Известно, что методы комбинированной и сочетанной физиотерапии позволяют существенно повысить эффективность лечения. Основные принципы такой методологии были сформулированы в 80-е годы прошлого века [1] и базируются в основном на клиническом опыте, а теоретическое обоснование зачастую отстает от практики [2].

Одна из наиболее известных и эффективных методик сочетанного применения различных лечебных факторов — чрескожный лазерофорез лекарственных препаратов и биологически активных веществ [3, 4]. Метод успешно применяется в комплексном лечении больных с воспалительными, дегенеративно-дистрофическими и сосудистыми заболеваниями [4], с заболеваниями внутренних органов [5], а также в гинекологии [6, 7], дерматологии [8, 9], офтальмологии [10], стоматологии [11—13] и других областях медицины.

В России лазерофорез отечественных препаратов, в частности препаратов гиалуроновой кислоты (ГК), несколько лет назад стали успешно применять и в косметологии [14—16]. Известно также, что ГК не только эффективно проникает в кожу, но и является уникальным по своей эффективности «транспортным средством» для лекарственных препаратов, используемых в дерматологии, например при лечении актинического кератита [17]. Это открывает новые возможности применения ГК не только в косметологии, но и в медицинской практике.

По нашему мнению, непонимание врачами и косметологами механизмов лазерофореза является одной из основных причин не столь широкого распространения метода, как он того заслуживает. Ведь ответ на вопрос, каким образом осуществляется чрескожное проникновение лекарственных препаратов и активных веществ под действием низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), позволяет прогнозировать результат лечения, понимать, какие вещества и каким образом можно использовать на практике, оптимизировать параметры методики и пр. В принципе в таком положении вещей нет ничего необычного, для детального осознания всей цепочки происходящих при лазерофорезе процессов необходимо обладать весьма глубокими знаниями в самых разных областях биологии и биофизики, поэтому узкие специалисты (клиницисты), пусть даже высокой квалификации, не могут разобраться в тонкостях данной технологии.

Попытаемся открыть завесу над этой тайной и начнем с терминологии. Во-первых, «чрескожное» не синоним «трансэпидермальное». В нашем понимании это лишь область приложения воздействия, т.е. «через кожу», как отличие от введения препаратов через слизистую оболочку, например полости рта, где механизмы совершенно иные (рассматривать их мы не будем). Во-вторых, термин в строгом понимании некорректен, поскольку может сложиться впечатление, будто проникновение происходит через кожу в другие органы и ткани человека. Это, разумеется, не так и именно кожа, точнее, лежащие ниже эпидермиса слои, и являются основной областью концентрации вводимых веществ. Более глубокое проникновение осуществляется посредством хорошо известных механизмов, но нам интересны именно процессы, происходящие на первом этапе, т.е. важно понять, каким образом вещества проникают под эпидермис. Тем не менее термин «чрескожный лазерофорез» широко распространен и с учетом приведенных оговорок вполне может использоваться.

Для того чтобы понять механизмы чрескожного лазерофореза, пути и условия проникновения биологически активных веществ, необходимо вспомнить строение, функцию и физиологию кожи. Эти вопросы достаточно хорошо изучены, выделим только основные факторы, используемые нами для изучения механизмов лазерофореза.

Проникновение веществ через кожу может проходить тремя основными путями [18]:

— трансэпидермальный путь: как внутриклеточный через роговые конверты (этот путь ставится под сомнение большинством ученых и вклад этого пути в абсорбцию оценивается как пренебрежимо малый);

— межклеточный путь: гидрофильные молекулы низкой массы диффундируют через «полярный» водный путь гидратированного рогового слоя, липофильные молекулы — растворяются и диффундируют через липидный матрикс;

— дополнительный путь (через шунты): транспорт веществ через потовые железы и волосяные фолликулы с ассоциированными с ними сальными железами.

Одна из основных функций кожи — защитная, следовательно, трансэпидермальное проникновение водных растворов различных веществ, т.е. в буквальном смысле напрямую через слой клеток эпидермиса, маловероятно и ограничено многими условиями [19, 20]. Наиболее значимым для введения большинства веществ, безусловно, является третий путь, и нам исключительно важно понимать, какими свойствами должны обладать макромолекулы вводимого вещества, чтобы иметь потенциальную возможность для проникновения.

