Введение

МикроРНК — обширный класс коротких одноцепочечных некодирующих РНК, которые участвуют в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Полное или неполное комплементарное связывание затравочной области микроРНК, состоящей из 6—8 нуклеотидов, с сайтами посадки на мРНК-мишенях приводит к деградации или подавлению трансляции последних [1]. Действие микроРНК характеризуется плейотропностью, то есть одна микроРНК способна связываться со многими мРНК-мишенями, и избыточностью, таким образом уровень одной мРНК может регулироваться многими микроРНК [2]. За счет этого микроРНК, подобно цитокинам, формируют координированную сеть взаимодействий, которая обеспечивает дополнительный контроль фундаментальных биологических процессов, таких как апоптоз, пролиферация, дифференцировка, реакция на стресс и др.

Исследования последних лет показали, что микроРНК участвуют в развитии и прогрессировании различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистых (ССЗ) [3]. Ранее мы обнаружили, что у больных инфарктом миокарда (ИМ) уровень циркулирующей miR-375 в плазме крови значимо меньше, чем у здоровых индивидов [4]. Поскольку для микроРНК известны механизмы избирательного транспорта из сосудистого русла в окружающие ткани путем эндоцитоза экзосом и микровезикул [5, 6], мы предположили, что одной из причин снижения уровня miR-375 в плазме может быть ее активный импорт в клетки, участвующие в патогенезе ИМ, где она регулирует экспрессию своих прямых мРНК-мишеней. Проведенный in silico анализ выявил гены-мишени, на которые с наибольшей вероятностью miR-375 может оказывать свое регуляторное действие [4], а количество экспериментальных исследований механизмов участия этой микроРНК в развитии различных ССЗ весьма невелико.

Одним из наиболее информативных методов изучения функциональной роли отдельных микроРНК считается анализ in vitro полнотранскриптомных профилей экспрессии генов в ответ на экспериментальное изменение уровня микроРНК в клетках. Удобной моделью для изучения функциональной роли miR-375 при ССЗ могут быть эндотелиоциты, которые являются основной клеточной популяцией, осуществляющей избирательный транспорт макромолекул из сосудистого русла, и при этом играют важную роль в развитии сердечно-сосудистой патологии. Настоящая работа — один из этапов изучения вовлеченности miR-375 в сигнальные пути, связанные с развитием ССЗ, выполнена на модели эндотелиальных клеток пупочной вены человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC). Полученные данные могут внести вклад в раскрытие miR-375-опосредованных механизмов патогенеза ССЗ, а также выявить новые потенциальные мишени для улучшения диагностики и лечения заболеваний.

Цель исследования — оценить влияние повышения уровня miR-375 за счет введения в клетки HUVEC мимика miR-375 (в сравнении с олигонуклеотидом, не комплементарным известным РНК человека, в качестве негативного контроля) на профиль экспрессии генов.

Материал и методы

Культивирование клеток. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) выращивали в культуральной среде Microvascular Endothelial Cell Growth Medium (Cell Applications, Inc.) на поверхности, покрытой желатином. Среду для культивирования заменяли каждые 2 дня, при достижении 85—90% конфлюэнтности клетки пассировали; плотность посева 16—30 тыс. клеток на см². Для пассирования использовали трипсин (0,05%): этилендиаминтетрауксусную кислоту (0,53 мМ) (Sigma-Aldrich) и раствор для ингибирования трипсина Trypsin inhibitor from Glycine max (Sigma-Aldrich). Культивирование проводили при 37 °C в атмосфере 5% CO₂. Для всех экспериментов использовали клетки на 3—5 пассажах. Клетки HUVEC были предоставлены сотрудниками лаборатории клеточной подвижности НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России.

