Глиомы — опухоли, происходящие из астроцитарных и олигодендроглиальных клеток центральной нервной системы (ЦНС). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предлагает прогностическую градацию глиом (Grade I—IV) на основе их гистологических характеристик [1]. Более высокая степень анаплазии глиом связана с повышенной инвазивностью опухоли и более короткой выживаемостью пациентов [2—4]. К злокачественным глиальным новообразованиям ЦНС относят глиомы Grade III — анапластические астроцитомы, олигодендроглиомы и олигоастроцитомы. Самый злокачественный тип глиомы (Grade IV) — глиобластома. Глиомы считаются наиболее сложными для лечения опухолями из-за их молекулярной и клеточной гетерогенности. Злокачественные глиомы рецидивируют локально в 50—80% случаев [5]. Это также обусловлено особенностями роста глиальных опухолей. Все глиальные опухоли характеризует диффузно-узловой тип роста. Отсутствие капсулы вызывает сложность макроскопической идентификации границы новообразования при хирургических манипуляциях во время удаления опухоли. Кроме того, возможность тотального удаления новообразования определяется анатомической доступностью и физиологической дозволенностью. При нейрохирургии злокачественных глиальных новообразований не работают принципы общей онкологии. На первый план выходит обеспечение качества жизни пациента после нейрохирургической операции. Предпочтительным лечением злокачественных глиом является максимальная хирургическая циторедукция с сохранением прилегающих анатомических структур головного мозга под интраоперационным флуоресцентным и нейрофизиологическим контролем с последующей адъювантной терапией [6—8].

Много методов используется, чтобы отличить границу глиомы от нормального мозга, например, интраоперационная нейронавигация, ультрасонография или МРТ [4, 9, 10]. В последние годы методики нейронавигации на основе МРТ или интраоперационной МРТ в сочетании с интраоперационным картированием и функциональной МРТ позволили улучшить результаты резекции, но все еще имеют серьезные недостатки. В частности, края глиальных опухолей имеют нечеткие и размытые границы. Полученные данные с помощью T1-взвешенной МРТ с усилением гадолинием (для глиом высокой степени злокачественности) неоднозначны и не всегда соответствуют биологическим показателям, таким как степень анаплазии или плотность опухолевых клеток [4, 9, 11]. Кроме того, серьезным препятствием для резекций на основе нейронавигации является смещение мозга. В течение последних лет в хирургии глиом для распознавания границы опухоль/нормальный мозг все чаще применяют флуоресцентные вещества, в подавляющем большинстве случаев (более 90%) это производные 5АЛА [12—17]. Крайне мало публикаций относительно использования в хирургии глиом в качестве индуктора флуоресценции хлорина e6, и в литературе отсутствуют сведения касательно морфологического и иммуногистохимического исследования в сопоставлении с интенсивностью флуоресценции хлорина e6 в глиальной опухолевой ткани человека [10, 18—21].

Хлорин e6 относят к веществам, пассивно маркирующим опухолевую ткань в условиях повышенной проницаемости гематоэнцефалического барьера в зоне опухоли, что позволяет экзогенным веществам накапливаться и удерживаться в глиальной опухолевой ткани. Таким образом хлорин e6 проникает в цитоплазму клетки путем эндоцитоза и пассивной диффузии, накапливается в лизосомах, эндосомах и эндоплазматическом ретикулуме, аппарате Гольджи [18, 20].

Цель исследования — оценка эффективности флуоресцентной навигации с хлорином e6 в хирургии злокачественных глиом на основе патоморфологического анализа биоптатов, полученных во время операции.

Материал и методы

Работа проведена на базе РНХИ им. проф. А.Л. Поленова. В исследование включен операционный материал, полученный в ходе хирургического вмешательства по поводу глиальной опухоли высокой степени злокачественности с использованием флуоресцентной навигации с хлорином e6 2-го поколения (фотодитазин) от 30 пациентов, средний возраст которых составил 59 лет (32—72 года).

Клиническая и гистологическая характеристика пациентов представлена в таблице.

