Новая область регенеративной медицины предлагает инновационные методы клеточной терапии и тканевой/органной инженерии как новый подход к лечению заболеваний печени [1]. Научная основа как клеточной терапии заболеваний печени, так и ее тканевой и органной инженерии обеспечивается глубокими исследованиями клеточных и молекулярных механизмов регенерации печени [2—4].

Роль клеток-предшественников в регенерации печени

Особое внимание в процессе регенерации уделяется клеткам-предшественникам печени. Считается, что эти клетки являются второй линией защиты от повреждения печени и становятся активными, когда прекращается пролиферация зрелых гепатоцитов. Впервые эти клетки описаны в литературе еще в 1956 г. Farber и соавт. и названы овальными клетками. Их название произошло от внешнего вида ядра [5]. Овальные клетки пролиферируют в перипортальной области под контролем факторов роста, продуцируемых звездчатыми клетками, включая HGF, FGF1, FGF2 и VEGF 80. Овальные клетки, способные продуцировать альбумин и альфа-фетопротеин, становятся гепатоцитами в течение 4—5 дней после активации. В конечном счете эти клетки могут стать зрелыми гепатоцитами. До конца нерешенным остается вопрос происхождения клеток-предшественников. Современные данные противоречивы, однако есть сведения, что большинство этих клеток получены из клеток in situ, которые являются прямыми зародышами хориальной пластинки плода. В настоящее время все исследования направлены на изучение стимуляции пролиферации стволовых клеток или трансплантацию дополнительных клеток-предшественников в пораженную печень [6].

Пациенты с острой печеночной недостаточностью также показывают повышенную степень пролиферации клеток-предшественников по сравнению с интактной печенью. При этом отмечено, что при 50% потере гепатоцитов с уменьшенной пролиферацией зрелых гепатоцитов, запускается процесс пролиферации популяции клеток-предшественников. Это дополнительно свидетельствует об отсутствии значимости этих клеток в физиологически здоровой печени [7].

В последние годы стволовые клетки-предшественники (LPC) вызывают все больший интерес не только как потенциальные кандидаты для клеточной терапии и тканевой инженерии, но и в качестве альтернативы трансплантации печени. Однако LPC всегда размножаются при хронических заболеваниях печени с предрасположенностью к раку [8]. Они играют важную роль в развитии фиброза, прогрессировании заболевания и могут даже представлять собой клетки, инициирующие опухоль. В связи с этим продолжаются работы по изучению факторов, которые управляют активацией клеток-предшественников, связей с другими типами печеночных клеток, их дифференцировкой, прежде чем можно будет использовать их терапевтический потенциал [9].

Кроме того, исследуют внепеченочные стволовые клетки (например, клетки костного мозга), изучая их вклад в регенерацию печени. Участие переносимых кровью клеток костного мозга в регенерации паренхимы печени доказано, но не превышает 1—2% новообразованных гепатоцитов [10].

Хотя многое еще предстоит узнать о роли стволовых клеток/клеток-предшественников в физиологии и патофизиологии печени, начат экспериментальный анализ терапевтической ценности этих клеток. Трансплантация печеночных стволовых клеток/клеток-предшественников или фармакологическая активация пула печеночных стволовых клеток in vivo могут обеспечить новые методы терапии заболеваний печени.

Трансплантация и регенерация печени

В настоящее время в мире среди трансплантологов наблюдается растущий спрос на высококачественную пересаживаемую печень, который превышает предложение донорских органов. В связи с этим все чаще мы видим трансплантацию печени от живого донора. Основным условием для этого метода является предоставление реципиенту адекватного размера функционирующего трансплантанта при сохранении высокого профиля безопасности для донора. Успех частичной трансплантации печени требует определенной степени регенерации печени. Развивающийся синдром малого размера (SFSS) является результатом неспособности маленького трансплантата к регенерации и основным ограничивающим фактором в расширении роли частичной трансплантации печени. SFSS проявляется холестазом, резистентным асцитом, коагулопатией, энцефалопатией, которые регистрируют через 3—5 дней после сегментарной трансплантации печени, поскольку малого размера трансплантат не в состоянии компенсировать потребности реципиента [11]. В наиболее тяжелых случаях прогрессирование SFSS приводит к ацидозу, гипогликемии, септическому шоку, развитию почечной и легочной недостаточности и, как правило, к смерти, если не будет выполнена ретрансплантация.