Трансфекция клеток. За 24 ч до трансфекции клетки HUVEC высевали в количестве 200 тыс. клеток на 6-луночные планшеты. Для подбора оптимальных условий трансфекции клетки трансфицировали коммерческими синтетическими РНК-олигонуклеотидами в концентрации 10, 20 и 30 nM с использованием реагента Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколу производителя. Для трансфекции были взяты два РНК-конструкта (Thermo Fisher Scientific): мимик miR-375 и контрольный олигонуклеотид (КО), не комплементарный известным РНК человека, в качестве негативного контроля. Эксперименты проводились с тремя повторениями. Спустя 24 или 48 ч после трансфекции клетки собирали для последующих экспериментов.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР. 0,5—1 млн клеток HUVEC снимали с подложки и осаждали центрифугированием при 300 g, клеточный осадок лизировали в реагенте Trizol (Thermo Fisher Scientific). В ряде экспериментов на этой стадии клеточные лизаты хранили при –70 °C до использования. Для оценки базового уровня экспрессии miR-375 РНК, содержащую фракцию микроРНК, выделяли с помощью коммерческого набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Для транскрипционного профилирования тотальную РНК выделяли посредством применения набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Количество выделенной РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific), а качество — по индексу целостности РНК (RNA Integrity Number, RIN) на системе капиллярного гель-электрофореза QIAxcel Advanced System (Qiagen).

Обратную транскрипцию и количественную ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР) проводили с использованием TaqMan Small RNA Assays в T100 Thermal Cycler (Bio-Rad) и StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) соответственно. После амплификации рассчитывали уровень miR-375 относительно референсного гена малой ядерной РНК RNU48, применяя дельта-дельта Ct (ΔΔCt) метод.

Оценка уровня апоптоза и жизнеспособности клеток. Уровень апоптоза в клетках HUVEC определяли методом проточной цитофлуориметрии после двойного окрашивания аннексином V, меченным FITC, и йодидом пропидия (Annexin V-FITC Kit (Beckman Coulter)) согласно протоколу производителя. Жизнеспособность и пролиферативную активность клеток оценивали с помощью МТТ-теста по скорости восстановления тетразолиевого красителя. Для этого клетки высевали на 96-луночный планшет в количестве 5 тыс. на лунку и трансфицировали, как описано выше. Спустя 24 или 48 ч после трансфекции в лунки добавляли раствор тетразолиевого красителя МТТ (конечная концентрация 0,5 мг/мл) (Sigma-Aldrich) и инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 4 ч. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде (150 мкл/лунку) (Sigma-Aldrich). Оптическую плотность (OD) оценивали на планшетном спектрофотометре при длине волны 570 нм. Значение OD использовали как показатель жизнеспособности клеток. Для оценки пролиферативной активности применяли коэффициент пролиферации, который рассчитывали по формуле: OD спустя 48 ч после трансфекции/OD спустя 24 ч после трансфекции. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы GraphPad Prism 8.4.3 с использованием непараметрического критерия Краскела—Уоллиса.

Транскрипционное профилирование. Библиотеки для секвенирования готовили из тотальной РНК с помощью набора MGIEasy RNA Library Prep Set (MGI) согласно протоколу производителя. Секвенирование осуществляли на приборе MGISEQ-200 (BGI). Анализ качества прочтений выполняли при помощи ПО FastQC. Прочтения низкого качества были отфильтрованы, а участки прочтений с флуктуациями GC состава в начале прочтения были обрезаны при помощи ПО Trimmomatic Version 0.39 и исключены из дальнейшего анализа. Выравнивание прочтений на референсный геном осуществлялось при помощи ПО STAR Version 2.7.6a. В качестве референсного генома использовали актуальную версию генома человека (Genome sequence, primary assembly, GRCh38) из проекта GENCODE. Подсчет прочтений, выравнивающихся на определенный ген, проводили при помощи опции GeneCounts в ПО STAR. Для выявления дифференциально экспрессирующихся генов использовали пакет DESeq2 для языка программирования R. Значимыми считали различия, характеризующиеся значением p менее 0,05 и отношением уровней экспрессии (Fold Change, FC) более 2.

