Введение

Сердечная недостаточность (СН) является одной из наиболее распространенных причин инвалидизации и смертности пациентов в XXI веке. Количество пациентов с СН во всем мире достигло 64 млн и продолжает неуклонно расти [1]. Причиной развития СН чаще всего становятся дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), ишемическая болезнь сердца (ИБС), инфаркт миокарда и др. Эти заболевания различного генеза приводят к состояниям пациентов, для которых характерны общие черты. Во-первых, в сердце пациентов с СН происходит смещение кардиального энергетического метаболизма в сторону использования глюкозы, а не жирных кислот (ЖК) в качестве основного субстрата. Во-вторых, известно, что при СН в миокарде наблюдаются воспалительные процессы, выраженные в инфильтрации ткани миокарда в основном лимфоцитами, и производстве этими клетками провоспалительных цитокинов [2]. Так, при развитии СН в экспериментах in vivo и in vitro на крысах и мышах было показано, что в ткани миокарда на высоком уровне экспрессируются провоспалительные цитокины, в том числе TNF-альфа и IL-6, которые запускают специфические сигнальные каскады в клетке [3].

Известно, что главным регулятором кардиального энергетического метаболизма является фактор транскрипции PPAR-альфа (рецептор, активируемый пролифератором пероксисом). Важная роль PPAR-альфа в регуляции энергетического кардиального метаболизма при СН активно изучается в настоящее время. Помимо метаболических функций PPAR-альфа также участвует в неметаболических процессах. Показана роль PPAR-альфа в воспалительных процессах, ремоделировании внеклеточного матрикса, окислительном стрессе и кардиальной гипертрофии [4]. Таким образом, PPAR-альфа рассматривается в качестве ключевой молекулы для изучения возможной взаимосвязи патологических процессов в миокарде, в частности, процессов воспаления и смещения кардиального энергетического метаболизма. При этом остается не до конца понятной роль продолжающегося воспалительного процесса и отдельных метаболических изменений в дальнейшем прогрессировании заболевания с исходом в хроническую сердечную недостаточность (ХСН).

Цель исследования — оценка взаимосвязи воспалительных и метаболических процессов на культивируемых кардиомиоцитах человека и в миокарде больных дилатационной кардиомиопатией с ХСН.

Материал и методы

В работе использованы культуры кардиомиоцитов человека, полученные из ткани сердца плодов человека 8—9 недели гестации (n=3), которые были получены в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Организация имеет разрешение локального этического комитета на получение и использование такого материала. Ткань сердца промывали физиологическим раствором (0,9%, «ПанЭко», Россия) с добавлением 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), затем механически измельчали на фрагменты не более 0,5×0,5 мм, перемещали их в 0,1% раствор коллагеназы I типа (Gibco), инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. По окончании инкубации суспензию, содержащую клетки и тканевые фрагменты, осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 200 g, осадок ресуспендировали в среде для культивирования: DMEM/F-12 (1:1, Gibco) с добавлением 10% ЭТС (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко»), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко»), переносили в культуральные флаконы с площадью дна 25 см² (Corning, США). Культивирование клеток проводили при 37 °С в атмосфере 5% CO₂. Смену среды проводили каждые 3-е суток. При достижении состояния 80—90% конфлюэнтности клетки рассаживали в соотношении 1:2. Для снятия клеток с поверхности пластика в культуральный флакон добавляли 0,05% раствор трипсина («ПанЭко»), инкубировали при 37 °С в течение 3 мин, клетки переводили в суспензию, осаждали центрифугированием, осадок ресуспендировали в среде для дальнейшего культивирования или использовали для экспериментов. Для исследования использовали культуры 3—4 пассажа.

Полученные кардиомиоциты обрабатывали провоспалительным цитокином TNF-альфа (50 нг/мл) и через 4, 24 и 48 ч проводили экстракцию РНК из клеток. В качестве контроля использовали кардиомиоциты, которые не подвергались обработке TNF-альфа.

