Сравнительное исследование влияния блокаторов калиевых каналов на электрофизиологические параметры предсердия и легочных вен при гипоксии и закислении

Суправентрикулярные нарушения ритма встречаются у 2—3% населения [1, 2]. В России приблизительно 3—4 млн человек страдают от подобного нарушения ритма. Согласно данным английских и американских исследователей, количество выявленных больных с каждым годом возрастает и по разным прогнозам, основанным на известных данных, к 2050 г. количество заболевших может достигнуть 5—15% населения. Суправентрикулярные нарушения ритма являются непосредственными причинами ухудшения качества жизни вплоть до потери трудоспособности, а также они существенно отягчают заболевания сердечно-сосудистой системы.

В 1998 г. показано, что в 95% случаев суправентрикулярные нарушения ритма возникают в области устьев легочных вен (ЛВ) [3]. В более поздних работах данная цифра была скорректирована в меньшую сторону — порядка 50—70% [4, 5]. На данный момент принято считать, что причиной возникновения в ЛВ нарушений ритма становится «очаг активности», расположенный в этой области. В частности, показано, что данная область обладает рядом электрофизиологических особенностей и способна проявлять автоматическую активность [6, 7] по сравнению с миокардом предсердий под действием адренолина.

Рефралон — новый отечественный препарат 3-го класса, запатентованный в 2012 г. и показавший свою высокую эффективность в доклинических исследованиях, а также подтвердивший высокую антиаритмическую активность, достигшую 90% в клинических исследованиях [8—11]. В независимости от времени возникновения фибрилляции предсердий (ФП) препарат демонстрировал высокую эффективность, а также был еще более эффективен при трепетании предсердий (ТП). Согласно теории циркулирующей волны [12, 13] ТП вследствие зазора между головой и хвостом волны легче прекратить электрическим разрядом, чем терапевтическими методами. С ФП противоположная ситуация: электрический стимул нужно давать большей мощности, чтобы возбудить миокард в узком зазоре между головой и хвостом волны возбуждения. Однако в противопоказаниях к применению данного препарата указано, что он не изучался при тяжелой дыхательной недостаточности, тяжелой хронической сердечной недостаточности, остром коронарном синдроме. То есть при состояниях, при которых возникает гипоксия и понижается pH в миокарде.

Цель работы — выяснить, как Рефралон действует на препарат левого предсердия и ЛВ в условиях гипоксии и понижения pH, а также сравнить действие Рефралона с Соталолом (антиаритмический препарат 3-го класса) и высокоселективным блокатором I_kr — Е-4031.

Опыты проводили на крысах линии вистар массой 300±50 г. Выделение препарата проводили по протоколу, описанному ранее в статье [14] с использованием того же оборудования и частью повторяющегося протокола.

Измерения проводили не ранее чем через 30 мин после нагревания раствора Тироде до 37 °C. Потенциалы действия (ПД) регистрировали при помощи стеклянных микроэлектродов, заполненных 3М раствором KCl (сопротивление электродов от 15 до 40 МОм). Сигналы усиливали при помощи усилителя KS-701 (W-P Instruments) и IE-210 (WARNER). Все сигналы записывали в цифровой форме (частота оцифровки — 5кГц) на компьютер с помощью АЦП (Е-154, L-Card). Для записи и обработки сигналов использовали программу L-Graph. ПД отводили с эндокардиальной стороны. Электроды устанавливали в предсердие недалеко от ушка, устье ЛВ и в дистальной части ЛВ (ДЛВ).

После окончания адаптации производили стимуляцию препарата с Т=300 мс, после каждого 20-го стимула давался экстрастимул через 150 мс той же амплитуды, запись осуществлялась в течение 1 мин. Затем уменьшали время экстрастимула и снова записывали ПД в течение минуты. Уменьшение времени нанесения экстрастимула проводили до тех пор, пока навязывался ритм (стимул—ответ) в предсердии. Время экстрастимула составляло 150, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15 мс. После определения минимально-навязываемого времени экстрастимуляцию отключали и ждали 5 мин. Минимальное время, при котором навязывался экстрастимул, считали эффективным рефрактерным периодом (ЭРП) в данной области.

