Введение

Эритропоэтин (Эпо) является одним из ключевых элементов регуляции эритропоэза. Адекватность его секреции может определять прогноз анемии. Гипоксия, обусловленная сердечной недостаточностью, должна приводить к постоянной стимуляции секреции Эпо и, следовательно, гемопоэза, компенсирующего дефицит тканевой оксигенации, связанного с гемодинамическими нарушениями. Чем более выражена гипоксия, тем большую секрецию Эпо можно было бы ожидать. Следовательно, адекватность секреции Эпо должна обеспечить адекватную оксигенацию тканей и быть условием переносимости физических нагрузок больными с недостаточностью кровообращения (НК). Однако фактически как его секреция, так и эффективность стимулируемых им процессов находится под влиянием значительного числа прочих повышающих и понижающих влияний: метаболизма железа, состояния костного мозга, активности воспаления и т.д.

Целью исследования стало установление взаимосвязи между тяжестью гипоксии и уровнем секреции Эпо у кандидатов на операции в условиях искусственного кровообращения с исходной НК.

Материал и методы

Дизайн исследования

Проспективное обсервационное когортное исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (Helsinki, 2000). От всех пациентов получено информированное согласие на участие в исследовании, и оно одобрено комитетом по этике Национального медицинского исследовательского центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева (протокол №2 от 02.03.2016).

В исследование включали больных с сердечной недостаточностью, обусловленной пороками клапанов сердца и/или ишемической болезнью сердца. Критериями невключения являлись наличие аортального стеноза с градиентом давления более 180 мм рт. ст., поражение ствола левой коронарной артерии, скорость клубочковой фильтрации менее 30 мл/мин/1,7м².

Характеристика пациентов

В исследование включены 29 пациентов (16 мужчин и 13 женщин). Возраст пациентов колебался от 22 до 78 лет (средний возраст 56,7±14,4 лет). Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1. Всем больным выполняли оперативное лечение основного заболевания в условиях искусственного кровообращения.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Оценку толерантности к физической нагрузке проводили при помощи кардиореспираторного теста и теста 6-минутной ходьбы. Морфофункциональные параметры левого желудочка (конечно-систолический объем (КСО ЛЖ), конечно-диастолический объем (КДО ЛЖ), фракция выброса (ФВ ЛЖ)) исследовали на ультразвуковом аппарате Vivid 7 (General Electric, USA) с использованием трансторакального датчика S3 в одно- и двумерных режимах. Параметры сердца измеряли в классических эхокардиографических проекциях по методике Simpson в абсолютных значениях.

Кардиореспираторный нагрузочный тест (эргоспирометрия)

Кардиореспираторный нагрузочный тест проводили на анализаторе Ultima CPX (MGC Diagnostics, USA). При помощи велоэргометра обеспечивалась нагрузка, которая начиналась с 20 Вт и каждые 7—10 мин увеличивалась на 10—20 Вт. На основании теста рассчитывали потребление кислорода в покое (VO₂(покой)), пиковое потребление кислорода (VO₂(пиковое)), в том числе в доле от прогнозируемого, анаэробный порог, в том числе в доле от прогнозируемого пикового потребления кислорода, респираторное дыхательное отношение (RER), вентиляционные эквиваленты по кислороду (VE/VO₂) и углекислому газу (VE/VCO₂).

Лабораторные методы исследования

Для оценки уровня маркеров использована цельная венозная кровь, взятая из локтевой вены. Гематологическое исследование, анализ концентрации креатинина, железа и трансферрина крови выполнены в течение одного часа после взятия пробы. Количественное определение эритропоэтина проведено из предварительно подготовленной сыворотки крови, хранившейся при температуре — 20 °C не более 30 календарных дней.