Кроме того, имеются и другие факторы, влияющие на абсорбцию и проникновение компонентов в кровоток:

— кожные специфические факторы (место и площадь аппликации; возраст, состояние, температура и степень гидратации кожи; интенсивность кровоснабжения и др.);

— характеристики проникающего компонента (молекулярная масса, химическое строение, конформация, степень гидрофильности);

— условия аппликации и наличие внешнего воздействующего фактора (свойства окружающей среды; форма, вид, время и доза воздействия).

Чтобы понять механизм преодоления веществами чрескожного барьера, необходимо вспомнить строение и размеры составляющих частей кожи и ее придатков. В верхней части кожи, эпидермисе, в зависимости от стадии дифференцировки эпителиальных клеток (кератиноцитов) различают слои базальный, шиповатых клеток, зернистых клеток и роговой. Такое разделение на слои определяется тем, что в эпидермисе постоянно осуществляются несколько процессов: деление клеток в глубоком слое, в результате чего происходит выталкивание клеток к поверхности; превращение клеток, наиболее удаленных от дермы, в роговое вещество и слущивание рогового слоя с поверхности. Плазмолеммы соседних клеток зернистого слоя разделены промежутками шириной 20—30 нм, шиповатого слоя — всего 12—15 нм. Клетки базального слоя вплотную прилегают друг к другу, не имея четких границ. Следовательно, потенциально маловероятным представляется проникновение вещества через межклеточное пространство [19—21].

Совершенно иная ситуация с придатками кожи. Проток потовой железы имеет дермальную и эпидермальную части, открывается на вершине гребешков кожи. Диаметр потовой поры 60—80 мкм, а просветов — 14—16 мкм. Дермальная часть протока состоит из 2 слоев кубического эпителия с базофильной цитоплазмой, лежащего на базальной мембране [21].

Плотность расположения потовых желез в зависимости от локализации и национальной принадлежности человека, по данным разных авторов, колеблется от 64 до 431 на 1 см², больше всего на лице — до 174 на см², и ладонях — до 424—431 на 1 см², а общее количество составляет от 2 до 5 млн. Общая площадь просветов выводных протоков составляет 57—94 см² (т.е. меньше 1% поверхности кожи), однако при этом общая секреторная поверхность всех потовых желез имеет площадь до 5 м2, т.е. в 3 раза превышает общую площадь эпидермиса. Толщина слоя кожи, в котором размещены клубочки потовых желез, составляет 1,3—3,12 мм, а весь объем данного слоя равен 3200 см3 [22—26].

Сальные железы имеются на всех участках тела, за исключением ладоней, подошв и дорсальной части ступни, чаще всего связаны со структурами волоса, но имеются и свободные железы. Плотность распределения не одинакова в различных областях тела человека. Больше всего их содержится в коже головы, лба, щек и подбородка (400—900 на 1 см²), на остальной поверхности тела плотность сальных желез варьирует от 0 до 120 на 1 см² [4, 22, 26]. Различают свободные от волос сальные железы, и связанные с волосяными фолликулами, которые классифицируют по размеру — средние и мелкие [22].

Величина секреторных отделов как у разных (в смысле эмбрионального происхождения) желез, так и у одинаковых, но расположенных в разных областях тела, варьирует в больших пределах. Так, на лице свободные сальные железы имеют секреторные отделы в объеме от 0,5 до 1 мм³, выводной проток их до разветвления имеет длину от 210 до 912 мкм, а устье его достигает в диаметре от 171 до 285 мкм. Секреторные доли проникают в кожу лица на глубину от 960 до 1710 мкм [22]. Подсчитать общую площадь внутренней поверхности железистых клеток затруднительно, поскольку различия весьма значительны и зависят от возраста, пола, типа клеток, локализации и пр., но она в десятки раз превышает общую площадь эпидермиса.

Волосяной фолликул состоит из 3 частей: глубокой части — от сосочка до соединения с мышцей, поднимающей волос; средней, очень короткой части — от соединения с мышцей, поднимающей волос, до входа протока сальной железы, и верхней части — от входа протока сальной железы до устья фолликула. Нижняя часть фолликула включает следующие структуры: дермальный сосочек, матрикс; волос, состоящий из мозгового и коркового вещества; кутикулу и корневое эпителиальное влагалище. Луковица волоса представлена недифференцированными эпителиальными клетками, в которых происходят пролиферация клеток, рост волоса и обновление клеток внутреннего корневого влагалища [19, 21].

На различных участках плотность волосяных фолликул на 1 см² в зависимости от возраста, пола, национальности и т.д., по данным разных авторов, колеблется в широких пределах — от 60±40 на коже полового члена и мошонки до 830±100 (на щеке у мужчин). Число видимых волос меньше или они даже полностью отсутствуют в некоторых частях тела (ладони, ступни и пр.) [22, 27, 28].