После окончания адаптации проводили запись ПД при периоде стимуляции 300 мс в течение 1 мин. Далее увеличивали частоту стимуляции и снова записывали ПД в течение 1 мин. Увеличение частоты стимуляции проводили до тех пор, пока навязывался ритм (стимул—ответ) 1:1 в устье предсердии. Периоды стимуляции составляли 300, 200, 150, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 и 30 мс. После определения минимально-навязываемого периода стимуляции, который считали функциональным рефрактерным периодом (ФРП) период стимуляции восстанавливали до 300 мс и ждали в течение 30 мин.

После адаптации раствор менялся на раствор Тироде с рН=6,6 за счет добавления молочной кислоты или с 50% содержанием O₂. 50%-го содержания O₂ добивались одновременной подачей растворов перфузирующихся карбогеном и газовой смесью (95% N₂ и 5% CO₂). После подачи измененных растворов ждали 30 мин и повторяли протоколы измерений ЭРП и ФРП. После определения ФРП период стимуляции восстанавливали до 300 мс и подавали контрольный раствор Тироде в течение 30 мин.

Через 30 мин перфузии контрольным раствором Тироде и восстановления параметров потенциала действия, повторяли протокол измерения ЭРП и ФРП. После определения ФРП ждали 30 мин и давали измененный раствор Тироде с рН=6,6 за счет добавления молочной кислоты или с 50% содержанием O₂ и одним из препаратов (Рефралон 30 мкг/кг, Соталол 1,5 мг/кг и Е-4031 1мкМ). Ждали 30 мин и повторяли протоколы измерения ЭРП и ФРП.

Для более точного представления изменения параметров измерения в каждом эксперименте контрольные значения принимались за 100% и относительно них высчитывались изменения. Все величины, указанные в работе, представлены как средние значения, а их ошибки — стандартными ошибками среднего. Изменения в группе оценивали с помощью парного t-теста Стьюдента, различия между группами — при помощи t-теста Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

В табл. 1 показаны средние значения характеристик потенциалов действия в предсердии устья и дистальной части ЛВ. Видно, что длительность потенциала действия (ДПД) на уровне 90% реполяризации в ДЛВ достоверно меньше, чем в предсердии и УЛВ (50±2 в ДЛВ против 65*±2 и 66*±2 в предсердии и УЛВ соответственно,* p<0,001). Остальные параметры потенциала действия из этих мест достоверно не различаются.

Таблица 1. Основные параметры потенциала действия

Примечание. ПП (мВ) — потенциал покоя, ДПД_90% (мс) — длительность потенциала действия на уровне 90% реполяризации, АПД (мВ) —амплитуда потенциала действия, ЭРП (мс) — эффективный рефрактерный период, ФРП (мс) — функциональный рефрактерный период. * — p<0,05 — статистически значимые различия по отношению к предсердию; ‘ — p<0,05 — статистически значимые различия по отношению к УЛВ.

Абсолютные значения ПП и АПД представлены в табл. 1. Во время гипоксии достоверных изменений потенциала покоя и амплитуды потенциала действия зафиксировано не было, поэтому в табл. 2 эти данные не продемонстрированы.

Таблица 2. Изменения основных параметров потенциала действия (%) от контроля при гипоксии 50%

Примечание. * — p<0,05, ** — p<0,01 — статистически значимые различия по отношению к тому же значению в контроле; ‘ — p<0,05 — статистически значимые различия по отношению к тому же значению в при гипоксии.

Понижение до 50% O₂ приводило к небольшому, но достоверному замедлению скорости проведения в предсердии, УЛВ и ДЛВ, увеличивая время проведения волны возбуждения (107**±2%, 106**±2%, 105**±1% от контроля по всем группам, **p<0,01). Добавление Соталола (104*±2%, 108**±3%, 105**±2% от контроля, *p<0,05, **p<0,01), Рефралона (105**±1%, 104**±1%, 104*±2% от контроля, *p<0,05, **p<0,01) и E-4031 (103*±1%, 104*±1%, 103*±1% от контроля, *p<0,05) не приводило к дальнейшему изменению скорости проведения ни в одной из частей препарата (см. табл. 2).