Изучаются различные подходы к преодолению SFSS. Так, отмечено улучшение серологических показателей, снижение среднего пребывания в стационаре после трансплантации печени и снижение заболеваемости, связанной с инфекцией, у пациентов, получающих добавки с омега-3 жирными кислотами, по сравнению с пациентами, получающими только парентеральное питание [12].

При массивных повреждениях печени и потере гепатоцитов внутренняя регенеративная способность печени оказывается угнетенной из-за репликации резидентных гепатоцитов. Лечение этого состояния зависит от причины повреждения печени, хотя во многих случаях трансплантация печени остается единственным лечебным вариантом. Однако при терминальной стадии хронических и острых заболеваний печени она сдерживается нехваткой донорских органов, инвазивностью вмешательства и требует иммуносупрессии.

Стимуляция регенерации печени

Доказательства, подтверждающие защитный эффект добавления жирных кислот после частичной гепатэктомии, представлен и в других работах [13]. Так, Yan и соавт. на примере крыс, которым выполнена 70% резекция печени и которым вводили полиненасыщенные жирные кислоты, отметили повышенную экспрессию сигнального пути LKB1-AMPK, что привело к улучшению целостности плотного соединения и к улучшению функции печени после операции [14]. Другая стратегия в борьбе с SFSS подразумевает использование секретируемых факторов из мезенхимальных стволовых клеток для стимуляции регенерации печени [15]. Так, после резекции печени мыши, обработанные специальными культуральными средами для мезенхимальных стволовых клеток, показали повышенную способность к регенерации с активацией цитокинов и факторов роста, участвующих в пролиферации клеток, ангиогенезе и противовоспалительных реакциях [16].

На основе вновь созданной модели у мышей, которая вызывает адгезию на поверхности резецированной печени, выполняли трансплантацию FL-MCs (мезотелиальные клетки плода). Результатом явилась не только профилактика послеоперационной адгезии за счет экспрессии PCLP1 (белок из семейства сиаломуцинов), но и активация фибринолитической системы, а также стимуляция регенерации печени с предоставлением факторов роста для гепатоцитов и обеспечением быстрого восстановления массы и функции печени. Все это свидетельствует о том, что FL-MCs могут служить потенциально полезным источником клеток для регенеративной медицины после гепатэктомии [17].

При изучении роли в регенерации печени белка гена, индуцируемого фактором некроза опухоли (TSG-6), на модели ее повреждения CCl4 мышей при иммуногистохимическом исследовании отмечено, что у животных, которым применяли TSG-6, накапливались гепатоцитарные клетки, по данным исследования Ki-67 (ядерный белок, связанный с пролиферацией и митозом). Анализ РНК показал уменьшение как маркеров воспаления, TNFα, IL-1β, так и фиброзных маркеров, TGF-β1, α-SMA и коллагена α1. Эти результаты продемонстрировали, что TSG-6 способствовал регенерации печени, подавляя активацию звездчатых клеток печени у мышей, получавших CCl4, подтверждая тем самым терапевтический потенциал TSG-6 при острой печеночной недостаточности [18].

C. Mangieri и соавт. провели оценку происходящей регенерации печени у крыс при интраоперационной инфузии фактора роста гепатоцитов (HGF). При этом предварительно у экспериментальных животных лигировали воротную вену. У грызунов с инфузией HGF наблюдали статистически значимое увеличение всех послеоперационных объемов печени. Наиболее клинически значимыми были увеличение объема правой печени (RLV) — 14,10 см³ против 7,85 см³ (p=0,0001) и повышение степени гипертрофии — 159,23% против 47,11% (p=0,0079). Периоперационные инфузии HGF значительно увеличивали регенерацию печени после лигирования воротной вены у крыс. Интраоперационные инфузии HGF после эмболизации воротной вены являются возможным дополнением для увеличения числа пациентов, способных успешно перенести первичную резекцию при опухолях печени. Необходимо дальнейшее фундаментальное изучение использования инфузий HGF для ускорения регенерации печени и внедрение результатов этого эксперимента в клиническую практику [19].