Клинический анализ крови выполнен в цельной крови, стабилизированной К2ЭДТА с помощью аналитической системы Cell-Dyn Ruby (Abbott). Измерены концентрация гемоглобина, гематокрит, число эритроцитов, средний объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH). Оценка биохимических показателей проведена на анализаторе Architect c8000 (Abbott). Анализ концентрации креатинина выполнен усовершенствованным кинетическим методом без осаждения белка, основанным на цветной реакции Яффе. Уровень железа в сыворотке крови измерен прямым колориметрическим методом без депротеинизации. Оценка уровня ферритина проведена с помощью двухстадийного хемолюминесцентного метода на микрочастицах (CMIA) с использованием иммуноферментного анализатора Architect i1000s (Abbott). Количественное определение трансферрина в сыворотке крови проводили методом кинетической нефелометрии на иммунохимическом анализаторе Immage 800 (Beckman Coulter). Концентрация эритропоэтина измерена с помощью автоматического фотометра iMark (Bio-Rad) и набора реагентов Biomerica EPO ELISA. Тест основан на методе двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа биологически активной формы эритропоэтина с использованием двух видов мышиных моноклональных антител к определенным участкам человеческого эритропоэтина. Рассматривали как абсолютные значения концентрации Эпо, так и отношение логарифмов фактической и прогнозируемой концентрации Эпо (log_Эпо(факт/прогн)). Должная концентрация Эпо рассчитывалась на основании уравнения регрессии log_Эпо=2,405—0,009×[Гб], полученной при обследовании здоровых доноров с использованием тех же тест-систем. Секреция Эпо признавалась низкой, если log_Эпо(факт/прогн) был менее 0,938, высокой при log_Эпо(факт/прогн) >1,064 [1].

Статистический анализ

Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения SPSS 22.0. Оценка на нормальность проводилась при помощи критерия Колмогорова—Смирнова. Нормально распределенные количественные величины представлены в виде среднего значения (M) и среднего квадратичного отклонения (σ), ненормально распределенные — в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха. Сравнение двух групп проводили при помощи критерия Манна—Уитни, нескольких групп — при помощи критерия Крускала—Уоллеса. Корреляционный анализ проводили при помощи ранговой корреляции Спирмена. Прогностический анализ выполняли при помощи линейной регрессии (для количественных переменных), бинарной логистической регрессии, а также ROC-анализа. Кластеризация проводилась методом К-средних.

Результаты

Распределение концентрации Эпо у больных с сердечной недостаточностью было заметно ассиметрично вправо с медианой 17,8 МЕ/мл (рис. 1, а); log_Эпо(факт/прогн) имеет два отчетливых пика (рис. 1, б). При изучении характера распределения концентрации Эпо в зависимости от наличия анемии отмечено, что медиана концентрации у анемичных больных была выше, чем у пациентов без анемии (рис. 2, а). Несмотря на это, у большинства анемичных больных секреция Эпо была ниже прогнозируемой, что в значительной степени справедливо и для больных без анемии (рис. 2, б).

Рис. 1. Гистограммы концентрации эритропоэтина (а) и log_Эпо(факт/прогн) (б) у больных с сердечной недостаточностью.

а — распределение концентрации эритропоэтина резко ассиметрично вправо; б — распределение log_Эпо(факт/прогн) имеет два пика; вертикальные линии обозначают диапазон ожидаемых значений log_Эпо(факт/прогн).

Рис. 2. Гистограммы концентрации эритропоэтина (а) и log_Эпо(факт/прогн) (б) у больных с сердечной недостаточностью в зависимости от наличия анемии.

а — для анемичных больных характерна более высокая концентрация эритропоэтина; б — сниженная секреция Эпо (log_Эпо(факт/прогн)) превалирует у больных с сердечной недостаточностью независимо от наличия анемии.

Корреляционный анализ

Связь концентрации сывороточного эритропоэтина с гематологическими показателями и концентрацией В-НУП

Не отмечено связи между концентрацией Эпо и log_Эпо(факт/прогн) с концентрацией гемоглобина, числом эритроцитов, средним объемом эритроцита и средним содержанием гемоглобина в нем, так же как и с концентрацией В-НУП.

Не выявлено взаимосвязей между абсолютной концентрацией Эпо и показателями статуса железа, тогда как отмечена положительная корреляция между log_Эпо(факт/прогн) и концентрацией трансферрина (ρ=0,481, p=0,008, log_Эпо(факт/прогн)=0,46+0,002×[трансферрин], p=0,024).

Концентрация эритропоэтина отрицательно коррелировала с выработанной нагрузкой (ρ=–0,507, p=0,006) и положительно с вентиляторным эквивалентом по CO₂ (ρ=0,452, p=0,016, рис. 3). Также выявлена связь между log_Эпо(факт/прогн) с вентиляторным эквивалентом по CO₂ (ρ=0,393, p=0,038) (табл. 2).