В то же время ДПД изменялась не равномерно по препарату. Так, в предсердии ДПД достоверно уменьшалась (82**±1% от контроля, **p<0,01), в то время как в УЛВ и ДЛВ данные изменения были недостоверны (96±4%, 102±3% от контроля). Добавление Соталола приводило к достоверному уменьшению ДПД в предсердии (74**’±1% от контроля, ‘p<0,05, **p<0,01) и достоверно не изменялось в УЛВ и ДЛВ. Добавление Рефралона и E-4031 не приводило к достоверным изменениям в предсердии, УЛВ и ДЛВ.

Гипоксия не приводила к достоверному изменению ЭРП в предсердии, УЛВ и ДЛВ (90±3%, 92±2%, 90±3% от контроля соответственно). Но добавление Соталола на фоне гипоксии достоверно уменьшало ЭРП в предсердии, УЛВ и ДЛВ (77*±4%, 78**±5%, 76**±3% от контроля соответственно, *p<0,05). Под действием гипоксии и E-4031 ЭРП не изменялся (93±5%, 96±4%, 97±5% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно).

В то же время Рефралон при гипоксии приводил к достоверному увеличению ЭРП во всех частях исследуемой области (125*±3%, 125*±4%, 148*±5% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,05).

ФРП не изменялся ни под действием гипоксии, ни при добавлении Соталола и E-4031 (см. табл. 2). В то время как Рефралон на фоне гипоксии достоверно увеличивал ФРП (115*±4%, 115*±4%, 163*±19% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,05).

Во время измерения ЭРП фиксировалась вероятность возникновения спонтанной экстрасистолы (ЭС) в ответ на внеочередной стимул. В контроле вероятность возникновения ЭС составляла 42% (15/36), при гипоксии вероятность не изменялась — 39% (7/18). Однако после добавления Соталола вероятность ЭС увеличивалась до 80% (4/5), E-4031 достоверно не влиял на вероятность ЭС (40%, 2/5). При добавлении Рефралона ЭС зафиксировано не было (0/8).

Понижение pH приводило к достоверному увеличению времени проведения волны возбуждения от предсердия к ДЛВ, на которое не влияли препараты (125*±4%, 124*±4%, 118*±4% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,01) (см. табл. 3).

Таблица 3. Изменения основных параметров потенциала действия (%) от контроля при рН=6,6

Примечание. * — p<0,05, ** — p<0,01 — статистически значимые различия по отношению к тому же значению в контроле.

Так же понижение pH достоверно уменьшало ДПД (64*±6%, 79*±6%, 76*±3% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,01). Как и в случае со скоростью проведения волны возбуждения добавление Соталола (75*±3%, 75*±4%, 71*±4% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,01), Рефралона (78*±4%, 97±5%, 74*±4% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,01) и Е-4031 (66*±5%, 68*±2%, 65*±4% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,01) к достоверным изменениям не приводили.

Закисление достоверно уменьшало ЭРП в предсердии, УЛВ и ДЛВ (76*±3%, 75*±4%, 74*±5% от контроля соответственно, *p<0,05). Добавление Соталола не приводило к восстановлению ЭРП (84*±5%, 81*±6%, 78*±9% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно, *p<0,05). В то время как Рефралон (93±5%, 97±4%, 97±4% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно) и E-4031(95±5%, 95±5%, 93±4% от контроля в предсердии, УЛВ и ДЛВ соответственно) восстанавливали ЭПР до контрольных значений. ФРП достоверно не изменялся ни при понижении рН, ни при добавлении препаратов (Рефралон, Соталол, E-4031).

Так же во время измерения ЭРП фиксировалась вероятность возникновения ЭС. В контроле вероятность возникновения ЭС составляла 42% (15/36), при рН=6,6 вероятность составляла 61% (11/18). Однако после добавления Соталола вероятность ЭС достигла 83% (5/6), E-4031 и Рефралон достоверно не влияли на вероятность ЭС (50%, 3/6).