Дальнейшие исследования показали зависимость различной степени портальной окклюзии на портальное давление и регенерацию печени. Крысам линии wistar выполняли перевязку воротной вены на 70, 80 и 90%. Наиболее выраженный регенеративный ответ отмечен при наибольшей степени портальной окклюзии. Количество митотических клеток при лигировании до 90% было наибольшим по сравнению с 70 и 80% перевязкой воротной вены. Митотический индекс через 24 ч показал сильную корреляцию с острой портальной гипертензией. Это свидетельствует о том, что наиболее высокая степень окклюзии портальной вены приводит к большей регенеративной реакции, предположительно вызванной пропорциональным увеличением портального давления. Это подтверждает роль так называемой теории кровотока регенерации печени, вызванной селективной перевязкой воротной вены [20].

В экспериментальных исследованиях на мышах показана роль желчных солей в регенерации печени после ее резекции. Под воздействием этих солей после гепатэктомии происходит активация рецепторов желчных солей в непаренхиматозных (рецептор плазматической мембраны TGR5) и паренхиматозных (внутриклеточный рецептор Fxr) клетках печени, тем самым обеспечивая сигналы для регенеративных процессов. Нарушенная передача сигналов желчной соли у мышей с генетическим дефицитом TGR5 или Fxr приводила к замедленной регенерации печени после ее резекции и сопровождалась высокой летальностью животных. И наоборот, компенсаторное увеличение печени после резекции печени стимулировали путем кормления солями желчных кислот.

Большое количество исследований на животных подчеркивает важность строгого поддержания гомеостаза солей желчи для стимулирования регенерации печени. Печеночный Fxr играет ключевую роль в регуляции гомеостаза солей желчи и таким образом предотвращает гепатотоксичность, вызванную чрезмерным уровнем этих солей. Они также способствуют регенерации печени путем индукции митогенных факторов. Поиск факторов, которые будут воздействовать на рецепторы солей желчных кислот, может быть полезен в качестве лекарства, стимулирующего регенерацию печени у отдельных пациентов [21].

Известно, что TGR5 экспрессирует в клетках Купфера и эндотелиальных клетках печени и особенно насыщен в желчных путях (холангиоциты и клетки гладких мышц желчного пузыря). Доказано, что при перегрузке мембранного рецептора желчных кислот TGR5 оказывает выраженное защитное действие на печень после ее резекции. Так, у мышей TGR5-КО после операции отмечали перипортальные инфаркты, воспаление и дефекты адаптации желчных композиций (бикарбонат и хлорид). В условиях перегрузки мембранного рецептора желчных кислот TGR5 защищает печень не только посредством регуляции секреторных и воспалительных процессов, но и благодаря контролю состава пула мембранных рецепторов желчных кислот. Все это указывает на то, что TGR5 имеет решающее значение для защиты регенерирующей печени [22].

В проведенных исследованиях на модели резекции печени у мышей C57BL/6 доказана эффективность никотинамида (Nam) в регенерации печени и восстановлении ее функции. Иммуногистохимическим анализом (исследование моноклонального антитела Ki-67) показано, что добавление экзогенного Nam способствует пролиферации гепатоцитов и ускоряет восстановление ткани печени. Добавление Nam защищало функцию печени после резекции, что подтверждается данными изучения морфологии ткани печени и изменением сывороточных маркеров ее повреждения. Примечательно, что экспрессия и активность NAD-зависимой деацетилазы белка sirtuin 1 (SIRT1) были значительно повышены после добавления в Nam, что свидетельствует о роли Nam в регенерации печени посредством активации SIRT1 [23]. Подобные результаты получены и в других исследованиях [24].