Рис. 3. Диаграмма рассеяния концентрации эритропоэтина и вентиляторного эквивалента по CO₂ у больных с сердечной недостаточностью.

Таблица 2. Линейная регрессия показателей эргоспирометрии

В рамках одновариантной линейной регрессионной модели прогностическими факторами выработанной больным нагрузки являлись концентрации эритропоэтина, сывороточного железа и гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в эритроците, морфофункциональные показатели левого желудочка, а в рамках многовариантной модели — концентрация эритропоэтина и гемоглобина.

Аналогично значение VE/VCO₂, наряду с концентрацией Эпо и log_Эпо(факт/прогн), могут прогнозировать концентрация гемоглобина, КСО, КДО и ФВ ЛЖ. В рамках многовариантной модели прогностическое значение сохранила только концентрация эритропоэтина ([Эпо]=1,103·VE/VCO₂—22,087). Концентрация Эпо более 15,9 МЕ/мл позволяет прогнозировать значение VE/VCO₂ больше 34 (чувствительность 68,4%, специфичность 66,7%, прогностическая ценность положительного результата 81,25%, прогностическая ценность отрицательного результата 50%, отношение правдоподобия положительного результата 2,052, отношение правдоподобия отрицательного результата 0,972).

В рамках одновариантной линейной регрессионной модели прогностическими факторами пикового потребления кислорода являлись концентрации гемоглобина и сывороточного железа, средний объем эритроцита, показатели размера левого желудочка, а в рамках многовариантной модели — концентрация гемоглобина и конечно-систолический объем левого желудочка.

Несмотря на отсутствие значимой корреляции между концентрацией Эпо и пиковым потреблением кислорода (ρ=–0,311, p=0,107), при анализе диаграммы рассеяния (рис. 4) отчетливо отмечалось два облака точек в верхне-левом и нижне-правом углах координатной плоскости. При ROC-анализе показано, что уровень Эпо позволяет удовлетворительно предсказывать пиковое потребление кислорода более и менее 16 мл/мин/м² (AUC=0,705). При этом точка разделения соответствовала концентрации Эпо 16,8 МЕ/мл (чувствительность 68,2%, специфичность 83,3%, прогностическая ценность положительного результата 93,75%, прогностическая ценность отрицательного результата 58,3%, отношение правдоподобия положительного результата 4,092, отношение правдоподобия отрицательного результата 0,382). Больных с большим уровнем Эпо (табл. 3) отличали худшие результаты теста 6-минутной ходьбы, чаще отмечались лабораторные признаки анемии с тенденцией к большим значениям ферритина, меньшие значение анаэробного порога и VE/VCO₂, тенденция к более продолжительной искусственной вентиляции легких. Послеоперационная летальность у больных с концентрацией Эпо менее 16,8 МЕ/мл составила 8,3%, более 16,8 МЕ/мл — 18,8%.

Рис. 4. Диаграмма рассеяния концентрации эритропоэтина и пикового потребления кислорода у больных с сердечной недостаточностью.

Таблица 3. Сравнение пациентов в зависимости от концентрации эритропоэтина

Максимальное послеоперационное значение сывороточного лактата не зависело от исходной физической работоспособности и продукции эритропоэтина. Его прогностическими факторами являлись исходное число эритроцитов (но не концентрация гемоглобина), а также кровопотеря и зависящие от нее послеоперационный уровень гемоглобина и объем перелитых аллогенных эритроцитов (табл. 4). Концентрация лактата более 3,7 ммоль/л позволяла предсказывать неблагоприятный результат лечения (летальность и длительность ИВЛ более 24 ч). Наибольшее значение в прогнозе максимальных значений лактата имел объем кровопотери более 525 мл (табл. 4).

Таблица 4. Предикторы гиперлактатемии в раннем послеоперационном периоде

Примечание. * — значимость в рамках многовариантной модели.