Клиническая и гистологическая характеристика пациентов

Пол	Вид опухоли	Локализация, доля	Гистология, ВОЗ 2016	Индекс Ki-67
М	Первичная	Височная	АА	7
Ж	»	Теменная	АА	7
М	»	Лобная	АА	5
Ж	»	Височная	АА	9
Ж	»	Теменная	АА	7
М	»	»	АА	9
М	»	Височная	АА	10
Ж	Рецидив	Лобная	АА	5
М	»	Теменная	АА	8
Ж	»	Височная	АА	6
Ж	Первичная	Теменная	АОА	8
Ж	»	Височная	АОА	7
М	»	Теменная	АОА	9
Ж	Рецидив	Лобная	АОД	8
М	Первичная	Височная	АОД	6
Ж	»	Теменная	ГБ	22
М	»	Лобная	ГБ	19
Ж	»	Височная	ГБ	33
М	»	Теменная	ГБ	31
Ж	»	Височная	ГБ	26
Ж	»	Лобная	ГБ	29
М	»	Теменная	ГБ	33
М	»	Височная	ГБ	41
М	»	Лобная	ГБ	32
М	»	Затылочная	ГБ	18
М	Рецидив	Височная	ГБ	30
Ж	»	Лобная	ГБ	37
М	»	Теменная	ГБ	44
Ж	»	Височная	ГБ	32
М	Первичная	»	ГС	40

Примечание. АА — анапластическая астроцитома, АОА — анапластическая олигоастроцитома, АОД — анапластическая олигодендроглиома, ГБ — глиобластома, ГС — глиосаркома.

Интраоперационную флуоресцентную навигацию с препаратом хлорин e6 проводили с использованием операционного микроскопа (LEICA OHS—1) с установкой D-Light AF System «Karl Storz» (Германия) и флуоресцентной приставки отечественного производства ЛОМО (Санкт-Петербург) (разработка Г.В. Папаяна).

При помощи программного обеспечения RSS Cam — Endo 1.4.313 оценивали интенсивность флуоресценции в выбранном месте объекта, а также осуществляли фото- и видеорегистрацию изображения в свете флуоресценции. Это позволяло с высоким цветовым контрастом определить ткань новообразования, накопившую хлорин e6, относительно ткани, в которую препарат не проник.

Эффективность флуоресценции оценивали по результатам сопоставления данных визуальной оценки и морфологического исследования флуоресцирующей и не флуоресцирующей тканей. Для визуальной оценки интенсивности флуоресцентного эффекта использовали 4-балльную шкалу: 0 — отсутствие видимой флуоресценции, 1 — слабое розовое свечение, 2 — красное свечение, 3 — ярко-красное свечение.

Ткань, накопившую фотосенсибилизатор, поэтапно удаляли под флуоресцентным контролем с учетом физиологической дозволенности.

Во время операции производили забор биопсийного материала из участков опухолевой ткани, имеющих разную степень интенсивности флуоресценции. У каждого пациента взяты участки в виде биопсийного материала с позитивной и негативной флуоресценцией, часть из них отобрана в перифокальной зоне, всего более 250 биоптатов.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного материала проводили в соответствии со стандартным протоколом. У всех пациентов диагноз глиальной опухоли подтвержден гистологическим исследованием интраоперационного материала в соответствии с классификацией опухолей ЦНС ВОЗ (2016). Послеоперационное гистологическое исследование подтвердило, что среди пациентов с глиомой у 15 установлен параметр Grade III, у 15 — Grade IV.

Операционный материал фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали стандартным способом и заливали в парафин. Изготавливали срезы толщиной 3—5 мкм (микротом Leica SM 2000R), окрашивали гематоксилином и эозином. Для визуализации и выполнения микрофотографий использовали лабораторный микроскоп Leica 4000B и Leica DM 2500, оснащенный цифровой камерой и адаптированной программой Adobe Photoshop CS 3.

Для выполнения иммуногистохимических реакций из парафиновых блоков с фиксированными в них образцами опухолей изготавливали срезы толщиной 3—5 мкм. Применяли стандартный протокол иммуногистохимического исследования с демаскировкой антигена на водяной бане (GFL, 1002) и с использованием первичных антител фирмы «Dako» (Ki-67, Clone Mib-1, кат.номер M7240; p53, Clone DO-7, кат.номер M7001; VEGF, Clone VC1, кат.номер M7273), а также системы визуализации фирмы «Diagnostic BioSystems» (UMR1000PD-BMS).

Индекс пролиферации Ki-67 определяли по процентному отношению клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток.