При создании модели острой печеночной недостаточности, вызванной 85% резекцией печени у свиней, оценена эффективность биоискусственной печени. При этом изучена роль так называемого сфероидального резервуара (SRBAL) на выживание животных, динамику биохимических показателей и регенерацию. В ходе исследования доказано, что применение этой методики улучшило выживаемость животных, снижало количество мочевины и ускоряло регенерацию печени, что подтверждено данными измерения внутричерепного давления, компьютерной томографии, биохимического исследования крови и определения моноклональных антител (Ki-67). Улучшение выживаемости животных связано с нейропротекторным эффектом терапии SRBAL. Безусловный интерес представляет клиническое применение данной методики [25].

O. Parlak и соавт. оценили значимость карнитина в регенерации печени. На резекционной модели печени у крыс линии wistar albino путем парентерального введения L-карнитина в дозе 100 мг/кг/день при исследовании моноклонального антитела Ki-67 доказано увеличение количества митозов под действием данного препарата, увеличение индекса пролиферации. Одновременно установлено, что регенераторный эффект выражен только при условии применения определенной дозы L-карнитина [26].

В результате проведенных исследований дана оценка способа стимуляции регенерации печени после ее обширной резекции (90%) у крыс. При этом перед операцией за 48 ч предварительно выполняли ксенотрансплантацию изолированных криоконсервированных гепатоцитов подкожно в переднюю брюшную стенку. Интраоперационно дополнительно осуществляли трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки. Результатом явилось снижение послеоперационной летальности животных за счет усиления регенерации печеночной паренхимы [27].

Поскольку первичные гепатоциты быстро пролиферируют in vivo в ответ на сложные сигнальные пути регенерации печени, предпринимают попытки создания каркасов печени, которые можно будет трансплантировать и использовать для замены печени у пациентов с печеночной недостаточностью.

Трансплантация гепатоцитов из стволовых клеток рассматривается в качестве потенциального метода терапии острой и хронической печеночной недостаточности. Однако низкая эффективность их дифференцировки в зрелые и функциональные гепатоциты остается серьезной проблемой для клинических применений [28].

В связи с этим M. Wang и соавт. предложили использовать наночастицы диоксида кремния для устойчивой доставки факторов роста, приводящей к индукции гепатоцитоподобных клеток (iHeps) из эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC) и к улучшению экспрессии генов, специфичных для энтодермы и гепатоцитов. Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из mESC, обработанные этой системой доставки, при пересадке их мышам с поврежденной печенью уже через 4 нед демонстрируют более высокую эффективность интеграции в печень хозяина и восстанавливают поврежденную печень в значительной степени [29].

Продолжая поиск новых фармакологических средств для усиления регенерации печени после ее повреждения, ученые протестировали известные и новые ингибиторы костного морфогенетического белка (BMP) на модели резекции печени. Соединения получены на основе 3,6-дизамещенного пиразоло [1,5-a] пиримидинового ядра антагониста BMP дорсоморфина и оценены по их способности ингибировать передачу сигналов BMP и усиливать регенерацию печени. Антагонисты рецептор-подобной киназы 3 активатора рецептора BMP (ALK3), включая LDN, блокируют SMAD-фосфорилирование in vitro и in vivo и улучшают регенерацию печени после резекции. Однако LDN не влиял на синтетическую или метаболическую функции печени. LDN увеличивал уровни сывороточного интерлейкина-6, сигнальный преобразователь и активатор фосфорилирования транскрипции 3 в печени и модулировал другие факторы, которые, как известно, важны для регенерации печени, включая ингибитор передачи сигналов цитокинов 3 и p53. Полученные результаты показывают, что ингибирование ALK3 может быть частью терапевтической стратегии лечения заболеваний печени человека [30].

В эксперименте доказана роль тромбоцитов в ускорении регенерации печени. Ранее установлено, что тромбоциты рассматриваются как пусковые механизмы воспалительных реакций и повреждения печени. Однако K. Takahashi и соавт. показывают, что в основе регенераторных процессов лежат 3 различных механизма: 1) прямое воздействие на гепатоциты, при котором тромбоциты перемещаются в пространство Disse; 2) сочетанный эффект с синусоидальными эндотелиальными клетками печени, где высокая концентрация сфингозин-1-фосфата в тромбоцитах продуцирует экскрецию IL-6 из синусоидальных эндотелиальных клеток печени; 3) совместный эффект с клетками Купфера, где функции этих клеток усиливаются тромбоцитами [31].

