось о выявлении T. vaginalis в МС, при этом ДНК T. vaginalis не обнаруживалась.

Среди обследованных женщин ДНК T. vaginalis обнаружена у 39 пациенток. Из них при МС исследовании T. vaginalis была обнаружена у 12 женщин, у 17 — при наличии ДНК T. vaginalis результаты МС были отрицательными. У 10 больных результаты МС отсутствовали.

Тестирование образцов с помощью реакции НАСБА подтвердило наличие РНК у всех мужчин с положительными результатами МС, у которых обнаруживалась ДНК T. vaginalis. У 3 мужчин с положительными результатами МС и отрицательными результатами ПЦР НАСБА не выявила РНК простейших, что в итоге позволило считать результаты МС ложноотрицательными. У женщин с отрицательными результатами МС только в одном из 17 образцов при наличии ДНК не было обнаружено РНК T. vaginalis. Еще один образец, в котором не содержалась РНК T. vaginalis, был получен от женщины, для которой данных по МС предоставлено не было.

Исследование ПЦР на C. trachomatis назначали большинству пациентов, обратившихся к врачу-дерматовенерологу. С помощью разработанного алгоритма верификацию диагноза ХИ проводили 47 женщинам и 56 мужчинам с обнаруженной методом ПЦР ДНК C. trachomatis. Только у двоих пациентов — одного мужчины и одной женщины — не была обнаружена РНК C. trachomatis. Больные не предъявляли жалоб и не имели симптомов инфекции, а обратились к врачу с целью профилактического обследования. При этом один из пациентов отметил, что принимал доксициклин до момента обследования с профилактической целью. У остальных пациентов методом НАСБА была выявлена РНК C. trachomatis.

ДНК M. genitalium методом ПЦР была обнаружена у 46 мужчин и 14 женщин. При ретроспективном исследовании образцов методом НАСБА РНК M. genitalium не была обнаружена лишь у одного мужчины. Клинические данные по этому пациенту отсутствовали.

Применение предложенного алгоритма позволило установить наличие инфекции на основании обнаружения методами ПЦР и НАСБА двух типов нуклеиновых кислот — ДНК и РНК, присутствующих в жизнеспособных клетках возбудителей. Это обеспечило правомочность установления диагноза, даже если другие методы, в частности МС, дали отрицательные результаты.

Были получены несколько результатов, когда при наличии ДНК возбудителя его РНК, тем не менее, не была обнаружена. Возможны следующие причины. Большинство пациентов, при исследовании материалов которых результаты НАСБА были отрицательными, не имели симптомов инфекции. Тестирование образцов методом НАСБА проводилось ретроспективно, после длительного хранения и, несмотря на то что хранение проводилось в замороженном состоянии, в процессе исследования образцы подвергались неоднократному замораживанию и размораживанию, в результате чего могло произойти разрушение клеток микроорганизмов и деградация РНК. Нельзя исключить, что некоторые пациенты принимали антибактериальные препараты на этапе, предшествующем обращению к врачу, что также могло привести к потере жизнеспособности возбудителей и деградации РНК. Наконец, нельзя исключить ложноположительные результаты ПЦР в результате контаминации инфицированным биоматериалом образцов с неинфицированным, ошибок лабораторного и медицинского персонала.

До настоящего времени в нашей стране обследование на ИППП осуществляется в разных профильных учреждениях в соответствии с уровнем знаний, квалификации и собственного опыта отдельных специалистов. Не разработаны единые для всех специалистов (дерматовенерологи, акушеры-гинекологи, урологи и др.) алгоритмы ведения больных с ИППП, а значительное число рутинных лабораторных исследований, обладающих низкой чувствительностью и специфичностью, все еще используются в клинической практике. Вместе с тем в последние годы в нашем распоряжении появились новые высокоэффективные методы лабораторной диагностики, которые, хотя и с некоторым опозданием, появляются в документах, регламентирующих оказание медицинской помощи больным ИППП. К этим методам, в частности, относятся ПЦР и НАСБА. Данные методы были использованы в настоящем исследовании для сравнения результатов, полученных традиционными методами. В результате анализа данных, полученных на основе традиционных методов и МБМ, а также наличию или отсутствию жалоб со стороны пациентов, был разработан алгоритм лабораторного обследования пациентов для диагностики инфекций, вызванных N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis, на основе методов ПЦР и НАСБА. Использование данного алгоритма позволило подтвердить наличие ТИ у 32 пациентов с отрицательными результатами МС, а Г.— у 26. Кроме того, у 3 пациентов с положительными результатами МС диагноз ТИ был исключен. Внедрение разработанного алгоритма позволит повысить качество оказания медицинской помощи больным ИППП и унифицировать использование различных методов диагностики ИППП в клинической практике.