Введение

Язвенная болезнь (ЯБ) представляет собой хроническое рецидивирующее заболевание, протекающее с чередованием периодов обострения и ремиссии, ведущим проявлением которого служит образование дефекта (язвы) в стенке желудка и двенадцатиперстной кишки [1]. По различным оценкам, распространенность указанной патологии среди взрослого населения достигает 10% [2—5].

Язвенная болезнь желудка (ЯБЖ) характерна для лиц от 55 до 70 лет [5]. Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и инфекция Helicobacter pylori (H. pylori) являются основными факторами, нарушающими устойчивость слизистой оболочки к повреждениям [6]. Наиболее агрессивными признаны штаммы H. pylori, имеющие гены цитотоксичности: cytotoxin-associated gene A (CagA) и vacuolating-associated cytotoxin A (VacA). Преодолевая слой надэпителиальной слизи с помощью фермента муциназа и движения жгутиков, H. pylori достигает эпителиоцитов слизистой оболочки желудка и вызывает их повреждение посредством развития воспалительной реакции с участием молекулы клеточной адгезии [6—9]. А в связи с тем, что наследственная предрасположенность — один из дополнительных этиологических факторов развития ЯБ [1, 10], генетические детерминанты указанных молекул представляют интерес для их изучения в качестве генов-кандидатов заболевания.

По результатам полногеномных исследований установлено более 20 полиморфных локусов, которые влияют на уровень молекул клеточной адгезии в крови, в том числе полиморфные варианты генов ABO (rs579459, rs8176719, rs651007, rs8176746, rs2519093, rs649129, rs507666, rs8176720) и SELP (rs6136) [11—20].

Непосредственно по изучению генетических факторов развития ЯБ проведено только два GWAS-исследования [21, 22], установивших важную роль 10 локусов 8 генов в развитии заболевания: PSCA (rs2294008, rs2976388), АВО (rs505922, rs687621), MUC6 (rs78459074), FUT2 (rs681343), CCKBR (rs10500661), MUC1 (rs147048677), GAST (rs34074411), CDX2 (rs9581957). Репликативные исследования проведены лишь для двух локусов из указанных SNPs (rs2294008, rs505922) [23—25], причем с ЯБЖ ассоциирован только полиморфный вариант rs2294008 [23], в описанных исследованиях участвовали японцы, испанцы и британцы. Ассоциативные исследования широкого спектра генов-кандидатов язвенной болезни также немногочисленны, а представленные в них результаты зачастую неоднозначные и противоречивые [26—37].

Указанные факторы диктуют необходимость проведения дальнейшего изучения GWAS-значимых для ЯБ однонуклеотидных замен в генетико-эпидемиологических исследованиях российских популяций, а также поиск других генов-кандидатов, вовлеченных в развитие заболевания. В связи с этим, исходя из роли молекул клеточной адгезии в патогенезе ЯБ, генетические детерминанты последних представляют интерес для изучения их роли в подверженности к заболеванию.

Цель исследования — изучить роль полиморфных вариантов генов-кандидатов (rs2294008 гена PSCA, rs6136 гена SELP, rs505922, rs8176720, rs2519093, rs507666 гена АВО, rs651007, rs579459, rs649129 гена ABO/RF00019) в развитии H. pylori-позитивной ЯБЖ.

Материал и методы

Выборка состояла из 98 больных H. pylori-позитивной ЯБЖ и 347 индивидуумов контрольной группы, прошедших клиническое, лабораторное и инструментальное обследование (эзофагогастродуоденоскопия с биопсией) в гастроэнтерологическом отделении ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» (Белгород). Обследование на наличие H. pylori-инфекции проведено с помощью иммуноферментного анализа крови и морфологического исследования биоптатов слизистой оболочки желудка. Все обследуемые лица принадлежат к русской национальности, являются коренными жителями Центрального Черноземья России и не состоят в родстве друг с другом. Обследованы 62 женщины и 36 мужчин с H. pylori-позитивной ЯБЖ, средний возраст составил 53 года. Контрольная группа состояла из 230 женщин и 117 мужчин, средний возраст которых — 48 лет. Каждым участником подписано информированное добровольное согласие на включение его в исследование.