Итак, на теле человека на 1 см² имеется более 1000 потенциальных «входов» для макромолекул размером десятки микрон, и этого вполне достаточно для проникновения значительного количества вещества. Дальше процесс потенциально может происходить более активно за счет увеличения площади соприкосновения с железистыми эпителиальными клетками. В технологии ЛАЗМИК первичный этап введения вещества в устье желез и волосяных фолликул обеспечивается совмещением лазерного воздействия с массажем посредством специальной косметологической насадки [12].

Однако возможность проникновения частиц через устье отверстий вовсе не означает их дальнейшее продвижение, поскольку для этого необходимо пройти через клетки желез и волосяного фолликула. Единственным известным механизмом, позволяющим это осуществить, является трансцитоз, точнее его разновидность, пиноцитоз — процесс, объединяющий признаки экзоцитоза и эндоцитоза. На одной поверхности клетки формируется эндоцитозный пузырек (эндосома), который переносится к противоположному концу клетки, становится экзоцитозным пузырьком и выделяет свое содержимое во внеклеточное пространство. При этом весь процесс (полное прохождение вещества) занимает не более 1 мин. Важно, что для пиноцитоза характерно отсутствие специфичности плазмалеммы, т.е. любая поверхность клетки может участвовать в трансцитозе. Данный механизм известен как основной, обеспечивающий поглощение клетками мелких капель воды, белков, гликопротеинов и макромолекул с максимальным размером до 1000 нм (1 мкм) [29, 30]. В технологии ЛАЗМИК этим обусловлены рекомендация ограничения времени местного массажа 0,5—1 мин и постоянного смачивания поверхности дистиллированной водой, что способствует пиноцитозу [14].

Таким образом, для реализации лазерофореза вещество должно быть гидрофильным, а размер составляющих его фрагментов не должен превышать 1 мкм. Понятно, что никаких проблем не должно возникнуть (и не возникает) в случае лазерофореза водных растворов низкомолекулярных соединений, которые в основном и используются в медицине [4]. Иная ситуация с ГК, которая в естественном состоянии склонна к образованию длинных нитей размером, например в хряще, от 450 нм (0,45 мкм) до 4200 нм (4,2 мкм). Однако в водном растворе та же самая молекула ГК (1000 кД), имеющая в растянутом состоянии длину 2500 нм (2,5 мкм), уже образует сферу диаметром всего 200 нм [31]. В технологии ЛАЗМИК применяется нативная ГК (1,5% гиалуронат натрия) молекулярной массой 250—750 кД и физические размеры одной молекулы не более 250 нм [14].

Первичным механизмом биологического действия НИЛИ является термодинамический запуск зависимых от Ca²⁺ процессов. При поглощении НИЛИ световая энергия преобразуется в тепло, вызывая локальное нарушение термодинамического равновесия, вследствие чего из внутриклеточного депо высвобождаются ионы кальция, которые затем распространятся в виде волн повышенной концентрации [32].

Поскольку зависимыми от Ca²⁺являются как эндоцитоз, так и экзоцитоз [29, 33, 34], то высвобождение Ca²⁺ под действием НИЛИ приводит к активации трансцитоза в целом. Кроме того, известен феномен значительного усиления эндоцитоза после экзоцитоза, который был описан для железистых клеток и нейронов, в последнем случае для синаптических структур [35—37].

Лазерофорез не только самый простой в реализации и экономически целесообразный метод, но и, что самое важное, наиболее эффективный. Исследования А.А. Миненкова [4] это убедительно показали. На рисунке

Итак, сейчас мы понимаем механизм лазерофореза и предельные размеры фрагментов, которые могут пройти через мембранные барьеры клеток различных придатков кожи, однако немаловажным является и вопрос относительно того, какой молекулярной массы ГК нужно вводить чрескожно, и с какой целью.

Молекулярная масса ГК в хряще уменьшается с увеличением возраста, при этом общее ее содержание увеличивается [38]. Процесс деполимеризации напрямую связывают с уменьшением вязкости синовиальной жидкости, снижением подвижности суставов и развитием различных заболеваний (артрит, артроз). Поэтому для лечения заболеваний суставов вводится высокомолекулярная ГК [39, 40].