Антиаритмических препаратов 3-го класса в мире насчитывается около десятка и еще больше соединений, которые блокируют калиевые токи, но не могут использоваться как лекарственные препараты по тем или иным причинам. Соталол — антиаритмический препарат 3-го класса, блокирует ток I_kr, а так же одна из изоформ блокирует бета-адренорецепторы (в фармокологии применяется D/L-форма). E-4031 блокирует ток I_kr (IC₅₀ = 10 нM) и в меньшей степени I_k,АТФ (IC₅₀ = 31 мкМ) [15—17]. В данном исследовании доза E-4031= 1мкМ была на уровне полной блокады тока I_kr и значительно ниже для существенного воздействия на I_k,АТФ. Рефралон действует в основном на ток I_kr (IC₅₀ = 1,26 нM) и на ток I_K,ACh (IC₅₀ = 9,2 мкМ) [18]. Таким образом, все препараты в первую очередь действуют на ток I_kr и в меньшей степени на другие токи. Тогда можно предположить, что основным различием между препаратами являются либо не выясненные факторы, либо второй по значимости компонент действия данного препарата.

По современным представлениям, продолжительные супровентрикулярные нарушения ритма типа ФП и ТП обусловлены циркулирующей волной возбуждения — re-entry [15, 16]. Для существования циркулирующей волны возбуждения нужно, чтобы длина волны по Виннеру (произведение скорости проведения на величину ФРП), не превышала длину пути, по которому циркулирует возбуждение. Соответственно, для того чтобы прекратить циркуляцию волны возбуждения, необходимо увеличить длину волны возбуждения, чтобы она превысила контур циркуляции [12, 13].

И при гипоксии, и при пониженном pH скорость проведения достоверно уменьшалась и не восстанавливалась при применении ни одного из препаратов (Рефралон, Соталол, E-4031). Что неудивительно, поскольку скорость фронта волны возбуждения в рабочем миокарде определяется работой натриевых каналов и коннексинами, и ни один из исследуемых препаратов на них не действует.

Таким образом, у нас остается возможность увеличить длину волны возбуждения за счет увеличения ФРП. Антиаритмические препараты 3-го класса блокируют калиевые каналы (отвечающие за восстановление потенциала покоя) и за счет этого увеличивают ДПД, которая и приводит к увеличению ФРП. Наши результаты показывают, что ДПД достоверно не различалась от препарата к препарату ни при гипоксии, ни при рН=6,6. Как и в статье, опубликованной ранее [14], ФРП напрямую не коррелирует с ДПД. С другой стороны, вероятность возникновения ЭС хорошо коррелировала с изменением ЭРП как при гипоксии, так и при понижении рН, что можно объяснить тем, что для ЭС не нужен постоянный контур. Наиболее ярко это проявилось при гипоксии, добавление Соталола привело к достоверному уменьшению ЭРП и увеличению вероятности возникновения ЭС, что может быть связано с бета-блокирующим действием, которое не фигурирует у других препаратов. В связи с этим стоит отметить, что потенциал покоя деполяризуется в ДЛВ при альфа-адреностимуляции и гиперполяризуется при бета-адреностимуляции [3]. E-4031 достоверно не влиял на ЭРП при гипоксии. В то время как Рефралон увеличил ЭРП и уменьшил вероятность возникновения ЭС.

Стоит отметить, что ЭС не подразумевают устойчивый контур re-entry, и поэтому корреляция ЭС с ЭРП вполне обоснована. ФП и ТП подразумевают устойчивый контур циркуляции, которого в наших экспериментах не было, поэтому, видимо, и не было корреляции с ФРП. Тем не менее из эксперимента видно, что при гипоксии ФРП достоверно увеличился только при добавлении Рефралона, это дает возможность предполагать эффективность применения Рефралона для прекращения ФП и ТП при гипоксии.

1. Блокаторы тока I_kr (Рефралон, E-4031) способствуют восстановлению ЭРП и предотвращению ЭС при понижении рН, кроме Соталола.

2. Рефралон увеличивает ЭРП при гипоксии в отличие от E-4031 и Соталола, и уменьшает вероятность возникновения ЭС. Также Рефралон достоверно увеличивает ФРП при гипоксии, что может указывать на эффективное его применение для снятия ФП и ТП при гипоксии.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена в рамках НИОКТР-121031300188-6.