Введение

В ургентной хирургии живота заболеваемость острым панкреатитом (ОП) по актуальности по-прежнему занимает одно из ведущих мест. Это обусловлено ежегодным ростом частоты встречаемости, полиэтиологичностью заболевания, сложностью патогенетического механизма и высокой летальностью. Несмотря на совершенствование медицины, использование высокоэффективных методик лечения, видимого прогресса в решении этой проблемы не происходит [1, 2].

При углубленном изучении проблемы ОП отмечено, что основная причина кроется в недостаточной степени исследования патогенетических процессов его развития. В действительности основной причиной летального исхода пациентов с ОП является токсическое поражение жизненно важных органов и систем в результате формирования системного воспалительного ответа и эндотоксикоза, с одной стороны, и ингибирования функционального потенциала детоксикационной системы, — с другой. Такое зачастую происходит на фоне применения стандартного метода лечения и клинического уменьшения воспалительного процесса [3, 4].

Очевидно, что другими патогенетическими компонентами указанного состояния выступают также триггерные агенты, в том числе оксидативная депрессия, активизация фосфолипаз, изменения системы гемостаза и др. [5]. Установление их роли и значимости на каждом этапе воспалительного процесса позволит определить направления по совершенствованию патогенетической терапии [6].

В развитии заболевания и его динамике многие исследователи большое значение придают геному пациента. Эндотелиальная синтетаза оксида азота (eNOS), кодируемая геном NOS3 7-й хромосомы, продуцирует NO, являющийся активным мессенджером, участвующим в регулировании тонуса кровеносных сосудов, их мышечного тонуса и их взаимодействии с тромбоцитами. Генетическая мутация (полиморфизм) азотистого основания цитозина на соединение тимина гена eNOS в 774 участке приводит к ослаблению тонуса мускулатуры сосудов, релаксации их стенок, с одной стороны, и к усилению агрегации и адгезии тромбоцитов, с другой. Это может быть одним из важнейших факторов нарушений регионарной микроциркуляторной системы, формирования микротромбоза, утяжеления динамики ОП и развития серьезных последствий [7, 8].

Научный интерес к эффективным способам терапии больных ОП не ослабевает. При этом особенно актуальна проблема улучшения результатов лечения пациентов с деструктивными формами патологии, летальность при которых составляет более 30—80% [9].

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — один из современных терапевтических методов, применяющихся при разных болезнях, в том числе и при ОП. Предположено, что МСК могут трансформироваться в другие клетки и регулировать и локальную, и системную иммунно-воспалительную реакции, что способствует быстрому восстановлению поврежденной ткани, предупреждению нарастанию тяжести состояния больных и формирования осложнений [10].

Цель исследования — оценить лечебную эффективность применения МСК у больных ОП тяжелой степени.

Материал и методы

Проведено рандомизированное проспективное исследование среди 60 пациентов с ОП тяжелой степени, в хирургических отделениях клинической больницы №3 на базе кафедры хирургии АзГИУВ им. А. Алиева (Баку).

По методам лечения больные рандомизированы на две группы: в 1-й группе (n=30; 18 (60,0%) мужчин и 12 (40,0%) женщин) провели эндовидеохирургическое лечение, возраст больных 44,7±2,93 года; больные 2-й группы (n=30; 16 (53,3%) мужчин и 14 (46,7%) женщин) получали комплексное лечение (станадартная + клеточная терапия), возраст 50,8±3,78 года.

Таксация степени тяжести исследуемых пациентов соответствует шкале АРАСНЕ II. В 1-й группе сумма баллов составила 14,4±0,43, во 2-й — 13,7±0,38, что соответствуют тяжелой степени заболевания [11].

Больным 1-й группы назначали базисную (антибактериальные, инфузионные, обезболивающий, ферментативные и другие препараты) и эндовидеохирургическую терапию. Пациентам 2-й группы на фоне стандартной терапии вводили МСК (клетки взяты из костного мозга в стерильных условиях, внутривенно по 100—500 млн клеток).