Кластерный анализ

При объединении в модели концентрации гемоглобина, пикового потребления кислорода, абсолютного и относительного уровня эритропоэтина сформировано три достаточно обособленные группы (рис. 5). Больные в кластере 1, несмотря на низкую абсолютную и относительную продукцию эритропоэтина, характеризовались наиболее высокими значениями VO₂ и концентрации гемоглобина (табл. 5), более высокой толерантностью к физической нагрузке, более высокими VE/VO₂ и анаэробным порогом, меньшим VE/VCO₂ (табл. 6). При сопоставимости VO₂(пик) во 2 и 3 кластерах их отличали концентрация гемоглобина и продукция Эпо. Больные 2 кластера с высокой продукцией Эпо характеризовались широкой дисперсией концентрации В-НУП, высокой концентрацией трансферрина, микроцитарной гипохромной морфологией эритроцитов (табл. 6). Больные 3 кластера с высокой продукцией Эпо характеризовались анемией, гипоферремией в сочетании с максимальной концентрацией ферритина и тенденцией к дилатации левого желудочка.

Рис. 5. Диаграмма рассеяния концентрации эритропоэтина и концентрации гемоглобина у больных с сердечной недостаточностью в зависимости от принадлежности к кластерам.

Таблица 5. Конечные центры кластеров

Таблица 6. Сравнение пациентов в зависимости от принадлежности к кластерам

Обсуждение

Обычно эритропоэтин рассматривается как гемопоэтический фактор, дефицит которого связан с развитием анемии. Однако рецепторы эритропоэтина также экспрессируются многочисленными неэритроидными клетками: эндотелием, кардиомиоцитами, миобластами скелетной мускулатуры, нейронами [2], обеспечивая поддержание в них энергетического метаболизма [3], стимулируя ангиогенез [4], прежде всего, в условиях гипоксии. Независимо от ее причины, глобального или фокального характера секреция Эпо находится под контролем гипоксией-индуцированного фактора (ГИФ). Стабилизация ГИФ на фоне гипоксии приводит, в том числе, к активации синтеза эритропоэтина, который, связываясь со своим рецептором, при участии Jak2 способен активировать STAT3/STAT5, MAPK и PI3К сигнальные пути.

Ожидаемо НК характеризуется высокими концентрациями Эпо, сопряженными с ее тяжестью и негативным прогнозом [1, 5—8]. Показано, что наихудший прогноз общей и сердечно-сосудистой смертности характерен для больных с концентрацией Эпо более 16 Ед/л [6]. На первый взгляд парадоксальным является то, что высокая концентрация Эпо нередко сочетается с анемией. При этом секреция Эпо, выражающаяся в log_Эпо (факт/прогн), часто находится ниже должных значений [9] и оказывается негативно связанной с возрастом, тяжестью недостаточности кровообращения, фракцией выброса левого желудочка, активностью воспаления [9] и положительно с летальностью [10] и скоростью клубочковой фильтрации. Таким образом, с одной стороны, секреция Эпо у больных с НК, особенно у пациентов с НК-ассоциированной анемией, нередко снижена, а с другой отмечается резистентность к Эпо [9, 10]. Имеющиеся противоречия побудили нас изучить связи секреции Эпо с транспортом кислорода и физической работоспособностью, в том числе в контексте прогноза результатов оперативного вмешательства в условиях искусственного кровообращения.

Настоящее исследование показало, что, несмотря на бóльшую абсолютную концентрацию Эпо у больных с НК и анемией, у значительной доли больных она не достигает прогнозируемой. Два пика на кривой распределения log_Эпо (факт/прогн) соответствуют двум категориям пациентов с НК — с адекватной и недостаточной секрецией Эпо, которая может отмечаться как при наличии, так и отсутствии анемии, создавая предпосылки к ее возникновению. Таким образом, концентрация Эпо и log_Эпо(факт/прогн) имеют различный физиологический смысл и не дублируют друг друга.

Концентрацию Эпо можно рассматривать как маркер аэробного метаболизма. Ее значения менее 16,8 МЕ/мл сопряжены с большим пиковым потреблением кислорода, большей продукцией CO₂, большей толерантностью к физической нагрузке, лучшими результатами хирургического лечения. Хроническая гипоксия, находящая свое отражение в высокой концентрации Эпо, имеет иные патофизиологические механизмы и плохо связана с послеоперационной острой гипоксией, которая в наибольшей степени определяется кровопотерей, реализующей свои патологические влияния, прежде всего, через гиповолемию и повреждение эндотелия [11].