Результаты

Для подбора оптимальных условий трансфекции клетки HUVEC трансфицировали мимиком miR-375 или КО в концентрациях 10, 20 и 30 nM. Спустя 48 ч после трансфекции оценили уровни экспрессии miR-375 в трансфицированных и интактных клетках методом ОТ-ПЦР. Через 48 ч после трансфекции клеток мимиком miR-375 уровни miR-375 возросли на 4—5 порядков по сравнению с клетками, трансфицированными КО, а также с интактными клетками (рис. 1). Максимальный уровень miR-375 (почти в 1700 раз превышающий уровень экспрессии референсного гена RNU48) наблюдали при трансфекции мимиком miR-375 в концентрации 10 nM; при дальнейшем увеличении концентрации мимика до 20 и 30 nM уровень miR-375 несколько снижался. Трансфекция клеток КО не приводила к принципиальному изменению уровня miR-375 по сравнению с интактными клетками. Для дальнейших исследований была выбрана концентрация РНК-конструктов 10 nM.

Рис. 1. Уровни экспрессии miR-375 относительно экспрессии референсного гена RNU48 (в логарифмическом масштабе) в клетках HUVEC, трансфицированных мимиком miR-375 (красные столбцы) или контрольным олигонуклеотидом (синие столбцы), в концентрациях 10—30 nM, спустя 48 ч после трансфекции.

Относительный уровень miR-375 в интактных клетках (зеленый столбец).

Мы оценили влияние повышения уровня miR-375 на жизнеспособность, пролиферативную активность и уровень апоптоза HUVEC через 24 и 48 ч после трансфекции. Жизнеспособность интактных клеток и клеток, трансфицированных мимиком miR-375 или КО, значимо не различалась, равно как и значения коэффициента пролиферации, которые для клеток, трансфицированных мимиком miR-375, для КО и интактных клеток составили 1.60, 1.65, 1.71 соответственно. Уровень апоптоза в клетках всех трех групп имел показатель 7,5—7,8%; значимых различий также выявлено не было. Таким образом, экспериментальное повышение уровня miR-375 в клетках HUVEC не приводило к значимому изменению пролиферативной активности клеток и уровня их апоптоза при сравнении как с отрицательным контролем трансфекции, так и с интактными клетками.

Для оценки влияния повышенного уровня miR-375 на профиль экспрессии генов мы провели полнотранскриптомный анализ в клетках HUVEC через 24 и 48 ч после трансфекции. Сравнение транскриптомных профилей клеток HUVEC через 24 ч после экспериментального повышения уровня miR-375 с профилями клеток, трансфицированных КО, выявило снижение экспрессии генов RNA5SP38, VTRNA1-1, RNU7-156P, AC091057.1 (p<0,05; log2FC<-1) и повышение экспрессии генов RNU6ATAC32P, CXCL8, RNU6-760P (p<0,05; log2FC>1) (рис. 2, а). Через 48 ч после трансфекции снижалась экспрессия генов RNU7-62P, RNY1P15, AC107390.1, COILP1 и повышалась экспрессия генов LINC00476, MIR596, AP003778.1 (рис. 2, б). Ни для одного из этих генов не наблюдались изменения экспрессии в обеих временных точках.

Рис. 2. Транскриптомные профили клеток HUVEC через 24 ч (а) и 48 ч (б) после экспериментального повышения экспрессии miR-375 в сравнении с клетками, трансфицированными контрольным олигонуклеотидом.

На volcano-диаграмме ось Х отражает отношения уровней экспрессии (Fold Change, FC) в сравниваемых группах, ось Y — значения p, все в логарифмическом виде. Дифференциально экспрессирующиеся гены отмечены красными точками. Горизонтальная пунктирная линия отражает порог статистической значимости p=0,05, вертикальные линии — пороги отношения уровней экспрессии в сравниваемых группах Log2FC=–1 и Log2FC=1

Среди дифференциально экспрессирующихся генов присутствуют как белок-кодирующие гены (CXCL8), так и гены некодирующих РНК различных классов, таких как малая ядрышковая РНК (AC107390.1), длинная некодирующая РНК (AC091057.1), РНК рибонуклеопротеина Vault (VTRNA1-1), микроРНК (MIR596), антисмысловая РНК (LINC00476), псевдогены и другие некодирующие РНК (RNA5SP38, RNU6ATAC32P, RNU7-156P, RNU6-760P, RNU7-62P, AP003778.1, RNY1P15, COILP1).