Критерии включения в исследование: персональное согласие, персональный отбор, возраст 27—68 лет, соблюдение клинического норматива, обоснование клинического диагноза ОП при помощи клинически-лабораторно-инструментальных методов, строго тяжелая степень заболевания, продолжительность ОП менее 3 дней, использование оперативного вмешательства только в 1-й группе, доброкачественное происхождение болезни, сопутствующие заболевания легкой степени.

Критерий исключения: персональный отказ от исследования; возраст моложе 27 или старше 68 лет, неисполнение врачебного протокола или клинических мер, легкая и среднетяжелая степени заболевания, срок заболевания более 3 сут, операция во 2-й группе, беременность и лактация, тяжелые сопутствующие заболевания, злокачественная причина ОП.

Для сравнения исследуемых параметров с референсными показателями обследованы здоровые лица (n=45; 20 (44,4%) мужчин и 25 (55,6%) женщин) в возрасте 20—50 лет.

В исследовании использованы следующие методы:

— оценка эндогенной интоксикации по содержанию гидрофильных токсинов (общей — ОКА и эффективной — ЭКА концентрации альбумина) в сыворотке крови;

— таксация состояния иммунитета: клеточного (Т-лимфоциты — CD3+, Т-хелперы/индукторы — CD4+, Т-супрессоры/цитотоксические — CD8+) и гуморального (β-, α1-глобулины);

— оценка регионарной микроциркуляции при помощи аппарата ЛАКК-02 (НПП «Лазма», Россия). Тест проведен в точке Шоффара (на 5—6 см выше пупка справа между биссектрисой пупочного угла и средней линией тела). Определены следующие параметры: показатель микроциркуляции, оценивающий сосудистую перфузию, и индекс эффективности микроциркуляции (ИЭМ), характеризующий взаимосвязь активной и пассивной реакции, регулирующей кровоток.

Генетический анализ полиморфизма гена eNOS (C774T) выполнен способом полимеразной цепной реакции в реальном времени при помощи CFX96 Real-Time PCR (США). Образцы ДНК получены из венозной крови. Исследование проводили с использованием набора химических реагентов «ДНК-Экстран-1» (ООО «Синтол», Москва).

Сроки исследования — 1—3—7-е сутки наблюдения.

Полученные данные обработаны статистическими методами (критерии t Фишера, χ² Пирсона, доверительный интервал (95%, DI), величины отношения шансов (OR, 95%), среднеарифметическая (М)) с использованием цифровых программ Microsoft Word и Excel 2013 и программы Statistica 12.0.

Результаты и обсуждение

На раннем сроке развития ОП тяжелой степени отмечены признаки эндогенной интоксикации (рис. 1).

Рис. 1. Динамика показателей эндотоксикоза.

Здесь и далее: * — статистически достоверное отличие от значения группы нормы (p<0,05), ¹ — статистически достоверное отличие от показателей 1-й группы (p<0,05).

У пациентов группы сравнения на фоне оперативного лечения наблюдалось выраженное снижение общей и эффективной концентрации альбумина в 1-е сутки на 27,2% (p<0,05), на 3-и сутки на 23,5% (p<0,05), на 7-е — на 22,3% (p<0,05) (см. рис. 1).

Во 2-й группе в 1-е и на 3-и сутки наблюдения регистрировали токсемические явления (снижение ОКА и ЭКА) соответственно на 25,6 и 15,9% (p<0,05). Важно отметить, что продолжение в течение 7 дней терапии оказало существенно позитивное патогенетическое действие на течение ОП. К финальному дню исследования величины гидрофильных метаболитов (ОКА и ЭКА) были ниже рефренного уровня незначительно (см. рис. 1).

При изучении результатов иммунологического теста выявлено, что в ранние сроки развития ОП происходят выраженные изменения активности иммунного ответа, причем и клеточного, и гуморального (рис. 2).