В работе были использованы эндомиокардиальные биоптаты (ЭМБ), полученные от пациентов с диагнозом ДКМП с СН (n=10, из них 8 мужчин и 2 женщины, 26—49 лет, функциональный класс II—IV, стадия ХСН I, II (A—B)). В качестве контроля использовали аутопсийные образцы ткани сердца человека без сердечно-сосудистых заболеваний (n=3, из них 2 мужчин, 1 женщина, 20—52 лет).

Каждый из образцов ткани разделяли на две части. Одну из частей замораживали при температуре –20 °С, используя заливочную среду Tissue — Tek (Sakura Finetek, Япония), далее на криостате фирмы Leica (Германия) проводили приготовление криосрезов. Срезы фиксировали в ацетоне при —20 °С в течение 20 мин для дальнейшего выявления в ткани сердца маркеров лимфоцитов с помощью иммунофлуоресцентного метода. Для проведения окрашивания использовали реактивы аналитической чистоты. Были использованы первичные антитела к маркерам лимфоцитов CD4 и CD8 (Santa Cruz Biotechnology, Inc); вторичные антитела Alexa Fluor (Molecular Probes, США); для окрашивания клеточных ядер был использован DAPI. Срезы заключали в среду Aqua polymount (Polyscience Inc., США). Полученные образцы были исследованы на инвертированном иммунофлуоресцентном микроскопе Axio Observer Z.1 (Zeiss, Германия) с функцией получения изображения. Изображения были получены с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC (Zeiss, Германия) и обработаны в программах Axiovision 3.1 (Zeiss, Германия) и Adobe Photoshop (Adobe Systems, США). Вторые фрагменты каждого из образцов были использованы для проведения ПЦР в реальном времени.

Выделение суммарной РНК из миокардиальной ткани и кардиомиоцитов проводили с помощью набора RNAeasy Plus Mini Kit на приборе QIAcube (Qiagen). Концентрацию РНК в образцах измеряли с использованием набора Qubit™ RNA HS (Invitrogen). Далее для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции, используя набор реактивов QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Посредством метода количественной ПЦР в реальном времени в миокардиальной ткани сердца человека с подтвержденной лимфоцитарной инфильтрацией и в кардиомиоцитах человека после обработки провоспалительным цитокином TNF-альфа изучены уровни экспрессии PPAR-альфа и его генов-мишеней, кодирующих карнитин-пальмитоилтрансферазу-1 (CPT1), транслоказу жирных кислот (CD36/FAT) и длинноцепочечную ацил-КоА-дегидрогеназу (LCAD). В качестве референсного гена взят ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH). Праймеры, использованные в эксперименте, приведены в табл. 1. Олигонуклеотиды для ПЦР в реальном времени были синтезированы компанией «Синтол» с очисткой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Таблица 1. 5’-3’ последовательность прямых — forward (FOR) и обратных — reverse (REV) праймеров исследуемых генов

ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием коммерческого набора «ПЦР комплект EvaGreen» («Синтол») на амплификаторе Rotor-Gene 3000 с программным обеспечением Rotor-Gene 6.0 (Corbett Research, Австралия). Относительный уровень экспрессии генов определяли методом ΔΔСt.

Статистическую обработку полученных данных проводили в программах Excel и GraphPad Prism 8. Для сравнения двух независимых групп, использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. При этом минимальное допустимое количество данных для включения в сравнение N=3, а используемый статистический уровень значимости p≤0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе на культивируемых кардиомиоцитах человека были оценены уровни экспрессии после индукции воспаления с помощью TNF-альфа с экспозицией в 4, 24 и 48 ч. Показано, что через 4 ч воздействия TNF-альфа наблюдается достоверное понижение уровней экспрессии PPAR-альфа (p=0,038) и CPT1 (p=0,029), незначительное понижение уровня экспрессии гена CD36, а также достоверное увеличение уровня экспрессии LCAD (рис. 1). Через 24 ч воздействия TNF-альфа уровни экспрессии PPAR-альфа, CD36 и LCAD были сравнимы с их уровнями через 4 ч, а уровень экспрессии CPT1 значительно увеличивался. Через 48 ч после обработки TNF-альфа наблюдается достоверное увеличение уровней экспрессии PPAR-альфа (p=0,043), LCAD (p=0,029), CD36 (p=0,029). Полученные нами данные позволяют предположить, что ответом на кратковременную экспозицию с провоспалительным цитокином TNF-альфа является понижение уровней экспрессии PPAR-альфа и изменение уровней экспрессии генов-мишеней, тогда как достоверное увеличение уровня экспрессии PPAR-альфа и изменение уровней экспрессии генов-мишеней через 48 ч, вероятно, связано с увеличением противовоспалительной активности PPAR-альфа на клеточном уровне [5].