log_Эпо(факт/прогн) не был связан с показателями транспорта кислорода. Возможно, это определяется особенностями его расчета, который устанавливает связь между прогнозируемыми и фактическими концентрациями гемоглобина и Эпо. Допускаем, что картина была бы иной, если бы log_Эпо рассчитывали на основании показателей тканевой оксигенации, например, VE/VCO₂. Несмотря на это, log_Эпо(факт/прогн) отражает адекватность секреции Эпо у больных с НК, в том числе при высокой концентрации Эпо и отсутствии анемии, и может служить ориентиром для проведения терапии препаратами Эпо. Кластерный анализ представляет убедительную иллюстрацию представленных различий двух показателей Эпо. Больные с профилем 1 без признаков гипоксии отличаются низкой концентрацией Эпо и не требуют его высокой секреции. Напротив, больные с профилем 3, несмотря на более высокую концентрацию Эпо, имеют сопоставимый с больными кластера 1, но не достаточный в условиях гипоксии уровень секреции Эпо. Больные с профилем 2 характеризуются гипоксией, сопровождающейся достаточной секрецией Эпо, обусловливающей его высокую концентрацию. Учитывая большую дисперсию значений НУП, можно полагать, что значительный вклад в снижение концентрации гемоглобина у больных 2 кластера вносит гемодилюция. Очевидно, что прогностически наиболее благоприятным является профиль 1. Больные с профилем 3 могут рассматриваться как кандидаты на терапию Эпо. Взаимосвязь между log_Эпо(факт/прогн) и концентрацией трансферрина может служить отражением железо-рестриктивного эритропоэза при высоком уровне секреции Эпо. Данный факт указывает на необходимость применения препаратов железа в кластере 2, в т.ч. в случаях фармакологической трансформации профиля 3 в профиль 2. При анализе статуса пациента необходимо учитывать, что причинами недостаточной секреции Эпо также могут быть дисфункция почек или влияние провоспалительных цитокинов.

Отсутствие связи концентрации Эпо с гематологическими показателями может быть обусловлено НК-ассоциированной дисфункцией костного мозга, гипоферремией, фармакологическими влияниями.

Говоря о НК-ассоциированной дисфункции костного мозга, необходимого заметить, что Эпо обеспечивает контроль над пролиферацией и дифференцировкой предшественников эритроцитов только с этапа эритроидной колониеобразующей единицы, тогда как более ранние предшественники находятся под контролем иных ростовых факторов, которые продуцируются клетками стромы костного мозга, тем самым определяя вклад костномозгового микроокружения в гемопоэз и объясняя его нарушения вследствие повреждения стромы костного мозга на фоне НК. У больных с сердечной недостаточностью оба этих звена могут находиться под влиянием значительного числа патологических факторов, что и может обусловливать развитие анемии. Например, при НК показано уменьшение числа гемопоэтических клеток [12—14], активация их апоптоза [12, 15], нарушение высвобождения предшественников эритроидов из костного мозга [14, 16]. Прямое стимулирующее воздействие на синтез Эпо оказывают ангиотензин II и вазопрессин [17]. Также ангиотензин II способен стимулировать пролиферацию ранних предшественников эритроидов, тогда как его ингибиторы оказывать обратное действие.

Усиление апоптоза гемопоэтических клеток при ишемической природе сердечной недостаточности связано с увеличением экспрессии ФНО-α [15], исключение влияния которого способствовало восстановлению гемопоэза, тогда как при неишемической этиологии возможным триггером костномозговой дисфункции рассматривается NO [15]. Изменения в регуляции гемопоэза могут быть связаны с гиперкатехоламинемией, характерной как для тяжелой травмы [18], так и для недостаточности кровообращения.

Следует заметить, что процессы регуляции секреции Эпо являются железозависимыми. И если на этапе стабилизации ГИФ гипоксия и гипоферремия действуют синергично, стимулируя синтез ЭПО, то на этапе регуляции трансляции ГИФ2α, в которой участвует железо-чувствительные элементы, блокируемые железо-регуляторным белком при дефиците железа, продукция Эпо может угнетаться [19].

Заключение

Концентрация эритропоэтина может служить объективным критерием тяжести циркуляторной гипоксии и предиктором результатов хирургического лечения, однако она должна рассматриваться в совокупности с log_Эпо(факт/прогн). Концентрация Эпо более 16,8 МЕ/мл отражает анаэробный характер метаболизма. Пациенты с недостаточной секрецией Эпо, обуславливающей ее низкую концентрацию, могут рассматриваться как кандидаты на дооперационное применение препаратов эритропоэтина.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.