Следует отметить, что 9 полиморфных локусов, отобранных для настоящего исследования, показали выраженный регуляторный потенциал согласно интернет-ресурсам HaploReg v4.1, GTEx Portal и PolyPhen-2. По данным полногеномных исследований, из них 2 полиморфных варианта ассоциированы с ЯБ (rs2294008, rs505922) [21], 7 локусов ассоциированы с уровнем молекул клеточной адгезии в сыворотке крови (rs6136, rs8176720, rs2519093, rs507666, rs651007, rs579459, rs649129) [11—20]. Генотипирование проведено методом полимеразной цепной реакции на термоциклере CFX-96 (Bio-Rad), использованы наборы реагентов, подготовленные ООО «ТестГен» (Россия). При популяционно-генетическом исследовании указанных SNPs определено соответствие эмпирического распределения генотипов теоретически ожидаемому (закон Харди—Вайнберга), частота минорного аллеля по каждому из изучаемых локусов была больше 5%.

Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов H. pylori-позитивной ЯБЖ проведен с помощью программного обеспечения gPLINK v2.050 (https://zzz.bwh.harvard.edu/plink) методом логистической регрессии в рамках аллельной, аддитивной, доминантной и рецессивной генетических моделей. Оценка характера ассоциаций осуществлялась с помощью отношения шансов (ОШ или OR — odds ratio), а также его 95%-го доверительного интервала (95% ДИ). Если ОШ >1, то однонуклеотидная замена определялась как рисковый фактор развития ЯБ, если ОШ <1, то как фактор пониженного риска развития заболевания. Проведен адаптивный пермутационный тест, результаты которого считались статистически значимыми при p_perm<0,05.

Результаты

При популяционно-генетическом исследовании полиморфных вариантов генов-кандидатов в группе больных H. pylori-позитивной ЯБЖ и среди индивидуумов контрольной группы выполняется равновесие Харди—Вайнберга (p>0,05). Частота минорных аллелей по всем изучаемым полиморфным вариантам была больше 5% (табл. 1).

Таблица 1. Распределение SNPs у больных H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка и индивидуумов контрольной группы

Примечание. * — количество гомозигот по минорному аллелю / гетерозигот / гомозигот по частому аллелю; H_o — наблюдаемая гетерозиготность; H_e — ожидаемая гетерозиготность; ЯБЖ — язвенная болезнь желудка.

Поиск ассоциаций аллелей изучаемых полиморфных локусов с развитием заболевания выявил, что фактором риска развития ЯБЖ, ассоциированной с инфекцией H. pylori, является аллель С гена SELP (rs6136) (ОШ=1,66; 95% ДИ 1,02—2,71; p=0,041; p_perm=0,042; N_perm=448) (табл. 2). При изучении ассоциаций с заболеванием выбранных полиморфных локусов в рамках трех генетических моделей с учетом ковариат значимые ассоциации не выявлены (табл. 3).

Таблица 2. Ассоциации аллелей полиморфных вариантов генов-кандидатов с H. pylori-позитивной язвенной болезнью желудка

Примечание. ОШ — отношение шансов, 95% ДИ — 95% доверительный интервал, p — уровень значимости. ЯБЖ — язвенная болезнь желудка. Жирным шрифтом выделены статистически значимые результаты.

Таблица 3. Ассоциации аллелей полиморфных вариантов генов-кандидатов с H. pylori-позитивной язвенной болезнью желудка (аддитивная, доминантная, рецессивная генетические модели)

Примечание. Результаты получены с учетом коррекции на ковариаты; MAF — минорный аллель; ОШ — отношение шансов; 95% ДИ — 95% доверительный интервал; L95 — нижняя граница 95% ДИ; U95 — верхняя граница 95% ДИ; p — уровень статистической значимости.

Обсуждение

Согласно полногеномным исследованиям, полиморфный локус rs6136 гена SELP связан с уровнем Р-селектина (p=1×10^–25, p=3×10^–105) [17, 18] и его растворенной формы (p=4,05×10^–61) [14], который участвует в развитии воспалительного процесса.