Рис. 1. Экспрессия mRNA PPAR-альфа и генов-мишеней при обработке культивируемых кардиомицитов человека провоспалительным цитокином TNF-альфа в течение 4, 24 и 48 ч.

а — уровни экспрессии PPAR-альфа; б — уровни экспрессии CPT; в — уровни экспрессии CD36; г — уровни экспрессии LCAD.

Существуют работы, в которых также на клеточных моделях индуцированного воспаления была изучена роль PPAR-альфа в метаболических и неметаболических процессах в кардиомиоцитах. Например, P.J. Smeets и соавт. в 2008 г. изучали воздействие TNF-альфа на маркеры воспаления и гипертрофии и показали, что этот провоспалительный цитокин способствует активации NF-kB, а сверхэкспрессия белка p65, приводит к увеличению транскрипционной активности NF-kB в несколько раз [6]. Таким образом доказано, что воспалительные и гипертрофические сигнальные пути в кардиомиоцитах взаимосвязаны и регулируются NF-kB и PPAR-альфа. D. Kar и соавт. в 2016 г. показали, что гипертрофия кардиомиоцитов, индуцированная фенилэфрином, способствует понижению уровней экспрессии PPAR-альфа, CPT1 и главного катализатора бета-окисления в митохондриях ацил-КоА-дегидрогеназы со средней длинной цепи (MCAD), что приводит к нарушению функций митохондрий [7]. В исследовании T. Haffar и соавт. в 2015 г. было продемонстрировано, что липотоксичность, выявленная в кардиомиоцитах после их обработки IL-6, ассоциирована с пониженным уровнем экспрессии PPAR-альфа [8]. Однако в данных работах не показано прямой взаимосвязи между воздействием TNF-альфа, уровнем экспрессии PPAR-альфа и энергетическим метаболизмом. Кроме того, эти результаты получены на клетках грызунов и требуют подтверждения на клетках человека.

В данной работе в ЭМБ пациентов с ДКМП и СН были выявлены клетки, экспрессирующие лимфоцитарные маркеры CD4 и CD8 (рис. 2). Обнаруженные клетки имеют небольшие размеры, округлую форму и высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение. Такие морфологические характеристики подтверждают их принадлежность к лимфоцитам. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о воспалительных процессах, выраженных в инфильтрации ткани миокарда лимфоцитами. Как известно, эти клетки экспрессируют провоспалительные цитокины, в том числе TNF-альфа. Возможно, провоспалительные цитокины участвуют в изменении кардиального энергетического метаболизма у больных дилатационной кардиомиопатией с ХСН.

Рис. 2. Иммунофлуоресцентное выявление в эндомиокардиальных биоптатах пациентов с ДКМП и ХСН CD8+ и CD4+ клеток.

а — окрашивание антителами к CD8; б — окрашивание ядер с помощью DAPI, в — наложение изображений а и б; г — окрашивание антителами к CD4; д — окрашивание ядер с помощью DAPI, е — наложение изображений г и д. Маштаб 10 мкм. Стрелки указывают на клетки.