Рис. 2. Динамика показателей иммунной системы.

Гуморальный компонент — (а); клеточный — (б).

Итак, в 1-й день наблюдения содержание Т-лимфоцитов превышало нормальный показатель как в группе сравнения (на 27,1%, p<0,05), так и в основной (на 25,8%, p<0,05). На 2-й день концентрация CD3+ у пациентов, получивших хирургическое лечение, по прежнему была выше, чем исходная, на 32,8% (p<0,05). Однако уровень данного показателя во 2-й группе (терапия МСК) начал снижаться и был выше референсного параметра на 23,8% (p<0,05). К конечному дню терапии уровень данного параметра соответствовал исходному только у пациентов основной группы и оставался повышенным (относительно нормы) в 1-й группе на 21,1% (p<0,05) (см. рис. 2).

Количество лимфоцитов CD4+ в группе клинического сравнения превосходило нормальный показатель в течение всего периода исследования на 33,2—26,9% (p<0,05).

У пациентов 2-й группы содержание этих лимфоцитов было выше референсного уровня лишь в 1-е и 3-и сутки на 31,7 и 24,8% (p<0,05), а к 7-м суткам оно практически приблизилось к норме (см. рис. 2).

Количество CD8+ при тяжелой форме ОП превышало исходные значения в условиях применения хирургической терапии на 20,8% (p<0,05). В той же группе плазменная концентрация цитотоксических Т-супрессоров сохранила свою интенсивность и на 3-е и 7-е сутки наблюдения соответственно на 23,4 и 17,6% (p<0,05).

В основной группе активность CD8+ зарегистрирована в 1-й и 3-й дни исследования на 19,2 и 14,2% (p<0,05). В последний день регистрации она стабилизировалась и превышала норму незначительно.

По ходу изучения показателей интенсификации гуморального иммунитета установлено, что начальная фаза ОП сопровождалась увелечением содержания α1- и β-глобулина на первом и втором этапе наблюдения на 28,1 и 32,4%, а также на 24,6 и 32,7% (p<0,05) в 1-й группе, и на 27,5 и 18,6%, а также на 22,1 и 16,9% (p<0,05) во 2-й соответственно. На финальном этапе исследования восстановление гуморального компонента иммунитета зарегистрировано только в основной группе (см. рис. 2).

При изучении данных исследования установлено, что в ранние сроки развития ОП тяжелой степени происходят значительные изменения регионарной микроциркуляции (рис. 3).

Рис. 3. Динамика параметров микроциркуляции

У пациентов 1-й группы (стандартное и оперативное лечение) показатель микроциркуляции и индекс эффективности микроциркуляции были ниже нормы в первые трое суток на 29,7 и 24,2% (p<0,05) соответственно. На 3-и сутки микроциркуляция ухудшилась, поскольку уровень изучаемых параметров продолжал снижаться и был ниже референсного на 33,5 и 26,4% (p<0,05). На конечном этапе регистрации данных наблюдали небольшое восстановление функционального потенциала регионарной микроциркуляции. При этом показатель микроциркуляции был понижен на 25,7% (p<0,05), а индекс эффективности микроциркуляции — на 21,5% (p<0,05) (см. рис. 3).

У больных основной группы (традиционная и клеточная терапия) установлено снижение показателя микроциркуляции и индекса эффективности микроциркуляции в 1-й день наблюдения на 28,7 и 23,9% (p<0,05). Ко второму этапу исследования микроциркуляторная активность начала восстанавливаться, хотя показатель микроциркуляции и индекс эффективности микроциркуляции были ниже, чем исходные значения на 24,1 и 18,6% (p<0,05). На финальном этапе наблюдения уровень данных показателей практически приблизился к норме (см. рис. 3).

Наши данные показали, что изменчивость гена eNOS непосредственно влияет на развитие заболевания и прогрессирование его течения (рис. 4).

Рис. 4. Встречаемость аллелей и генотипов гена eNOS (C774T).