Полиморфизм rs6136 гена SELP локализован на длинном плече хромосомы 1 (1q24.2). По данным интернет-ресурса HaploReg v4.1, указанный SNP расположен в области гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы, а также в регионах гиперчувствительности к ДНКазе в одной ткани, в области связывания с регуляторными белками NFKB, EBF1, PAX5N19, приводит к замене одной аминокислоты на другую в кодируемой полипептидной цепи (миссенс-мутация). Предикторный потенциал указанной замены T756P (замена треонина на пролин в положении 756) оценен с помощью программного обеспечения PolyPhen-2 и обозначен как «POSSIBLY DAMAGING» (вероятно патогенный), score=0,758, чувствительность=0,85, специфичность=0,92.

Аллель A rs6136 связан со снижением экспрессии гена F5 в двух тканях (цельная кровь: p=7,7е^–7, NES= –0,19; слизистая оболочка пищевода: p=0,00019, NES= –0,28) и повышением альтернативного сплайсинга гена BLZF1 в пищеводе (p=0,0000066, NES=0,36, Intron ID:169368362:169369473:clu_52454) (GTEx Portal). Следовательно, рисковый в отношении развития H. pylori-позитивной ЯБЖ аллель C rs6136 ассоциирован с повышенной экспрессией гена F5 и снижением альтернативного сплайсинга гена BLZF1. Полиморфный локус rs6136 гена SELP имеет один сильно сцепленный (r²≥0,8) с ним генетический вариант (rs9332575 гена F5), аллель T которого также оказывает влияние на экспрессию гена F5 в двух тканях (цельная кровь: p=8,3е^–7, NES= –0,18; слизистая оболочка пищевода: p=0,00014, NES= –0,28) и альтернативный сплайсинга гена BLZF1 в пищеводе (p=0,000013, NES=0,34, Intron ID:169368362:169369473:clu_52454) (GTEx Portal).

Белковый продукт гена SELP (Р-селектин) относится к молекулам клеточной адгезии, находится в альфа-гранулах тромбоцитов и тельцах Вейбеля—Паладе эндотелиальных клеток, является кальций-зависимым рецептором миелоидных клеток, опосредует взаимодействие активированных эндотелиальных клеток или тромбоцитов с лейкоцитами, участвует в развитии воспаления [38, 39]. Исходя из того, что при ЯБ и наличии H. pylori наблюдается хронический воспалительный процесс, можно предположить, что данный селектин вносит значительный вклад в этиопатогенез H. pylori-позитивной ЯБЖ [8].

Ген F5 кодирует кофактор, играющий центральную роль в регуляции гемостаза. Совместно с активированным X фактором свертывания крови участвует в превращении протромбина в тромбин [38, 39]. По данным литературы, развитию язвенного дефекта способствует нарушение адекватного кровообращения слизистой оболочки желудка, последующее образование пристеночных тромбов в микрососудах и развитие ишемии [40]. Этим также можно объяснить повышенный риск развития H. pylori-позитивной ЯБЖ, так как аллель C rs6136 повышает экспрессию гена F5 в органах пищеварительной системы.

Продукт гена BLZF1 необходим для транспорта протеинов из эндоплазматической сети через аппарат Гольджи на поверхность клетки. [38, 39]. Возможно, при детерминации аллелем C rs6136 снижения альтернативного сплайсинга гена BLZF1 в органах пищеварительной системы уменьшается секреция факторов защиты слизистой оболочки желудка (гликопротеинов), что создает предпосылки к развитию заболевания.

Выводы

Аллель C гена SELP (rs6136) является генетическим фактором риска развития H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка (ОШ=1,66; 95% ДИ 1,02—2,71; p=0,041; p_perm=0,042; N_perm=448). Полиморфизм rs6136 имеет выраженный регуляторный потенциал, является несинонимичным, рисковый в отношении развития H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка аллель C rs6136 ассоциирован с повышенной экспрессией гена F5 и снижением альтернативного сплайсинга гена BLZF1.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Чурносов М.И.

Сбор и обработка материала — Рашина О.В.

Статистический анализ данных — Рашина О.В.

Написание текста — Рашина О.В., Чурносов М.И.

Редактирование — Рашина О.В., Чурносов М.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution:

Study design and concept — Churnosov M.I.

Data collection and processing — Rashina O.V.

Statistical analysis — Rashina O.V.

Text writing — Churnosov M.I., Rashina O.V.

Editing — Churnosov M.I., Rashina O.V.