Среди белок-некодирующих генов, уровни экспрессии которых изменялись при повышении уровня miR-375, присутствует ген другой микроРНК, miR-596; увеличение ее уровня наблюдали через 48 ч после трансфекции. С целью выявления общих регуляторных путей, на которые могут оказывать влияние и miR-375, и miR-596, проведен поиск общих генов-мишеней этих микроРНК с использованием базы данных miRTarBase, содержащей информацию об экспериментально валидированных мишенях различных микроРНК [7]. Общими мишенями для miR-375 и miR-596 оказались гены MCL1, WWC2, CNBP и SOX4 (рис. 3). Следует отметить, что для одного из этих генов, WWC2, мы наблюдали одновременное с повышенными уровнями miR-596 и miR-375 значимое снижение экспрессии (p=0,047), хотя эти изменения и не были выраженными (log2FC= –0,37).

Рис. 3. Сети взаимодействия miR-375 и miR-596 с их генами-мишенями.

Синими квадратами обозначены узлы сети, соответствующие анализируемым микроРНК, кружками — узлы, соответствующие их генам-мишеням. Желтым цветом выделены те гены-мишени, для которых наблюдались значимые изменения в экспрессии при повышении уровня miR-375 (p<0,05). Гены-мишени, общие для двух микроРНК, обозначены крупными кругами и подписаны.

При транскриптомном анализе мы наблюдали также значимую дерегуляцию (p<0,05) других прямых генов-мишеней miR-375: повышение уровня экспрессии GDAP1, VASN, RIDA, TPRG1L, SESN1, F3 и TGFB2 (0.32>Log2FC>0.42) и снижение уровня экспрессии KIAA1191, VPS37D, RIMS3, YAP1 (–0.45-0.3) (отмечены желтым на рис. 3); изменения в уровнях их экспрессии также были невыраженными.

Нельзя не отметить, что в клетках HUVEC регуляторный эффект при повышении уровня miR-375 оказался весьма умеренным.

Поскольку miR-375 ингибирует гены-мишени сигнальных путей, приводящих к выживанию и пролиферации клеток и к апоптозу [4], мы оценили влияние повышения уровня miR-375 на жизнеспособность и пролиферативную активность HUVEC с помощью МТТ-теста. При оценке посредством непараметрического критерия Краскела—Уоллиса жизнеспособность интактных клеток и клеток, трансфицированных мимиком miR-375 или NC, значимо не различалась, как и КП, который для клеток, трансфицированных мимиком miR-375, для NC и интактных клеток составил 1.60, 1.65, 1.71 соответственно.

Уровень апоптоза определяли методом проточной цитофлуориметрии после двойного окрашивания аннексином V, меченным FITC, и йодидом пропидия. Уровень апоптоза составлял 7,5—7,8%. Значимых различий между уровнем апоптоза в интактных клетках и в клетках, трансфицированных мимиком miR-375 или NC, выявлено не было. Таким образом, экспериментальное повышение уровня miR-375 в клетках HUVEC не приводило к значимому изменению пролиферативной активности клеток и уровня их апоптоза при сравнении как с отрицательным контролем трансфекции, так и с интактными клетками.

Обсуждение

В ходе настоящего исследования мы показали, что экспериментальное повышение уровня miR-375 в клетках HUVEC приводит к значимым изменениям уровней экспрессии ряда белок-кодирующих и белок-некодирующих генов, продукты которых могут участвовать в развитии ССЗ.