Для иммуногистохимического исследования p53 использовали моноклональные антитела DO-7, выявляющие как wtp53, так и mtp53. Считается, что иммуногистохимическая реакция зависит, главным образом, от наличия в ткани mtp53, так как wtp53 — короткоживущий протеин, его период полураспада не превышает 20 мин, а содержание может быть ниже чувствительности иммуногистохимического метода. Период полураспада mtp53 длится до 24 ч, и он успевает накопиться в ткани в количестве, достаточном для визуализации. Для количественной оценки пролиферативной активности, а также экспрессии белка p53 проводили подсчет соотношения окрашенных ядер на 300 клеток при увеличении в 400 раз. Условно была принята следующая градация: отсутствие экспрессии (0 баллов), слабая экспрессия (1 балл) — окрашены менее 10% ядер клеток, умеренная экспрессия (2 балла) — более 10%, но менее 33%, сильная экспрессия (3 балла) — более 33% ядер клеток в ткани были положительными.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием Statistica 10.0, Windows 10 (США), которые дополнительно применяли для построения графиков, представленных в статье. На графиках экспрессии генов верхние и нижние линии обозначают соответственно доверительный интервал, а точка между линиями — среднее значение для соответствующей группы. Количественные данные представлены со стандартным отклонением. U-критерий Манна—Уитни был проведен для сравнения средних значений групп выборки. Для проверки равновесия Харди—Вайнберга использовали критерий χ². Тест Спирмена был выполнен для измерения корреляции, которая считается сильной, если коэффициент корреляции r выше 0,75 или ниже –0,75. Измерения считали статистически значимыми, когда значение вероятности p<0,05.

Результаты

По данным гистологических исследований позитивная флуоресценция с хлорином e6 имела прямую корреляционную зависимость от степени злокачественности опухоли (количества митозов, степени ядерного полиморфизма, выраженности сосудистой пролиферации и значений индекса Ki-67 и белка p53, экспрессии VEGF).

Экспрессия Ki-67 и интенсивность флуоресценции

Для определения степени злокачественности опухоли (Grade) в большинстве нейроэпителиальных опухолей незаменимым является количественное определение ядерной экспрессии Ki-67. По данным ВОЗ (2016), эти параметры выглядят следующим образом: G I — 1—3%, G II — 4—5%, G III — 5—10% и G IV — в среднем 15—20% и выше.

Сравнительный анализ зон флуоресценции опухоли с результатами морфологических исследований показал прямую корреляционную зависимость между интенсивностью флуоресценции хлорина e6 и степенью злокачественности участка опухоли, маркером ядерной экспрессии Ki-67, (p>0,05). Чем выше интенсивность флуоресценции хлорина e6, тем выше уровень Ki-67. При этом зона некроза опухоли характеризовалась низким уровнем интенсивности флуоресценции и низкими значениями Ki-67. Максимальное значение индекса Ki-67 отмечалось в компактной части опухоли. Корреляционный анализ показал сильную прямую связь между экспрессией Ki-67 и интенсивностью флуоресценции хлорина e6 (рис. 1) (r_s=0,697; p=0,002).

Рис. 1. Экспрессия Ki-67 в зависимости от флуоресценции.

Экспрессия p53 и интенсивность флуоресценции

Ген TP53 человека расположен на коротком плече хромосомы 17 и в норме кодирует белок-супрессор опухоли p53 (дикий тип, wt). Мутации TP53 — наиболее частые генетические изменения в опухолевых клетках, приводящие к образованию мутантного белка p53 (mt) с полным или частичным нарушением его функции и инактивацией онкосупрессорных свойств. Определение уровня экспрессии mtp53 является важным прогностическим маркером опухолей. Транскрипционный фактор клеточного цикла белок p53 в тканях — основной супрессор опухоли, который активируется в ответ на стресс, чтобы предотвратить распространение поврежденных клеток и поддерживать стабильность генома, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз в поврежденных клетках. В зоне компактной части опухоли отмечалась сильная экспрессия белка p53, как и высокая интенсивность флуоресценции. Отсутствие экспрессии или слабая экспрессия наблюдались в зоне некроза опухоли, как и отсутствие флуоресценции хлорина e6. Умеренная экспрессия и красное свечение (++) выявлялись в зоне клеточной инфильтрации и в участках перифокальной зоны с повышенной опухолевой клеточностью [22, 23].

Корреляционный анализ выявил прямую связь между экспрессией p53 и интенсивностью флуоресценции участков опухолевой ткани (рис. 2) (r_s=0,725; p=0,001).

Рис. 2. Экспрессия p53 в зависимости от флуоресценции.