В нашей работе было выявлено, что у пациентов с ДКМП наблюдается тенденция к увеличению уровня экспрессии PPAR-альфа, а также изменение уровней экспрессии генов-мишеней (рис. 3), что согласуется с данными, полученными на культуре клеток длительной экспозиции с TNF-альфа в течение 48 ч. При этом уровень экспрессии CPT1 значительно уменьшался (p=0,028), а уровень экспрессии LCAD значительно увеличивался (p=0,038). В исследовании M. Schupp и соавт. в 2006 г. [9] показано, что в ткани миокарда пациентов с ДКМП наблюдается повышенное содержание PPAR-альфа и CPT1 по сравнению с контрольной группой, приводящее к увеличению уровня окисления жирных кислот. Авторы предполагают, что полученные результаты обусловлены длительной адренергической активацией, которая характерна для конечных стадий заболевания. Различные показатели уровней мРНК PPAR-альфа и генов-мишеней в зависимости от стадии заболевания были выявлены в работе E. Czarnowska [10]. Понижение уровней экспрессии PPAR-альфа и генов-мишеней на начальных стадиях заболевания (фракция выброса левого желудочка от 45 до 53%) авторы связывают с энергетическим переходом на использование глюкозы в качестве источника энергии, тогда как повышение уровней экспрессии генов-мишеней на более поздних стадиях (фракция выброса левого желудочка от 30 до 41%) объясняли повышенным потреблением ЖК и сверхактивацией PPAR-альфа в ответ на нарушение клеточной структуры кардиомиоцитов. Вероятно, в миокарде пациентов с ДКМП с более поздними стадиями заболевания, уровни PPAR-альфа экспрессии могут увеличиваться в ответ на воспалительные сигнальные пути по принципу положительной обратной связи [9, 10].

Рис. 3. Сравнительный анализ экспрессии мРНК PPAR-альфа и его генов-мишеней CPT1, CD36, LCAD.

Контрольная группа — К, группа пациентов с ДКМП и СН.

Есть также данные исследователей, которые в своих экспериментах получили противоположные результаты. Например, V.G. Davila-Roman и соавт. в 2002 г. с помощью методики позитронной эмиссионной томографии показали на пациентах с идиопатической ДКМП уменьшение уровня экспрессии PPAR-альфа, объясняющееся снижением метаболизма жирных кислот и увеличением метаболизма глюкозы [11]. Кроме того, ранее в нашей лаборатории в ткани миокарда были изучены уровни экспрессии PPAR-альфа и генов-мишеней у больных ИБС и СН [12, 13]. В данной работе было показано, что у больных происходит уменьшение уровня экспрессии PPAR-альфа и изменение уровней экспрессии генов-мишеней по сравнению контролем. Вероятно, на смещение кардиального энергетического метаболизма влияют сразу несколько факторов: этиология заболевания, приводящего к развитию сердечной недостаточности, стадия заболевания и индивидуальные особенности метаболизма пациентов. В нашей работе были изучены пациенты, у которых ДКМП была диагностирована на разных стадиях. Дальнейший набор статистики, сопоставление полученных данных со стадиями ДКМП и индивидуальными особенностями каждого пациента поможет установить причину смещения кардиального энергетического метаболизма в ту или другую сторону. Таким образом, существующие в литературе данные и полученные в этой работе результаты свидетельствуют о том, что PPAR-альфа играет значительную роль в метаболических процессах в кардиомиоцитах при развитии СН, связанной с ДКМП.

Заключение

Показано, что в миокарде пациентов с ДКМП и СН, а также в кардиомиоцитах человека после обработки провоспалительным цитокином TNF-альфа в течение 48 ч уровень экспрессии PPAR-альфа увеличивается и изменяются уровни экспрессии генов-мишеней. Эти результаты могут свидетельствовать, что воспалительные и метаболические пути в кардиомиоцитах взаимосвязаны, а важнейшую роль в данных процессах играет PPAR-альфа. Мы полагаем, что выявленное увеличение уровня экспрессии PPAR-альфа ассоциировано с его противовоспалительной активностью. Полученные на клеточной модели данные позволяют предположить, что воспаление может вносить вклад в изменение метаболизма также и у больных ДКМП с СН, однако этот вопрос требует дальнейшего изучения. Хотя точные механизмы взаимосвязи воспалительных и метаболических процессов при СН остаются неизвестными, показана важная регуляторная роль PPAR-альфа. Уникальность рецептора PPAR-альфа заключается в том, что при воздействии на этот фактор транскрипции можно одновременно подавлять активность воспаления, ингибируя NF-kB, а также влиять на метаболический фенотип, регулируя транскрипцию генов-мишеней PPAR-альфа. Требуются дальнейшие работы для определения возможной роли данного фактора в качестве терапевтической мишени, а также потенциального диагностического маркера у пациентов с СН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.