В эксперименте на крысах на модели острой печеночной недостаточности исследовано влияние мезенхимальных стволовых клеток на ускорение регенерации печени путем измерения уровней фактора роста тромбоцитов (PDGF) и факторов роста эндотелия сосудов (VEGF). Кроме того, изучена корреляция этих факторов с величиной уровня сывороточной глутаминовой пировиноградной трансаминазы (SGPT) и сывороточной глутаминовой оксалоуксусной трансаминазы (SGOT). При этом отмечено, что мезенхимальные стволовые клетки стимулируют регенерацию, что коррелировало и со значениями показателей трансаминаз [16].

S. Hao и соавт. исследовали роль трансляционно контролируемого опухолевого белка (TCTP), который относится к антиапоптотическим белкам, в регенерации печени после резекции в объеме ²/₃. Результаты показали, что экспрессия внутриклеточного и сывороточного белка TCTP значительно увеличена у крыс после такой операции. Использование in vivo меченного бромодезоксиуридина позволило предположить, что лечение антителами к TCTP перед резекцией печени значительно снижало пролиферацию гепатоцитов и соотношение массы печени и массы тела. Прокариотический TCTP оказывал потенциальное стимулирующее влияние на пролиферацию гепатоцитов как in vivo, так и in vitro, хотя прокариотический TCTP, вводимый крысам перед резекцией, не увеличивал отношение пролиферации или отношение печени к массе тела. Кроме того, предварительное введение антител к TCTP снижало экспрессию циклина E, cdk2 и IL-6 в печени крысы. Эти данные свидетельствуют о том, что сывороточный TCTP участвует в регенерации печени крыс посредством стимуляции пролиферации гепатоцитов [32].

Применение селективных агонистов опиоидных рецепторов оказывало стимулирующее действие на регенерацию печени после ее резекции. Наиболее выраженный эффект при внутрибрюшинном введении в течение 5 дней, начиная со дня выполнения операции, проявляли селективный агонист опиоидных каппа-рецепторов динорфин A (1—13) (20,1 мкг/кг) и селективный агонист опиоидных мю-рецепторов DAGO (6,3 мкг/кг), которые ускоряют регенерацию печени соответственно на 31,7 и 16,8% (при p<0,001) на 7-е сутки после резекции [33].

Для оценки антимутагенного эффекта комбинированной терапии мезенхимальными стромальными клетками, полученными из костного мозга человека, и силимарина, а также определения влияния этого лечения на уровни факторов роста гепатоцитов проведено исследование у крыс на модели CCl4-поражения печени. По результатам исследования ДНК, а также электронной микроскопии печени доказано, что такое комбинированное лечение восстанавливало уровень факторов роста гепатоцитов в плазме, который соответствовал норме, и проявляло антимутагенную и антиапоптотическую активность. Кроме того, доказано гепатозащитное действие комбинированного лечения мезенхимальными стромальными клетками и силимарином [34].

Интересные данные представлены в работе, в которой оценивали ретроспективные данные у пациентов, подвергшихся гемигепатэктомии. Так, выявлена зависимость скорости регенерации печени от вида гемигепатэктомии. Скорость увеличения послеоперационного фрагмента печени у больных после правосторонней гемигепатэктомии была выше, чем после левосторонней. Причиной тому является постепенная атрофия IV сегмента печени. Правосторонняя и левосторонняя гемигепатэктомия отличаются друг от друга объемом резекции печени, а также выраженностью воспалительной активности, которая непосредственно влияет на регенерацию печени [35].

Таким образом, в последние годы лучшее понимание роли регенерации печени позволило выполнять более обширные резекции печени при злокачественных опухолях в ходе лечения цирроза печени. Проводимые исследования направлены на высокое качество пересаживаемых органов при небольших размерах трансплантата. Особую терапевтическую роль занимают так называемые стимуляторы регенерации печени. Стволовые клетки могут быть использованы как материал для клеточной терапии и тканевой инженерии, так и в качестве альтернативы трансплантации печени.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.