Экспрессия VEGF и интенсивность флюоресценции

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) вносит основной вклад в рост злокачественных опухолей ЦНС. Он стимулирует ангиогенез опухоли и пролиферацию сосудов, особенно характерную для глиом высокой степени злокачественности. Фактор роста эндотелия сосудов имеет высокий уровень экспрессии в клетках глиомы, и его экспрессия непосредственно связана со степенью злокачественности и с прогнозом глиом. Повышенная экспрессия VEGF является одним из факторов, ответственных за инвазивность глиомы. В области компактной части опухоли выявлена прямая корреляционная связь между интенсивностью флуоресценции участка опухолевой ткани и уровнем экспрессии VEGF, чем выше интенсивность флуоресценции, тем более выражена экспрессия VEGF. В перифокальной зоне экспрессия VEGF также коррелировала с интенсивностью флуоресценции и концентрировалась в основном в участках с высокой плотностью опухолевых клеток, VEGF также часто экспрессировался в клетках, прилегающих к некрозу, где был высокий уровень интенсивности флуоресценции. Зоне некроза соответствовало отсутствие не только флуоресценции, но и практически полное отсутствие экспрессии VEGF. Проводимый корреляционный анализ продемонстрировал наличие статистически значимой прямой связи между выраженностью экспрессии VEGF и интенсивностью флуоресценции (рис. 3) (r_s=0,783; p=0,001).

Рис. 3. Экспрессия VEGF в зависимости от флуоресценции.

Таким образом, было исследовано около 250 биопсий, полученных во время операции. Зоне компактной части опухоли соответствовала высокая интенсивность флуоресценции (ярко-красное свечение) (+++) — 85%, умеренная флуоресценция (красное) (++) — 10%, слабая флуоресценция (слабо-розовое) (+) — 5%, очень высокий индекс Ki-67, p53, а также высокий уровень экспрессии VEGF. В зоне клеточной инфильтрации отмечались высокая интенсивность флуоресценции (+++) в 70% случаев, умеренная флуоресценция (++) в 20%, слабая флуоресценция (+) в 5% и отсутствие флуоресценции (–) в 5% случаев, высокий индекс Ki-67, p53 и также высокий уровень экспрессии VEGF. Зона некроза опухоли характеризовалась отсутствием флуоресценции (95%) или очень слабой флуоресценцией (+) — 5%, низким индексом Ki-67, низким уровнем экспрессии белка p53 и VEGF (рис. 4).

Рис. 4. Анализ интенсивности флуоресценции различных зон опухоли в сравнении с патоморфологическим исследованием.

Случаи, когда флуоресценция отсутствовала или была слабой, наблюдались при рецидивирующих глиомах в зоне рубцово-глиозных изменений после курсов проводимой лучевой и химиотерапии.

Исследование перифокальной зоны опухоли продемонстрировало прямую корреляционную связь между интенсивностью флуоресценции участка ткани и степенью анаплазии, индексом Ki-67, уровнем экспрессии белка p53 и VEGF (p=000,1) (рис. 5).

Рис. 5. Анализ интенсивности флуоресценции в перифокальной зоне в сравнении с патоморфологическим исследованием.

В исследовании был 1 пациент с верифицированным диагнозом глиосаркомы. Анализ интенсивности флуоресценции различных участков опухоли у данного пациента также выявил прямую корреляционную связь со степенью анаплазии участка опухолевой ткани и индексом Ki-67, экспрессией белка p53 и гена VEGF. Установлено, чем выше интенсивность флуоресценции участка опухолевой ткани, тем выше степень анаплазии и более высокий индекс Ki-67, экспрессия p53 и VEGF (рис. 6).

Рис. 6. Анализ интенсивности флуоресценции различных участков глиосаркомы в сравнении с патоморфологическим исследованием.

В целом большинство глиом имеет неоднородный характер флуоресценции опухолевой ткани, и лишь в единичных случаях выявляется гомогенное свечение. Для глиобластом и анапластических астроцитом была более характерна зависимость интенсивности флуоресценции от зоны участка опухоли (зоны некроза, клеточной инфильтрации, компактной части опухоли). Опухоли с более развитым сосудистым компонентом — это в большей степени анапластические олигодендроглиомы и глиобластомы — демонстрировали высокий уровень флуоресценции. Глиомы, ранее подверженные лучевой и химиотерапии, имели меньшую интенсивность флуоресценции в основном за счет рубцово-глиозных участков в структуре опухолевой ткани. Однако исследование множества биоптатов все же показало, что основная корреляционная связь между интенсивностью и позитивностью флуоресценции имелась с маркерами степени анаплазии (Ki-67, p53) участка опухолевой ткани и развитостью сосудистого русла.