Отмечено, что в группе нормы встречаемость генотипов C774C, C774T и T774T составила 70,0; 22,5 и 7,5%. У исследуемых пациентов частота данного генотипа была равна 10,0; 36,7 и 53,3% в 1-й группе и 16,7; 33,3 и 48,2% во 2-й. При этом встречаемость аллелей C и T составила 81,3 и 18,7% в референсной выборке, 28,3 и 71,6% в группе сравнения и 33,3 и 66,7% в основной группе (см. рис. 4). Существенное отличие в частоте встречаемости полиморфной изменчивости T774T гена эндотелиальной NO-синтазы при ОП относительно нормы (p=0,001) позволяет предположить ее влияние в нарушении гомеостатической системы пациента, прогрессировании заболевания и развитии его тяжелой степени.

В то же время установлено, что распределение аллелей C и T генотипов C774C и T774T исследуемого гена имело сильную силу связи с референсным показателем как в группе сравнения (χ²=22,7, p=0,001), так и в основной группе (χ²=27,8, p=0,001). При этом частота патологического варианта полиморфизма T774T гена eNOS у пациентов 1-й группы составила 71,6% (C’=0,785) и 66,7% (C’=0,845) соответственно. Следовательно, мутация T774T, по-видимому, может оказывать патологическое действие на прогрессирование ОП.

При изучении сопряженности полиморфизма гена eNOS со звеньями гомеостатической системы установлено, что у пациентов с вариантом T774T зарегистрированы их статистически наиболее значимые изменения относительно аналогичных у больных с генотипами C774C и C774T на всех этапах наблюдения: ОАК и ЭКА ниже на 14,2—13,8 и 12,8—11,9% (p<0,05), содержание CD3+ и CD4+ больше на 15,4—13,8 и 13,7—11,8% (p<0,05), показатель микроциркуляции и индекс эффективности ниже на 13,8—11,8 и 12,6—10,9% (p<0,05).

Необходимо отметить, что раннее применение комплексного метода лечения (стандартная + клеточная терапия) способствовало сравнительно быстрому восстановлению системы гомеостаза, особенно у пациентов с генотипом T774T. Результаты сравнительного теста показали, что интенсивные нарушения системы гомеостаза зарегистрированы в основном у больных группы сравнения (хирургические вмешательства) по сравнению с пациентами основной группы (с МСК). В 1-й группе выявлено, что уровень токсемического поражения более выражен на 3-и и 7-е сутки (ОКА и ЭКА были ниже на 11,1 и 13,5 и 12,5 и 14,2%, p<0,05), в то же время иммунный дисбаланс (уровни CD3+, CD4+, α1- и β-глобулинов были выше на 11,7 и 12,9; 10,2 и 11,8, 10,1 и 10,9; 11,3 и 12,7%, p<0,05) и микроциркуляторные расстройства (показатель микроциркуляции и индекс эффективности микроциркуляции были ниже на 13,8 и 15,8, и 10,5 и 11,8%, p<0,05) были более выражены.

Заключение

Ранний период ОП тяжелой степени сопровождается значительными расстройствами системы гомеостаза: развитие эндогенной интоксикации, дисбаланс иммунной системы, выраженные нарушения регионарной микроциркуляции.

Генетический анализ показал, что полиморфный генотип (T774T) гена эндотелиальной NO-синтазы часто (66,7—71,6%, p=0,001) встречается у пациентов с тяжелой формой ОП, у которых наблюдают наиболее выраженные гомеостатические изменения (p<0,05).

Включение МСК в состав стандартной терапии на ранней фазе ОП тяжелой степени позволяет целенаправленно и сравнительно быстро воздействовать на патологические процессы гомеостаза, ингибируя токсемические явления, восстанавливая иммунную реакцию и улучшая показатели микроциркуляторной системы. Особенно ярко положительное терапевтическое воздействие МСК наблюдается у больных с патологической мутацией гена eNOS (T774T).

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.