У женщин с увеличением возраста концентрация ГК в коже снижается, особенно значительно после 60 лет [41]. Кожа сильно обезвоживается, увеличивается ломкость кровеносных сосудов, появляются новые и углубляются старые морщины, уменьшаются толщина и тургор кожи. Предположительно это связано в том числе с дефицитом ГК, что служит обоснованием введения ГК в кожу. Но какой должна быть кислота по молекулярной массе и составу?

Известно, что для внутрикожных инъекций применяют высокомолекулярную ГК (более 2000—6000 кД), а использование низкомолекулярной кислоты при неинвазивном (лазерном) способе введения обосновывают тем, что молекулы «малого» размера могут пройти через кожу, при этом чаще всего никаких данных исследований и конкретных цифр, характеризующих исключительно качественный параметр «низко-», не приводятся [42]. В то же время известно, что через кожу самостоятельно (без применения внешнего воздействия) проходит синтезированная ГК (гиалуронат натрия) молекулярной массой 350—400 кД [43] и даже 600 кД [44, 30]. При этом время ее полувыведения составляет всего 24 ч [30].

Так что же реально применяется на практике? Единственным производителем, открыто указывающим количественный и качественный состав специальных гелей для лазерофореза (ЛАЗМИК), является ЗАО «НПК «КОСМОТЕРОС» (Россия). При этом Научно-исследовательский центр «Матрикс» (Россия) — производитель специализированных лазерных терапевтических аппаратов ЛАЗМИК, единственный, в котором открыто публикуются собственно методики проведения лазерофореза, эффективность которых обоснована теоретически и доказана в многочисленных исследованиях.

Если нам теперь понятны размеры молекул ГК, которые могут проникнуть через кожу, то остается вопрос, а надо ли стремиться к минимизации этих размеров, ведь имеются существенные различия в биологическом ответе на высоко- и низкомолекулярную ГК [45, 46]. Фрагменты очень низкой молекулярной массой не связываются со специфическими мембранными рецепторами клеток, которые реагируют только на естественные высокомолекулярные фрагменты ГК [47—52]. Например, ГК молекулярной массой 6,9 Д оказывает значительно более слабое противовоспалительное действие, а также по-иному влияет на катаболические процессы, чем нативная ГК, что показано для нескольких биологических систем [53—61]. При этом ГК молекулярной массой 250 кД вызывает выраженную активацию противовоспалительной активности в макрофагах [54, 60, 62], что воспроизводятся как in vitro, так и in vivo во время воспалительного процесса [63].

Недавние исследования М. Фарвик и соавт. [64] позволили выявить, что не только ГК обладает полезными для кожи свойствами, но эти свойства могут контролироваться за счет применения ГК различной молекулярной массы. Было доказано, что низкомолекулярная ГК (50 кД) лучше транспортируется через кожный покров, чем ГК высокой молекулярной массой (800 кД), а также активирует большее количество генов кератиноцитов, включая гены, отвечающие за дифференцировку кератиноцитов и формирование комплексов межклеточных контактов, количество которых снижается в фотоповрежденной и стареющей коже. Эти молекулярные эффекты ГК определяют и различия в проявлении in vivo эффектов. В исследовании было показано, что увлажняющий эффект и повышение эластичности кожи в большей мере свойственны ГК высокой молекулярной массы, тогда как разглаживающий эффект продемонстрировала ГК низкой молекулярной массы. Увеличение активности при снижении молекулярной массы ГК авторы объясняют более высокими возможностями трансэпидермального проникновения для молекул ГК меньшего размера.

Таким образом, мы можем с уверенностью утверждать, что понимаем механизмы лазерофореза на клеточном и тканевом уровнях, и это позволяет сформулировать основные требования к веществам и физическим факторам, обеспечивающим оптимальные параметры данной методики.

1. Вещества в кожу проникают через потовые и сальные железы, а также волосяные фолликулы посредством трансцитоза.

2. Поскольку пиноцитоз и экзоцитоз как часть трансцитоза являются зависимыми от Ca²⁺ процессами и в основе механизма биологического действия НИЛИ также лежит запуск кальцийзависимых процессов [32], то лазерофорез обоснованно является оптимальным, что и было экспериментально показано ранее [4].

3. Эффективное введение возможно только гидрофильного вещества молекулярной массой менее 1000 кД, если размер одной макромолекулы не превышает 250—300 нм.

4. Если формулировать частный вывод для лазерофореза ГК (гиалуронат натрия) с косметологическими целями (омоложение), то мы считаем наиболее целесообразным введение нативной ГК молекулярной массой 250—1000 кД. Таким требованиям в полной мере соответствует технология лазерофореза ЛАЗМИК [14].