Обсуждение

Исследования последних лет демонстрируют, что тотальность резекции глиомы напрямую коррелирует с медианой выживаемости и величиной безрецидивного интервала [4, 9, 14, 24, 25].

Схема, предложенная C. Wilson [26], определяющая инфильтрацию опухолевых клеток при глиальных опухолях, показывает, что тотальная резекция злокачественных астроцитом мало достижима при хирургическом вмешательстве. Использование интраоперационной флуоресцентной навигации позволяет увеличить радикальность операции путем резекции окружающей ткани, инфильтрированной опухолевыми клетками [4, 9, 10, 18].

Хлорины не часто используются в качестве индукторов флуоресценции в хирургии глиом. Из-за пассивного характера их доставки существует значительная неопределенность в отношении степени, в которой эти контрастные вещества могут коррелировать с гистопатологическим диагнозом, анаплазией опухоли и плотностью опухолевых клеток [19—21].

В этой статье сообщается, что интраоперационная флуоресцентная навигация с использованием хлорина e6 в хирургии злокачественных глиом позволяет идентифицировать ткань, инфильтрированную опухолевыми клетками, на основе различий в интенсивности флуоресценции. В частности, показана положительная корреляция между гистологической степенью злокачественности и позитивной флуоресценцией, а также степенью ее интенсивности. Так, сильная флуоресценция наблюдалась в 95% вновь диагностированных случаев и 65% при рецидиве глиальной опухоли, отсутствие флуоресценции — лишь у 1 пациента. При рецидиве глиом интенсивность флуоресценции, как правило, была слабее, чем наблюдаемая во вновь диагностированных случаях. Причина этого может быть связана с использованием в этих случаях лучевой и химиотерапии.

В мировой литературе сообщений относительно применения в хирургии глиом в качестве индуктора флуоресценции хлорина e6 крайне мало.

Так, H. Matsumura и соавт. [20] одними из первых показали, что основным принципом избирательности хлоринов по отношению к глиальным опухолям считается не метаболизм, а скорее их сродство к альбумину и возможная связь с переносчиками, такими как ABCG2, что приводит к их накоплению в лизосомах. Также показано, что использование в качестве фотосенсибилизаторов хлоринов позволяет оценить плотность опухолевых клеток в ткани злокачественной глиомы по различию в интенсивности флуоресценции.

В исследовании J. Akimoto и соавт. [18] по изучению интраоперационной фотодиагностики злокачественных глиом с использованием фотосенсибилизатора хлорина e6 (талапорфина натрия) было выявлено, что интенсивность флуоресценции у всех пациентов с глиомами Grade II слабая и почти у всех с Grade III—IV — сильная, что соответствовало гистологической картине. Так, средняя концентрация хлорина e6 в тканях составляла 1,62 мкг/г в областях с сильной флуоресценцией, 0,67 мкг/г для областей со слабой флуоресценцией и 0,19 мкг/г в областях без флуоресценции.

T. Tsurubuchi и соавт. [21] исследовали внутримозговое распределение 5 АЛА и хлорина e6 (талапорфина натрия), используя модель глиомы у крысы, и сообщили, что интенсивность флуоресценции примерно в 10 раз сильнее с хлорином e6, чем с 5 АЛА. С другой стороны, оба препарата вызывали флуоресценцию при вазогенном отеке на модели холодовой травмы при отеке мозга.

Заключение

Приведенные результаты морфологического исследования участков опухолевой ткани с разной интенсивностью флуоресценции отражают ее зависимость от гистологической степени злокачественности опухоли. Это позволяет предположить, что интенсивность флуоресценции хлорина e6, как показано в нашем исследовании, отражает плотность опухолевых клеток, пролиферативную способность или объем сосудистого русла. Таким образом, можно заключить, что полученные данные свидетельствуют об эффективности флуоресцентной навигации с использованием хлорина e6 при операциях по поводу злокачественных глиом.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Ю. Рында, В.Е. Олюшин, Д.М. Ростовцев

Сбор и обработка материала — А.Ю. Рында, Ю.М. Забродская, Д.М. Ростовцев, Г.В. Папаян

Статистическая обработка — А.Ю. Рында, Ю.М. Забродская, Г.В. Папаян

Написание текста — А.Ю. Рында, В.Е. Олюшин

Редактирование — В.Е. Олюшин, Ю.М. Забродская

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.