Белок-кодирующий ген CXCL8, повышение экспрессии которого выявлено нами через 24 ч после трансфекции, кодирует один из основных провоспалительных хемокинов, продуцируемый эндотелиальными клетками — интерлейкин 8 (хемокин CXCL8). Показано, что он может взаимодействовать сразу с несколькими ключевыми генами-мишенями miR-375, вовлеченными в воспалительные реакции, — STAT1, CCL27 и IGF1R [8]. Белковый продукт CXCL8 играет важную роль в ангиогенезе, стимулируя миграцию эндотелиальных клеток через RhoA-опосредованный сигналинг [9]. Продемонстрировано повышение уровня хемокина в сердце и плазме крови пациентов с ИМ, что согласуется с его провоспалительным эффектом; в то же время в экспериментальных условиях в отсутствие лейкоцитов он может оказывать и кардиопротективный эффект, усиливая ангиогенез в ишемизированных тканях [10].

Остальные выявленные нами дифференциально экспрессирующиеся гены представляют собой гены некодирующих РНК различных типов. В настоящее время в литературе отсутствуют данные о прямых взаимодействиях miR-375 и продуктов этих генов (включая согласно современным представлениям и продукты псевдогенов), что может быть связано с недостаточной изученностью большинства из них. Нельзя не отметить, что наблюдаемые изменения в экспрессии генов могут также происходить в результате непрямого опосредованного эффекта miR-375.

Трансфекция клеток HUVEC мимиком miR-375 приводила к увеличению экспрессии miR-596 и снижению экспрессии гена WWC2. Для miR-596 ранее была показана связь с артериальной гипертензией [11]. Кодируемый геном WWC2 (WW-and-C2-domain-containing protein 2) белок участвует в регуляции сигнального пути Hippo, который вовлечен в процессы дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Активация этого пути приводит к замедлению пролиферации и усилению процессов программируемой клеточной гибели. Описана роль WWC2 при различных онкологических заболеваниях [12]. Белок WWC2 важен для правильного развития сосудов: у эмбрионов мышей с нокаутом гена WWC2 наблюдали задержку роста, нарушение развития плаценты и сосудов и, наконец, гибель эмбриона. Полнотранскриптомный анализ у таких эмбрионов выявил массивное нарушение регуляции экспрессии генов, вовлеченных в определение судьбы клетки, метаболизм и ангиогенез [13].

Мы не выявили значимых различий в жизнеспособности, пролиферативной активности и уровне апоптоза клеток, трансфицированных мимиком miR-375. В этой связи следует сказать, что данные литературы о влиянии miR-375 на пролиферацию и апоптоз клеток весьма неоднозначны. Так, показано, что сверхэкспрессия miR-375 способствовала индуцированному хронической гипоксией апоптозу в миобластах крысы H9c2, а нокдаун miR-375 препятствовал его развитию [14]. Однако в другой работе, опубликованной примерно в то же время, утверждается, что повреждение клеток H9c2, вызванное гипоксией с последующей реоксигенацией, которое приводит к значительному увеличению скорости апоптоза и активности каспазы-3, напротив, сопровождается понижением уровня miR-375, а сверхэкспрессия miR-375 заметно снижает апоптоз и уровни каспазы-3 по сравнению с нормальными клетками [15].

Проведенный нами ранее биоинформатический анализ показал, что miR-375 может ингибировать ключевые гены-мишени двух антагонистических сигнальных путей: р53, стимулирующего апоптоз, и PI3K/Akt1, стимулирующего пролиферацию и дифференцировку клеток и отвечающего за уход от апоптоза [4]. В этой связи одним из возможных объяснений противоречивых данных о влиянии miR-375 на поведение клеток может быть плейотропность и мультифункциональность этой микроРНК, участвующей в поддержании равновесия между смертью и выживанием клетки.

Заключение

При повышении уровня miR-375 в клетках HUVEC мы впервые наблюдали дифференциальную экспрессию белок-кодирующих генов, CXCL8 и WWC2, продукты которых участвуют в развитии сердечно-сосудистой системы и в патогенезе ССЗ, что делает перспективным их дальнейшее изучение с целью установления регуляторной роли miR-375 в эндотелиальных клетках. Впервые показано также влияние miR-375 на уровень экспрессии другой микроРНК — miR-596, что предполагает наличие у них общих регуляторных путей и нуждается в дальнейшем исследовании.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №20-015-00123).

Financing. The research was carried out with the financial support of the Russian Foundation for Basic Research (grant No. 20-015-00123).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.